基于 LED 的体外 筛选用于评估细菌光动力灭活中的光激活分子

摘要

该协议描述了一种简单而经济的方法，用于评估潜在光敏剂在抗菌光动力灭活 （aPDI） 中的有效性，使用 96 孔板格式与 LED 面板光源相结合。这种方法可以同时测试多种实验条件，包括不同的浓度、化合物和细菌菌株。

摘要

多重耐药性感染的增加和新抗生素类别的缺乏重新引起了人们对细菌光动力灭活 （aPDI） 等替代疗法的兴趣。这个过程涉及施用由合适的可见光源激活的光敏剂 （PS），产生更高水平的活性氧 （ROS），从而破坏关键的细胞生物分子，最终导致细菌细胞死亡。创建标准化、易于使用且可重复的初始测试以评估和比较潜在光敏剂的光诱导光毒性的有效性至关重要。本研究介绍了一种简单有效的 体外 技术，用于评估针对浮游细菌细胞的光动力活性。该系统采用 96 孔微孔板和大型 LED 面板，有助于对各种化合物进行系统评估。这种配置允许在受控且一致的环境中对潜在的光敏剂进行高通量筛选，从而简化了确定有前途的候选药物以进行进一步开发的过程。这个灵活的平台是推进创新光动力疗法开发以管理抗生素耐药性感染的重要一步。

引言

光动力疗法 （PDT） 是一种微创治疗方法，近年来显示出可喜的成果，尤其是在皮肤病临床治疗方面¹。这种治疗方式的一个特别有趣的应用领域是治疗微生物感染，这一过程称为抗菌光动力灭活 （aPDI）²。尽管最初被忽视，主要是因为抗生素的显着疗效，但近年来，由于抗菌药物多重耐药性 （AMR） 的出现以及需要找到替代和有效的策略来解决这一公共卫生问题，光触发根除细菌生长重新引起了人们的兴趣 ^3,4.可以在几秒钟或几分钟内获得显著的结果，通过分别专门照射感兴趣区域和程序的开/关功能来提供空间和时间精度。

光动力原理背后的机制依赖于感光分子（光敏剂）、分子氧和外部光源的组合。虽然这三种成分是无害的，但当结合时，由于光敏剂的光活化，它们可能会对靶细胞致命。光触发反应导致活性氧 （ROS） 的大量产生，最终对关键细胞成分造成严重且不可逆的损伤，导致细胞死亡 ^5,6。此外，aPDI 与其他常规抗菌治疗的联合治疗已显示出有希望的治疗效果，包括更高的治疗效果、更短的治疗时间和更低的药物剂量⁷。

此外，在 PDT 中局部施用光敏剂 （PS） 可以进行有针对性的治疗，对周围组织的损伤最小，全身影响低，使其成为治疗浅表皮肤感染的广受好评的选择⁸。局部治疗的便利性以及许多皮肤感染和病变的浅表性质使其成为 PDT 的有吸引力的目标。研究支持 aPDI 治疗烧伤感染、手术伤口感染、溃疡病变和其他浅表疾病（如痤疮和脓疱病）的有效性 ^9,10,11。

许多天然和合成分子已经过 aPDI 测试并提出。然而，在实验方案中使用不同且通常未指定的参数使得比较结果变得具有挑战性，这影响了科学发现的清晰度。开发简单且可重现的检测方法有助于快速筛选多种化合物，加快确定有前景的候选化合物。简单、可重现且具有成本效益的方案在早期测试中特别有价值，因为它们能够比较不同研究机构的结果。高效的筛选过程还使探索更广泛的分子变得更加容易，从而有可能发现和选择新的光敏剂，以便在更先进、更复杂和更昂贵的方法中进一步测试。

该协议概述了一种使用光强度为 25 mW/cm² 的 LED 面板评估潜在光敏剂对细菌的光毒性的简单方法。使用具有代表性的细菌菌株 金黄色葡萄球菌，并选择白光通道，提供可见光谱的完全覆盖。该程序包括 30 分钟的预潜伏期，然后是 15 分钟的光照 （22.5 J/cm²）。虽然结果基于这些特定的实验条件，但可以根据各个方案进行定制。必须明确定义这些设置并将其包含在程序描述中。

研究方案

该协议的总体描述如图 1 所示。所用试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. 细菌培养物制备

1. 在原种培养物的 Mueller-Hinton 琼脂 （MH） 上培养 金黄色 葡萄球菌 （ATCC 29213） 细菌。测定前将 MH 板在 37 °C 下孵育 24 小时以获得新鲜的培养物。
2. 接种细菌：从琼脂平板中收集 2-3 个新鲜菌落，并在 6 mL 预热的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.4） 中稀释，无菌过滤。
3. 涡旋 （1200 rpm） 接种物 3-4 次，以确保样品适当均质化。将 3 mL 抽取到一次性比色皿中。
4. 测量 OD₆₀₀ 并使用 PBS 将其调节至 0.1（约 1 x 10⁸ CFU/mL）。
   注意：确切的 OD 到 CFU 的转换可能因 金黄色葡萄球菌的菌株而异。可以为特定菌株和实验室实验条件建立标准生长曲线。

