Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Предлагаемый протокол предполагает глобальный подход к оценке костеобразования в контексте регенерации костной ткани с использованием мультимодальных анализов. Он направлен на предоставление качественной и количественной информации о формировании новой кости, повышение строгости и достоверности основных и доклинических исследований.

Аннотация

Обширная характеристика минерализации тканей в контексте регенерации кости представляет собой серьезную проблему, учитывая многочисленные модальности, которые в настоящее время доступны для анализа. В данной работе мы предлагаем рабочий процесс для всесторонней оценки образования новой кости с использованием соответствующего костного экспланта ex vivo крупного животного. В эксцентрированной головке бедренной кости овцы создают костный дефект (диаметр = 3,75 мм; глубина = 5,0 мм) и вводят макропористый костный заменитель, загруженный проостеогенным фактором роста (костный морфогенетический белок 2 - BMP2). Впоследствии эксплант сохраняется в культуре в течение 28-дневного периода, что позволяет провести клеточную колонизацию и последующее формирование костной ткани. Для оценки качества и структуры вновь минерализованной ткани используются следующие последовательные методы: (i) Характеристика и 3D-изображения всего экспланта с высоким разрешением с использованием микрокомпьютерной томографии с последующим анализом изображений с глубоким обучением для усиления дискриминации минерализованных тканей; ii) наноиндентирование для определения механических свойств вновь образованной ткани; (iii) Гистологические исследования, такие как гематоксилин/эозин/шафран (HES), трихром Гольднера и пентахром Мовата, для качественной оценки минерализованной ткани, в частности, в отношении визуализации остеоидного барьера и наличия костных клеток; (iv) картирование методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с методом обратного рассеяния с внутренней привязкой для количественной оценки степени минерализации и получения подробного представления о морфологии поверхности, минеральном составе и границе раздела кости и биоматериала; (v) Спектроскопия комбинационного рассеяния света для определения молекулярного состава минерализованной матрицы и получения представления о стойкости BMP2 в цементе путем обнаружения пептидных связей. Этот мультимодальный анализ обеспечит эффективную оценку вновь образованной кости и всестороннее качественное и количественное понимание минерализованных тканей. Благодаря стандартизации этих протоколов мы стремимся облегчить межисследовательские сравнения и повысить достоверность и надежность результатов исследований.

Введение

Костные дефекты, вызванные травмой, резекцией опухоли, врожденными аномалиями или инфекцией, представляют собой серьезную проблему для регенеративной медицины. Эти изменения нарушают структурную целостность костной системы, что приводит к дискомфорту, функциональным нарушениям и снижению качества жизни пациентов.

Для преодоления этих проблем были разработаны инновационные стратегии восстановления костной ткани, направленные на усиление остеогенеза и регенерацию костной ткани. Эти подходы включают использование имплантируемых, инъекционных или напечатанных на 3D-принтере заменителей кости, которые могут имет....

протокол

Это исследование было одобрено комитетом по этике и благополучию животных и Национальным управлением ветеринарии и продовольствия Франции под номером G44171.

1. Подготовка и культивирование остеохондральных эксплантов

  1. Соберите образцы овечьих суставов у только что усыпленных животных в асептической среде. Расположите овцу в положении лежа на спине и оббрейте левую заднюю конечность. Подготовьте путем дезинфекции спиртом вокруг коленного сустава. Используйте латеральную парапателлярную артротомию для обнажения передней и задней крестообразных связок с последующим вывихом надколенни....

Результаты

Микрокомпьютерная томография экспланта показана на рисунке 2. Использование ручной сегментации не может оптимально отделить кость от цемента, присутствующего в центральном канале, с помощью глобального порога. Чтобы улучшить распознавание трабекул?.......

Обсуждение

Восстановление костных дефектов является основной задачей в регенеративной медицине для восстановления подвижности, уменьшения боли и улучшения качества жизни пострадавших людей. Использование эксплантных моделей дает ряд преимуществ по сравнению с исследования?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить технические средства, участвующие в сборе и обработке образцов, в том числе SC3M (SFR Francois Bonamy (UMS 016), University of Nantes), SFR ICAT (University of Angers), BIO3, HiMolA и SC4BIO. Inserm UMR_S 1229 RMeS поддерживается грантами правительства Франции через учреждения Inserm, Nantes Université, Univ Angers и Oniris VetAgroBio. CL также благодарна компании HTL Biotechnology.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.20 filtersVWR 28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)Sterican4665120
3 mL syringeHENKE-JECT8300005762
37% hydrochloric acid VWR 1.00317.1000 
Acetic acid (glacial) Sigma A6283 
Acetone VWR 20063-365 
Alcian Blue 8GXVWR 361186
Ammonium hydroxideVWR 318612
Apatitic tricalcium phosphate Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)TV26U 
AzophloxineSigma 210633
Benzoyl peroxideSigma 8.01641.0250
BMP2Medtronic InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein Aldrich 2107507
CTVox Bruker-
DataViewer Skyscan-
Diamond bladeStruersMOD13
Diamond sawStruersAccutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solutionStruers40600379
DiaPro Nap B1 diamond solutionStruers40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)Sigma 102404598
Dibutyl PhtalateChimie-Plus Laboratoires28656
DragonFly software ORS2022.1.0.1231. 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvateThermoFisher Scientific31966-021
Eosine Y- Surgipath Sigma 1002830105
Erythrosin BSigma 102141057
Ethanol absoluteVWR 20820362
Eukitt Dutscher6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O) Merck 1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS) EurobioCVFSVF00
Fuchsine acidMerck 1.05231.0025 
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)BioseraMS01NG100J
HematoxylinSigma 86.118.9 
Isostatic pressNova SuissePmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry MalvernMastersizer 3000
Light greenProlabo 28947135
Lithium carbonateSigma A13149 
MD-Mol polishing clothStruers40500077
MethylcyclohexaneVWR 8.06147.1000 
Methylcyclohexane VWR 8.06147.1000 
Methylcyclohexane VWR 8.06147.1000 
MethylmethacrylateSigma 8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner BrukerSkyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)Sigma 71496
MortarFritsch Pulverisette 6
N,N, DimethylanilinSigma 803060
Nanoindentation stationAnton PaarNHT2
ND-Nap polishing clothStruers40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mmArthrexAR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mmArthrexAR-1981-08S
Orange GRalM15
Paraformaldehyde (PFA)Sigma P6148
Peel-a-way disposable embbedding mouldsPolysciences, Inc18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)ThermoFisher Scientific15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Phosphomolybdic acid Sigma 221856-100 g
Phosphotungstic acidAldrich 12863-5 
Polishing machineSturersDap V
PoupinelMEMMERTTV26U 
Raman microspectrometerRenishawInVia Qontor
Safran du Gâtinais Labonord 11507737
Scanning electron microscopeCarl ZeissEvo LS 10
SEMZeissCarl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papersStruers40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paintElectron microscopy sciences12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standardsMicro-Analysis Consultants Ltd8602
T25 flaskCorning430639
XyleneVWR 28975.325
Xylidine PonceauAldrich 19.976-1 

Ссылки

  1. Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications. Biomed Eng Adv. 6, 100107 (2023).
  2. Tsuji, K., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены