הקרנה במבחנה מבוססת LED להערכת מולקולות הניתנות להפעלה פוטודינמית בהפעלה פוטודינמית של חיידקים

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית להערכת היעילות של רגישים לאור פוטו-רגישים פוטנציאליים באינאקטיבציה פוטודינמית אנטיבקטריאלית (aPDI), תוך שימוש בפורמט צלחת של 96 בארות בשילוב עם מקור אור פאנל LED. גישה זו מאפשרת בדיקה בו-זמנית של תנאי ניסוי מרובים, כולל ריכוזים שונים, תרכובות וזני חיידקים.

Abstract

עלייתם של זיהומים עמידים לתרופות מרובות והיעדר סוגים חדשים של אנטיביוטיקה חידשו את העניין בטיפולים אלטרנטיביים כמו השבתה פוטודינמית של חיידקים (aPDI). תהליך זה כרוך במתן רגישות לאור (PS) המופעל על ידי מקור אור נראה מתאים, ומייצר רמות מחמירות של מיני חמצן תגובתיים (ROS) הפוגעים בביומולקולות תאיות חיוניות, ובסופו של דבר גורמים למוות של תאי חיידקים. חיוני ליצור בדיקות ראשוניות סטנדרטיות, קלות לשימוש וניתנות לשחזור כדי להעריך ולהשוות את היעילות של פוטוטוקסיות הנגרמת על ידי אור של רגישים לאור פוטנציאליים. מחקר זה מציג טכניקה פשוטה ויעילה במבחנה להערכת פעילות פוטודינמית כנגד תאי חיידקים פלנקטוניים. על ידי שימוש בפורמט מיקרו-פלטות של 96 בארות יחד עם פאנל LED גדול, המערכת מאפשרת הערכה שיטתית של תרכובות שונות. תצורה כזו מאפשרת סינון בתפוקה גבוהה של רגישים פוטנציאליים בסביבה מבוקרת ועקבית, ומפשטת את תהליך זיהוי המועמדים המבטיחים להמשך פיתוח. פלטפורמה גמישה זו משמשת כצעד חשוב בקידום הפיתוח של טיפולים פוטודינמיים חדשניים לניהול זיהומים עמידים לאנטיביוטיקה.

Introduction

טיפול פוטודינמי (PDT) הוא גישה טיפולית זעיר פולשנית שהראתה תוצאות מבטיחות בשנים האחרונות, במיוחד בטיפול קליני דרמטולוגי¹. תחום יישום מעניין במיוחד של שיטה טיפולית זו הוא הטיפול בזיהומים מיקרוביאליים, תהליך המכונה אינאקטיבציה פוטודינמית אנטי-מיקרוביאלית (aPDI)². למרות שהתעלמו ממנו בתחילה, בעיקר בגלל היעילות המדהימה של האנטיביוטיקה, מיגור גידול חיידקים באמצעות אור זכה לעניין מחודש בשנים האחרונות, מונע על ידי הופעת עמידות אנטי-מיקרוביאלית לתרופות מרובות (AMR) והצורך למצוא אסטרטגיות חלופיות ויעילות לטיפול בדאגה זו לבריאות הציבור ^3,4. ניתן להשיג תוצאות משמעותיות תוך שניות או דקות, עם דיוק מרחבי וזמני המוצע על ידי הקרנה ספציפית של אזור העניין ותכונת ההפעלה/כיבוי של ההליך, בהתאמה.

המנגנון מאחורי העיקרון הפוטודינמי מסתמך על שילוב של מולקולות רגישות לאור (רגישות לאור), חמצן מולקולרי ומקור אור חיצוני. למרות ששלושת המרכיבים הללו אינם מזיקים, כאשר הם משולבים, הם עלולים להפוך לקטלניים לתאי המטרה עקב הפוטו-אקטיבציה של הרגישות לאור. תגובות המופעלות על ידי אור גורמות לייצור מסיבי של מיני חמצן תגובתיים (ROS), אשר בסופו של דבר גורם לנזק חמור ובלתי הפיך ברכיבים תאיים חיוניים, מה שמוביל למוות תאים ^5,6. כמו כן, השילוב של aPDI עם טיפולים אנטי-מיקרוביאליים קונבנציונליים אחרים הראה תוצאות טיפוליות מבטיחות, כולל יעילות טיפול גבוהה יותר, זמן טיפול מופחת ומינוני תרופות נמוכים יותר.

