Ex vivo 모델에서 조직 광물화의 포괄적인 특성 분석

요약

제안된 프로토콜은 다중 모드 분석을 사용하여 뼈 재생의 맥락에서 뼈 형성을 평가하기 위한 글로벌 접근 방식을 수반합니다. 새로운 뼈 형성에 대한 정성적 및 정량적 정보를 제공하여 기초 및 전임상 조사의 엄격성과 타당성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

초록

뼈 재생의 맥락에서 조직 무기질화의 광범위한 특성 분석은 현재 분석에 사용할 수 있는 수많은 양식을 고려할 때 중요한 도전입니다. 여기에서는 관련 대형 동물 골 ex vivo explant를 사용하여 새로운 뼈 형성을 종합적으로 평가하기 위한 워크플로우를 제안합니다. 뼈 결손(직경 = 3.75mm, 깊이 = 5.0mm)은 이식된 양의 대퇴골두에서 생성되고 골형성 촉진 성장 인자(뼈 형태 형성 단백질 2 - BMP2)가 로드된 거대다공성 골 대체품이 주입됩니다. 그 후, 외식물은 28일 동안 배양된 상태로 유지되어 세포 집락화와 후속 뼈 형성을 가능하게 합니다. 새로 광물화된 조직의 품질과 구조를 평가하기 위해 다음과 같은 연속적인 방법을 설정합니다: (i) micro-CT를 사용하여 전체 explant의 특성화 및 고해상도 3D 이미지, 광물화된 조직의 식별을 강화하기 위한 딥 러닝 이미지 분석; (ii) 새로 형성된 조직의 기계적 특성을 결정하기 위한 나노 압흔; (iii) Hematoxylin/Eosin/Saffron (HES), Goldner의 삼색화 및 Movat의 펜타크롬과 같은 조직학적 검사는 특히 파골장벽의 시각화 및 뼈 세포의 존재와 관련하여 광물화된 조직의 정성적 평가를 제공합니다. (iv) 광물화 정도를 정량화하고 표면 형태, 광물 조성 및 뼈-생체 재료 계면에 대한 자세한 통찰력을 제공하기 위해 내부 참조를 사용한 후방 산란 주사 전자 현미경(SEM) 매핑; (v) 광물화된 매트릭스의 분자 조성을 특성화하고 펩타이드 결합 검출을 통해 시멘트 내 BMP2의 지속성에 대한 통찰력을 제공하기 위한 라만 분광법. 이 다중 모드 분석은 새로 형성된 뼈에 대한 효과적인 평가와 광물화된 조직에 대한 포괄적인 정성적 및 정량적 통찰력을 제공합니다. 이러한 프로토콜의 표준화를 통해 우리는 연구 간 비교를 촉진하고 연구 결과의 타당성과 신뢰성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

서문

외상, 종양 절제, 선천성 기형 또는 감염으로 인한 뼈 결손은 재생 의학에 큰 도전 과제입니다. 이러한 변화는 골격계의 구조적 무결성을 손상시켜 불편함, 기능 장애 및 환자의 삶의 질 저하로 이어집니다.

이러한 문제를 극복하기 위해 골형성 및 뼈 조직 재생을 향상시키는 데 중점을 둔 혁신적인 뼈 복구 전략이 등장했습니다. 이러한 접근법에는 자연 유래(예: 바이오 원료 거대분자, 동물 유래 하이드록시아파타이트) 또는 합성(예: 바이오 안경, 인산칼^슘)일 수 있는 이식형, 주사형 또는 3D 프린팅 가능한 뼈 대체품의 사용이 포함됩니다1. 뼈 재생을 유도하고 자극하는 낮은 선천적 능력을 향상시키기 위해 뼈 대체물에는 뼈 형태 형성 단백질(BMP)과 같은 골유도 인자를 로드하여 전구 세포의 골형성 분화를 촉진하고 뼈 형성을 향상시킬 수 있습니다².

