Caractérisation complète de la minéralisation tissulaire dans un modèle ex vivo

Résumé

Le protocole proposé implique une approche globale pour évaluer la formation osseuse dans le contexte de la régénération osseuse à l’aide d’analyses multimodales. Il vise à fournir des informations qualitatives et quantitatives sur la formation de nouveaux os, en améliorant la rigueur et la validité des investigations fondamentales et précliniques.

Résumé

La caractérisation extensive de la minéralisation tissulaire dans le contexte de la régénération osseuse représente un défi important, compte tenu des nombreuses modalités actuellement disponibles pour l’analyse. Ici, nous proposons un flux de travail pour une évaluation complète de la formation de nouveaux os à l’aide d’un explant ex vivo osseux de grand animal pertinent. Un défaut osseux (diamètre = 3,75 mm ; profondeur = 5,0 mm) est créé dans une tête fémorale de mouton explantée et injecté avec un substitut osseux macroporeux chargé d’un facteur de croissance pro-ostéogénique (protéine morphogénétique osseuse 2 - BMP2). Par la suite, l’explant est maintenu en culture pendant une période de 28 jours, ce qui permet la colonisation cellulaire et la formation osseuse ultérieure. Pour évaluer la qualité et la structure des tissus nouvellement minéralisés, les méthodes successives suivantes sont mises en place : (i) Caractérisation et images 3D haute résolution de l’ensemble de l’explant à l’aide de micro-CT, suivies d’analyses d’images d’apprentissage profond pour améliorer la discrimination des tissus minéralisés ; (ii) Nano-indentation pour déterminer les propriétés mécaniques du tissu nouvellement formé ; (iii) Examens histologiques, tels que l’hématoxyline/éosine/safran (HES), le trichrome de Goldner et le pentachrome de Movat, afin de fournir une évaluation qualitative du tissu minéralisé, notamment en ce qui concerne la visualisation de la barrière ostéoïde et la présence de cellules osseuses ; (iv) cartographie par microscopie électronique à balayage (MEB) à rétrodiffusion avec référence interne pour quantifier le degré de minéralisation et fournir des informations détaillées sur la morphologie de surface, la composition minérale et l’interface os-biomatériau ; (v) Spectroscopie Raman pour caractériser la composition moléculaire de la matrice minéralisée et fournir des informations sur la persistance de BMP2 dans le ciment grâce à la détection de liaisons peptidiques. Cette analyse multimodale fournira une évaluation efficace de l’os nouvellement formé et des informations qualitatives et quantitatives complètes sur les tissus minéralisés. Grâce à la normalisation de ces protocoles, nous visons à faciliter les comparaisons entre les études et à améliorer la validité et la fiabilité des résultats de recherche.

Introduction

Les défauts osseux, qu’ils soient causés par un traumatisme, une résection tumorale, des anomalies congénitales ou une infection, représentent un défi majeur pour la médecine régénérative. Ces altérations compromettent l’intégrité structurelle du système squelettique, entraînant une gêne, une déficience fonctionnelle et une réduction de la qualité de vie des patients.

Pour surmonter ces défis, des stratégies innovantes de réparation osseuse ont vu le jour, en mettant l’accent sur l’amélioration de l’ostéogenèse et de la régénération du tissu osseux. Ces approches incluent l’utilisation de substituts osseux ....

Protocole

Cette étude a été approuvée par une commission d’éthique et de bien-être animal et par l’Administration nationale vétérinaire et alimentaire sous le numéro G44171.

1. Préparation et culture d’explants ostéochondrales

1. Récoltez des spécimens d’étuis d’animaux fraîchement euthanasiés dans un environnement aseptique. Positionnez le mouton en position couchée et rasez le membre postérieur gauche. Préparez en désinfectant avec de l’alcool autour de l’articulation du genou. Utiliser l’arthrotomie parapatellaire latérale pour exposer les ligaments croisés antérieur et postérieur, suivie d....

Discussion

La réparation des défauts osseux est un défi majeur en médecine régénérative pour restaurer la mobilité, réduire la douleur et améliorer la qualité de vie des personnes touchées. L’utilisation de modèles d’explants offre un certain nombre d’avantages par rapport aux études in vivo pour l’étude de la réparation des défauts osseux. Outre les considérations éthiques, ce modèle permet un contrôle rigoureux des conditions expérimentales et la réduction .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.20 filters	VWR	28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)	Sterican	4665120
3 mL syringe	HENKE-JECT	8300005762
37% hydrochloric acid	VWR	1.00317.1000
Acetic acid (glacial)	Sigma	A6283
Acetone	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR	361186
Ammonium hydroxide	VWR	318612
Apatitic tricalcium phosphate	Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)	TV26U
Azophloxine	Sigma	210633
Benzoyl peroxide	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker	-
DataViewer	Skyscan	-
Diamond blade	Struers	MOD13
Diamond saw	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution	Struers	40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)	Sigma	102404598
Dibutyl Phtalate	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly software	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma	1002830105
Erythrosin B	Sigma	102141057
Ethanol absolute	VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Fuchsine acid	Merck	1.05231.0025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
Isostatic press	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry	Malvern	Mastersizer 3000
Light green	Prolabo	28947135
Lithium carbonate	Sigma	A13149
MD-Mol polishing cloth	Struers	40500077
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylmethacrylate	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner	Bruker	Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortar	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Nanoindentation station	Anton Paar	NHT2
ND-Nap polishing cloth	Struers	40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid	Sigma	221856-100 g
Phosphotungstic acid	Aldrich	12863-5
Polishing machine	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Raman microspectrometer	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâtinais	Labonord	11507737
Scanning electron microscope	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint	Electron microscopy sciences	12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 flask	Corning	430639
Xylene	VWR	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1