אפיון מקיף של מינרליזציה של רקמות במודל Ex Vivo

Summary

הפרוטוקול המוצע כולל גישה גלובלית להערכת היווצרות עצם בהקשר של התחדשות עצם באמצעות אנליזות מולטימודאליות. מטרתו לספק מידע איכותי וכמותי על היווצרות עצם חדשה, לשפר את הקפדנות והתוקף של מחקרים בסיסיים ופרה-קליניים.

Abstract

האפיון הנרחב של מינרליזציה של רקמות בהקשר של התחדשות עצם מהווה אתגר משמעותי, בהתחשב בשיטות הרבות הזמינות כיום לניתוח. כאן, אנו מציעים זרימת עבודה להערכה מקיפה של היווצרות עצם חדשה באמצעות צמח osseous ex vivo רלוונטי בעל חיים גדול. פגם בעצם (קוטר = 3.75 מ"מ; עומק = 5.0 מ"מ) נוצר בראש עצם הירך של כבשה נטועה ומוזרק לו תחליף עצם מקרונקבובי טעון בגורם גדילה פרו-אוסטאוגני (חלבון מורפוגנטי עצם 2 - BMP2). לאחר מכן, הצמח נשמר בתרבית לתקופה של 28 יום, מה שמאפשר התיישבות תאית ויצירת עצם לאחר מכן. כדי להעריך את האיכות והמבנה של רקמת מינרליזציה חדשה, מוגדרות השיטות העוקבות הבאות: (i) אפיון ותמונות תלת-ממדיות ברזולוציה גבוהה של הצמח כולו באמצעות micro-CT, ולאחר מכן ניתוחי תמונות למידה עמוקה כדי לשפר את ההבחנה של רקמות מינרליות; (ii) ננו-הזחה כדי לקבוע את התכונות המכניות של הרקמה שזה עתה נוצרה; (iii) בדיקות היסטולוגיות, כגון Hematoxylin/Eosin/Saffron (HES), הטריכרום של גולדנר והפנטכרום של Movat כדי לספק הערכה איכותית של רקמה מינרלית, במיוחד בכל הנוגע להדמיה של מחסום האוסטואידים ונוכחות תאי עצם; (iv) מיפוי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פיזור אחורי (SEM) עם התייחסות פנימית לכימות מידת המינרליזציה ולספק תובנות מפורטות לגבי מורפולוגיה של פני השטח, הרכב מינרלים וממשק עצם-ביו-חומר; (v) ספקטרוסקופיית ראמאן כדי לאפיין את ההרכב המולקולרי של המטריצה המינרלית ולספק תובנות לגבי ההתמדה של BMP2 בתוך הצמנט באמצעות זיהוי קשרים פפטידיים. ניתוח רב-מודאלי זה יספק הערכה יעילה של עצם חדשה שנוצרה ותובנות איכותיות וכמותיות מקיפות לגבי רקמות מינרליות. באמצעות סטנדרטיזציה של פרוטוקולים אלה, אנו שואפים להקל על השוואות בין מחקרים ולשפר את התוקף והאמינות של ממצאי מחקר.

Introduction

פגמים בעצמות, בין אם נגרמים על ידי טראומה, כריתת גידול, מומים מולדים או זיהום, מהווים אתגר גדול עבור רפואה רגנרטיבית. שינויים אלה פוגעים בשלמות המבנית של מערכת השלד, ומובילים לאי נוחות, פגיעה תפקודית וירידה באיכות החיים של המטופלים.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, התפתחו אסטרטגיות חדשניות לתיקון עצם, תוך התמקדות בשיפור אוסטאוגנזה והתחדשות רקמת עצם. גישות אלה כוללות שימוש בתחליפי עצם מושתלים, ניתנים להזרקה או להדפסה תלת-ממדית, שיכולים להיות ממקור טבעי (למשל, מקרומולקולות ממקור ביולוגי, הידרוקסיאפטיט שמקורו בבעלי חיים) או סינתטיים (למשל, משקפיים ביולוגיים, סידן פוספט)¹. כדי לשפר את היכולת הט....

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת אתיקה ורווחת בעלי חיים ועל ידי מנהל המזון והווטרינריה הלאומי הצרפתי תחת מספר G44171.

1. הכנה ותרבות של צמחים osteochondral

1. קצרו דגימות מפרקים של כבשים מבעלי חיים שזה עתה הומתו בסביבה אספטית. מקמו את הכבשה במצב שכיבה וגלחו את הגפה האחורית השמאלית. הכן על ידי חיטוי עם אלכוהול סביב מפרק הברך. השתמש בארתרוטומיה פרפטלרית צידית כדי לחשוף את הרצועות הצולבות הקדמיות והאחוריות, ולאחר מכן נקע פטלרי כדי לחשוף את טרוכלאה הירך.
   1. לאחר קצירת הרקמות, יש ליצור פגם בקוטר 4.75 מ"מ בקונדיל הצידי באמצעות מערכת העברת השתלה עצמית אוסטאוכונדרלית.
2. בעזרת....

תוצאות

תמונת מיקרו-CT של הצמח מוצגת באיור 2. באמצעות סגמנטציה ידנית לא ניתן להפריד באופן אופטימלי עצם מצמנט, הנמצאת בתעלה המרכזית, באמצעות סף גלובלי. כדי לשפר את הזיהוי של עצם טרבקולרית וצמנט, אנו מציעים להשתמש בלמידה עמוקה. למידה עמוקה היא רבת עוצמה לזיהוי מאפיינ.......

Discussion

תיקון פגמים בעצמות הוא אתגר גדול ברפואה רגנרטיבית כדי להחזיר את הניידות, להפחית את הכאב ולשפר את איכות החיים של אנשים מושפעים. השימוש במודלים של explant מציע מספר יתרונות בהשוואה למחקרי in vivo לחקר תיקון פגמים בעצם. בנוסף לשיקולים אתיים, מודל זה מאפשר בקרה קפדנית של תנאי ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.20 filters	VWR	28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)	Sterican	4665120
3 mL syringe	HENKE-JECT	8300005762
37% hydrochloric acid	VWR	1.00317.1000
Acetic acid (glacial)	Sigma	A6283
Acetone	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR	361186
Ammonium hydroxide	VWR	318612
Apatitic tricalcium phosphate	Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)	TV26U
Azophloxine	Sigma	210633
Benzoyl peroxide	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker	-
DataViewer	Skyscan	-
Diamond blade	Struers	MOD13
Diamond saw	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution	Struers	40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)	Sigma	102404598
Dibutyl Phtalate	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly software	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma	1002830105
Erythrosin B	Sigma	102141057
Ethanol absolute	VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Fuchsine acid	Merck	1.05231.0025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
Isostatic press	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry	Malvern	Mastersizer 3000
Light green	Prolabo	28947135
Lithium carbonate	Sigma	A13149
MD-Mol polishing cloth	Struers	40500077
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylmethacrylate	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner	Bruker	Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortar	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Nanoindentation station	Anton Paar	NHT2
ND-Nap polishing cloth	Struers	40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid	Sigma	221856-100 g
Phosphotungstic acid	Aldrich	12863-5
Polishing machine	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Raman microspectrometer	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâtinais	Labonord	11507737
Scanning electron microscope	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint	Electron microscopy sciences	12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 flask	Corning	430639
Xylene	VWR	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1