Комплексная характеристика минерализации тканей в модели ex vivo

Резюме

Предлагаемый протокол предполагает глобальный подход к оценке костеобразования в контексте регенерации костной ткани с использованием мультимодальных анализов. Он направлен на предоставление качественной и количественной информации о формировании новой кости, повышение строгости и достоверности основных и доклинических исследований.

Аннотация

Обширная характеристика минерализации тканей в контексте регенерации кости представляет собой серьезную проблему, учитывая многочисленные модальности, которые в настоящее время доступны для анализа. В данной работе мы предлагаем рабочий процесс для всесторонней оценки образования новой кости с использованием соответствующего костного экспланта ex vivo крупного животного. В эксцентрированной головке бедренной кости овцы создают костный дефект (диаметр = 3,75 мм; глубина = 5,0 мм) и вводят макропористый костный заменитель, загруженный проостеогенным фактором роста (костный морфогенетический белок 2 - BMP2). Впоследствии эксплант сохраняется в культуре в течение 28-дневного периода, что позволяет провести клеточную колонизацию и последующее формирование костной ткани. Для оценки качества и структуры вновь минерализованной ткани используются следующие последовательные методы: (i) Характеристика и 3D-изображения всего экспланта с высоким разрешением с использованием микрокомпьютерной томографии с последующим анализом изображений с глубоким обучением для усиления дискриминации минерализованных тканей; ii) наноиндентирование для определения механических свойств вновь образованной ткани; (iii) Гистологические исследования, такие как гематоксилин/эозин/шафран (HES), трихром Гольднера и пентахром Мовата, для качественной оценки минерализованной ткани, в частности, в отношении визуализации остеоидного барьера и наличия костных клеток; (iv) картирование методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с методом обратного рассеяния с внутренней привязкой для количественной оценки степени минерализации и получения подробного представления о морфологии поверхности, минеральном составе и границе раздела кости и биоматериала; (v) Спектроскопия комбинационного рассеяния света для определения молекулярного состава минерализованной матрицы и получения представления о стойкости BMP2 в цементе путем обнаружения пептидных связей. Этот мультимодальный анализ обеспечит эффективную оценку вновь образованной кости и всестороннее качественное и количественное понимание минерализованных тканей. Благодаря стандартизации этих протоколов мы стремимся облегчить межисследовательские сравнения и повысить достоверность и надежность результатов исследований.

Введение

Костные дефекты, вызванные травмой, резекцией опухоли, врожденными аномалиями или инфекцией, представляют собой серьезную проблему для регенеративной медицины. Эти изменения нарушают структурную целостность костной системы, что приводит к дискомфорту, функциональным нарушениям и снижению качества жизни пациентов.

Для преодоления этих проблем были разработаны инновационные стратегии восстановления костной ткани, направленные на усиление остеогенеза и регенерацию костной ткани. Эти подходы включают использование имплантируемых, инъекционных или напечатанных на 3D-принтере заменителей кости, которые могут имет....

протокол

Это исследование было одобрено комитетом по этике и благополучию животных и Национальным управлением ветеринарии и продовольствия Франции под номером G44171.

1. Подготовка и культивирование остеохондральных эксплантов

1. Соберите образцы овечьих суставов у только что усыпленных животных в асептической среде. Расположите овцу в положении лежа на спине и оббрейте левую заднюю конечность. Подготовьте путем дезинфекции спиртом вокруг коленного сустава. Используйте латеральную парапателлярную артротомию для обнажения передней и задней крестообразных связок с последующим вывихом надколенни....

Результаты

Микрокомпьютерная томография экспланта показана на рисунке 2. Использование ручной сегментации не может оптимально отделить кость от цемента, присутствующего в центральном канале, с помощью глобального порога. Чтобы улучшить распознавание трабекул?.......

Обсуждение

Восстановление костных дефектов является основной задачей в регенеративной медицине для восстановления подвижности, уменьшения боли и улучшения качества жизни пострадавших людей. Использование эксплантных моделей дает ряд преимуществ по сравнению с исследования?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.20 filters	VWR	28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)	Sterican	4665120
3 mL syringe	HENKE-JECT	8300005762
37% hydrochloric acid	VWR	1.00317.1000
Acetic acid (glacial)	Sigma	A6283
Acetone	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR	361186
Ammonium hydroxide	VWR	318612
Apatitic tricalcium phosphate	Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)	TV26U
Azophloxine	Sigma	210633
Benzoyl peroxide	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker	-
DataViewer	Skyscan	-
Diamond blade	Struers	MOD13
Diamond saw	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution	Struers	40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)	Sigma	102404598
Dibutyl Phtalate	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly software	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma	1002830105
Erythrosin B	Sigma	102141057
Ethanol absolute	VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Fuchsine acid	Merck	1.05231.0025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
Isostatic press	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry	Malvern	Mastersizer 3000
Light green	Prolabo	28947135
Lithium carbonate	Sigma	A13149
MD-Mol polishing cloth	Struers	40500077
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylmethacrylate	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner	Bruker	Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortar	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Nanoindentation station	Anton Paar	NHT2
ND-Nap polishing cloth	Struers	40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid	Sigma	221856-100 g
Phosphotungstic acid	Aldrich	12863-5
Polishing machine	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Raman microspectrometer	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâtinais	Labonord	11507737
Scanning electron microscope	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint	Electron microscopy sciences	12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 flask	Corning	430639
Xylene	VWR	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1