뼈 형성은 콜라겐 매트릭스의 초기 형성을 기반으로 하며, 이 매트릭스는 하이드록시아파타이트 결정에 의해 광물화되어 뼈 구조를 강화합니다³. 이 과정은 뼈에 특정한 강성과....

프로토콜

이 연구는 윤리 및 동물 복지 위원회와 프랑스 국립 수의학 식품국(National Veterinary and Food Administration)의 번호 G44171에 의해 승인되었습니다.

1. 골연골 외식의 준비 및 배양

1. 무균 환경에서 갓 안락사된 동물로부터 양 관절 표본을 채취합니다. 양을 누운 자세로 놓고 왼쪽 뒷다리를 면도합니다. 무릎 관절 주위를 알코올로 소독하여 준비합니다. 외측 슬개골 관절 절개술을 사용하여 전방 및 후방 십자인대를 노출시킨 다음 슬개골 탈구를 사용하여 대퇴 트로클레를 드러냅니다.
   1. 조직 채취 후 골연골 자가이식편 전달 시스템을 사용하여 외측 과두에 4.75mm 직경의 결손을 생성합니다.
2. 정형외과 해머를 사용하여 10mm 깊이의 결함을 만들고 과두에서 외과를 회수합니다. 그 후, 골연골 자가이식 전달 시스템을 사용하여 첫 번째 결함을 중심으로 직경 8mm의 두 번째 결함을 수행합니다. 이를 통해 4.75mm x 10.0mm의 중심 결함을 포함하는 8mm x 10mm 크기의 골연골 외식이 생성됩니다.
3. 물류상의 이유로 필요한 경우, 1% 페니실....

결과

식식물의 micro-CT 이미지는 그림 2에 나와 있습니다. 수동 분할을 사용하면 전역 임계값을 사용하여 중앙 운하에 존재하는 시멘트에서 뼈를 최적으로 분리할 수 없습니다. 섬유주 뼈와 시멘트에 대한 인식을 개선하기 위해 딥 러닝을 사용할 것을 제안합니다. 딥 러닝은 생체 재료 특성을 인식하는 데 강력하며 뼈와 시멘트 사이의 분리를 개선하여 시?.......

토론

뼈 결손의 복구는 영향을 받는 개인의 이동성을 회복하고 통증을 줄이며 삶의 질을 개선하기 위한 재생 의학의 주요 과제입니다. 외식물 모델의 사용은 뼈 결손 복구를 위한 생체 내 연구에 비해 많은 이점을 제공합니다. 윤리적 고려 사항 외에도 이 모델을 사용하면 실험 조건을 엄격하게 제어하고 생물학적 변동성을 줄일 수 있으므로 보다 정확하고 재현 가능한 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.20 filters	VWR	28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)	Sterican	4665120
3 mL syringe	HENKE-JECT	8300005762
37% hydrochloric acid	VWR	1.00317.1000
Acetic acid (glacial)	Sigma	A6283
Acetone	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR	361186
Ammonium hydroxide	VWR	318612
Apatitic tricalcium phosphate	Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)	TV26U
Azophloxine	Sigma	210633
Benzoyl peroxide	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker	-
DataViewer	Skyscan	-
Diamond blade	Struers	MOD13
Diamond saw	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution	Struers	40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)	Sigma	102404598
Dibutyl Phtalate	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly software	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma	1002830105
Erythrosin B	Sigma	102141057
Ethanol absolute	VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Fuchsine acid	Merck	1.05231.0025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
Isostatic press	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry	Malvern	Mastersizer 3000
Light green	Prolabo	28947135
Lithium carbonate	Sigma	A13149
MD-Mol polishing cloth	Struers	40500077
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylmethacrylate	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner	Bruker	Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortar	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Nanoindentation station	Anton Paar	NHT2
ND-Nap polishing cloth	Struers	40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid	Sigma	221856-100 g
Phosphotungstic acid	Aldrich	12863-5
Polishing machine	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Raman microspectrometer	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâtinais	Labonord	11507737
Scanning electron microscope	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint	Electron microscopy sciences	12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 flask	Corning	430639
Xylene	VWR	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1