Caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo

Resumo

O protocolo proposto envolve uma abordagem global para avaliar a formação óssea no contexto da regeneração óssea usando análises multimodais. Tem como objetivo fornecer informações qualitativas e quantitativas sobre a nova formação óssea, aumentando o rigor e a validade das investigações básicas e pré-clínicas.

Resumo

A extensa caracterização da mineralização tecidual no contexto da regeneração óssea representa um desafio significativo, dadas as inúmeras modalidades atualmente disponíveis para análise. Aqui, propomos um fluxo de trabalho para uma avaliação abrangente da nova formação óssea usando um explante ex vivo ósseo de grande porte animal relevante. Um defeito ósseo (diâmetro = 3,75 mm; profundidade = 5,0 mm) é criado em uma cabeça femoral de ovelha explantada e injetado com um substituto ósseo macroporoso carregado com um fator de crescimento pró-osteogênico (proteína morfogenética óssea 2 - BMP2). Posteriormente, o explante é mantido em cultura por um período de 28 dias, permitindo a colonização celular e posterior formação óssea. Para avaliar a qualidade e a estrutura do tecido recém-mineralizado, os seguintes métodos sucessivos são estabelecidos: (i) Caracterização e imagens 3D de alta resolução de todo o explante usando micro-CT, seguidas de análises de imagem de aprendizado profundo para melhorar a discriminação de tecidos mineralizados; (ii) Nano-indentação para determinar as propriedades mecânicas do tecido recém-formado; (iii) Exames histológicos, como Hematoxilina/Eosina/Açafrão (HES), tricrômico de Goldner e pentacromo de Movat para avaliação qualitativa do tecido mineralizado, particularmente no que diz respeito à visualização da barreira osteóide e à presença de células ósseas; (iv) Mapeamento de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de retroespalhamento com referência interna para quantificar o grau de mineralização e fornecer informações detalhadas sobre a morfologia da superfície, composição mineral e interface osso-biomaterial; (v) Espectroscopia Raman para caracterizar a composição molecular da matriz mineralizada e fornecer informações sobre a persistência de BMP2 dentro do cimento através da detecção de ligações peptídicas. Esta análise multimodal fornecerá uma avaliação eficaz do osso recém-formado e insights qualitativos e quantitativos abrangentes sobre tecidos mineralizados. Por meio da padronização desses protocolos, pretendemos facilitar as comparações entre estudos e melhorar a validade e a confiabilidade dos resultados da pesquisa.

Introdução

Os defeitos ósseos, sejam eles causados por trauma, ressecção tumoral, anomalias congênitas ou infecção, representam um grande desafio para a medicina regenerativa. Essas alterações comprometem a integridade estrutural do sistema esquelético, levando a desconforto, comprometimento funcional e redução da qualidade de vida dos pacientes.

Para superar esses desafios, surgiram estratégias inovadoras de reparo ósseo, com foco no aprimoramento da osteogênese e da regeneração do tecido ósseo. Essas abordagens incluem o uso de substitutos ósseos implantáveis, injetáveis ou imprimíveis em 3D, que podem ser de origem....

Protocolo

Este estudo foi aprovado por um comitê de ética e bem-estar animal e pela Administração Nacional Veterinária e Alimentar da França sob o número G44171.

1. Preparação e cultura de explantes osteocondrais

1. Colha espécimes de ovelhas de animais recém-sacrificados em um ambiente asséptico. Posicione a ovelha em decúbito dorsal e raspe o membro posterior esquerdo. Prepare-se desinfetando com álcool ao redor da articulação do joelho. Use a artrotomia parapatelar lateral para expor os ligamentos cruzados anterior e posterior, seguida de luxação patelar para revelar a tróclea femoral.
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Discussão

O reparo de defeitos ósseos é um grande desafio na medicina regenerativa para restaurar a mobilidade, reduzir a dor e melhorar a qualidade de vida dos indivíduos afetados. O uso de modelos de explante oferece uma série de vantagens em relação aos estudos in vivo para a investigação do reparo de defeitos ósseos. Além das considerações éticas, esse modelo permite o controle rigoroso das condições experimentais e a redução da variabilidade biológica, facilitando a.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.20 filters	VWR	28145-501
18 G needle (1,2x40 mm)	Sterican	4665120
3 mL syringe	HENKE-JECT	8300005762
37% hydrochloric acid	VWR	1.00317.1000
Acetic acid (glacial)	Sigma	A6283
Acetone	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR	361186
Ammonium hydroxide	VWR	318612
Apatitic tricalcium phosphate	Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)	TV26U
Azophloxine	Sigma	210633
Benzoyl peroxide	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker	-
DataViewer	Skyscan	-
Diamond blade	Struers	MOD13
Diamond saw	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution	Struers	40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4)	Sigma	102404598
Dibutyl Phtalate	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly software	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	Sigma	1002830105
Erythrosin B	Sigma	102141057
Ethanol absolute	VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Fuchsine acid	Merck	1.05231.0025
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
Isostatic press	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry	Malvern	Mastersizer 3000
Light green	Prolabo	28947135
Lithium carbonate	Sigma	A13149
MD-Mol polishing cloth	Struers	40500077
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylcyclohexane	VWR	8.06147.1000
Methylmethacrylate	Sigma	8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner	Bruker	Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortar	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Nanoindentation station	Anton Paar	NHT2
ND-Nap polishing cloth	Struers	40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid	Sigma	221856-100 g
Phosphotungstic acid	Aldrich	12863-5
Polishing machine	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Raman microspectrometer	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâtinais	Labonord	11507737
Scanning electron microscope	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint	Electron microscopy sciences	12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 flask	Corning	430639
Xylene	VWR	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1