2. 光敏剂制备

1. 储备液：在适当的溶剂（例如 DMSO 或 PBS; 图 2）。
2. 工作溶液：在 PBS 中稀释储备液。使用 PBS 而不是细菌培养基可确保培养基的成分在 aPDI 实验期间不会干扰光吸收。
3. 涡旋样品以确保完全均质化。如有必要，使用超声波浴以确保完全溶解并获得澄清的溶液（在这种情况下，请仔细控制。对于疏水性化合物，可能需要调整溶剂体系（例如，添加 % 的 DMSO 或乙醇）。确保始终检查溶剂对细胞活力的影响。
   注：超声处理的条件因化合物类型、浓度和系统溶剂而异;对于易溶化合物，较短的时间（例如 5 分钟）可能就足够了，而对于高度疏水性的化合物，可能需要较长的时间（20-30 分钟）。

3. 板设置

1. 准备两个单独的 96 孔板：一个用于光照，另一个用于避光（黑暗对照）。
2. 在每个板中，将 100 μL 光敏剂溶液与 100 μL 细菌悬浮液混合。上下移液 5-10 次。
3. 将板在 37 °C 下孵育预定的间隔（在本研究中，使用 30 分钟的时间）以使光敏剂与细菌细胞相互作用。

4. 辐照

1. 从培养箱中取出板，并将其中一个板暴露在 LED 面板发出的光下（本实验中使用的设备包括一个 50W 功率的矩形 LED 投影仪;IP65 防护等级;输入电压：AC 85-265 V），保持另一个免受光照。
2. 将其中一个板放在 LED 面板上方。为确保通过多次协议重复精确调整板，请直接在 LED 表面上标记 96 孔板的边缘。
3. 将板暴露适当的照射时间（在本研究中，使用了 15 分钟的周期）。
   注意：确保光剂量足以激活光敏剂，而不会影响细胞活力。因此，必须包括光控制（在没有光敏剂的情况下暴露在光线下的细菌）。

5. 照射后和琼脂平板采样

1. 使用另一个 96 孔板制备样品的连续稀释液（对照、未辐照和辐照孔）。
2. 根据样品数量添加 180 μL PBS/孔。为了正确定义布局，请考虑到一个样品的连续稀释需要一行 6 个孔（10 倍稀释，从 ^10-1 到 ^10-6）。
3. 从每个孔（来自辐照和未辐照的 96 孔板）中分装 20 μL 到先前装满 PBS 的板的第一列。
4. 使用多通道微量移液器，从 1 至 6 孔（^10-1 至 ^10-6）进行简单的连续稀释。注：此时样品均质化对于确保混合物的均匀性和一致性至关重要。在每个稀释步骤中，上下移液 5-10 次。
5. 将琼脂平板分成六个相等的部分，每个部分对应于其中一个稀释液（参见 图 3）。
6. 将每个孔中的 10 μL 分装到琼脂板表面的相应切片上（对于每个样品，至少包括 3 个重复）。避免将等分试样彼此靠得太近。轻轻地将琼脂平板运送到培养箱中并等待 18-20 小时。
   注意：考虑到 CFU 的形态因细菌种类而异。例如，虽然 金黄色 葡萄球菌菌落相对容易计数，但 铜绿假单 胞菌往往形成更弥漫型的菌落。考虑到这一点，可能会调整仿行数。

6. 细胞活力测定（菌落形成单位计数）

1. 从培养箱中取出琼脂板，然后选择适合细胞计数的区域。
   注意：避免在具有丰富、重叠和不确定的菌落的切片内计数。
2. 在每个部分中，计算菌落形成单位 （CFU） 的数量并确定 3 次重复的平均值
3. 将计数的 CFU 数量转换为 CFU/mL，将平均计数乘以稀释因子，然后除以 mL 接种的培养物体积进行分液。

7. 数据分析

1. 将 CFU/mL 数据转换为对数刻度，并在 log₁₀|CFU/mL|作为测试浓度的函数。

结果

氨基黄酮化合物（图 2）：7-二乙氨基-4′-二甲基氨基黄酮 （7NEt₂4′NMe₂）、7-二乙氨基-2-（二甲基氨基苯乙烯基）-1-苯并吡啶 （7NEt₂st4′NMe₂）、7-二乙氨基-4′-氨基黄酮 （7NEt₂4′NH₂） 和 7-二乙氨基-4′-羟基黄酮 （7NEt₂4′OH），其光响应性质已在前面讨论过^12,13

讨论

尽管该方案作为初始阶段的测试平台，但在更高级的研究阶段考虑更有意义的测试条件来治疗微生物感染是很重要的。在评估 aPDI 的有效性时，应对生物膜型细菌组织而不是浮游细菌进行实验。许多临床病例涉及以这种更具抵抗力的构象组织的微生物，例如慢性伤口、囊性纤维化和植入的医疗器械¹⁴。

需要注意的是，虽然使用白光?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150