יתר על כן, מתן מקומי של רגישים לאור (PS) ב-PDT מאפשר טיפול ממוקד עם נזק מינימלי לרקמות הסובבות והשפעות מערכתיות נמוכות, מה שהופך אותו לאופציה מוערכת לטיפול בזיהומי עור שטחיים⁸. הנוחות של טיפול מקומי והאופי השטחי של זיהומי עור ונגעים רבים הופכים אותו למטרה אטרקטיבית ל-PDT. מחקרים תמכו ביעילות של aPDI בטיפול בזיהומי כוויות, זיהומים בפצעים כירורגיים, נגעים כיביים ומחלות שטחיות אחרות כגון אקנה ואימפטיגו ^9,10,11.

מולקולות רבות, טבעיות וסינתטיות, נבדקו והוצעו ל-aPDI. עם זאת, השימוש בפרמטרים משתנים ולעתים קרובות לא מוגדרים בפרוטוקולים ניסויים מקשה על השוואת התוצאות, מה שמשפיע על בהירות הממצאים המדעיים. פיתוח בדיקות פשוטות וניתנות לשחזור יכול להקל על סינון מהיר של תרכובות רבות, ולזרז את זיהוי המועמדים המבטיחים. פרוטוקולים פשוטים, ניתנים לשחזור וחסכוניים הם בעלי ערך במיוחד בבדיקות בשלבים מוקדמים, מכיוון שהם מאפשרים השוואה של תוצאות בין מתקני מחקר שונים. תהליכי סינון יעילים גם מקלים על חקר מגוון רחב יותר של מולקולות, מה שעשוי להוביל לגילוי ובחירה של רגישים לאור חדשים לבדיקות נוספות במתודולוגיות מתקדמות, מורכבות ויקרות יותר.

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להערכת הפוטוטוקסיות של רגישים פוטנציאליים על חיידקים באמצעות לוח LED בעוצמת אור של 25 mW/cm². נעשה שימוש בזן חיידקים מייצג, S. aureus, ונבחרה תעלת האור הלבן, המציעה כיסוי מלא של הספקטרום הנראה. ההליך כלל תקופה של 30 דקות לפני הדגירה ואחריה חשיפה של 15 דקות לאור (22.5 J/cm²). בעוד שהתוצאות מבוססות על תנאי הניסוי הספציפיים הללו, ניתן להתאים אותן בהתאם לפרוטוקולים בודדים. חיוני להגדיר בבירור את ההגדרות הללו ולכלול אותן בתיאור הפרוצדורלי.

Protocol

תיאור כולל של הפרוטוקול מתואר באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תרבית חיידקים

1. לגדל חיידקי S. aureus (ATCC 29213) על אגר מולר-הינטון (MH) מתרביות מלאי. דגרו את לוחות MH בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני הבדיקה כדי להשיג תרביות טריות.
2. חיסון חיידקים: יש לאסוף 2-3 מושבות טריות מצלחת האגר ולדלל ב-6 מ"ל של pH 7.4 של מי מלח מחוממים מראש (PBS), מסונן סטרילי.
3. מערבולת (1200 סל"ד) את החיסון 3-4 פעמים כדי להבטיח הומוגניזציה נכונה של הדגימה. משוך 3 מ"ל לקובטה חד פעמית.
4. מדוד OD₆₀₀ והתאם אותו ל-0.1 (כ-1 x 10⁸ CFU/mL) באמצעות PBS.
   הערה: ההמרה המדויקת של OD ל-CFU יכולה להשתנות בהתאם לזן של S. aureus. אפשר לקבוע עקומת גדילה סטנדרטית עבור הזן הספציפי ותנאי ניסוי המעבדה שעובדים איתם.

2. הכנת רגישות לאור

1. פתרון מלאי: הכן תמיסת מלאי של תרכובת הרגישות לאור (ראה סעיף תוצאות לפרטים) בממס מתאים (למשל, DMSO או PBS; איור 2).
2. פתרון עבודה: לדלל את תמיסת המלאי ב-PBS. השימוש ב-PBS ולא באמצעי תרבית חיידקים מבטיח שמרכיבי המדיה אינם מפריעים לספיגת האור במהלך ניסויי aPDI.
3. מערבולת הדגימה כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה. השתמש באמבט קולי במידת הצורך כדי להבטיח מסיסות מלאה ולהשיג פתרון ברור (במקרה זה, שלוט בזהירות. עבור תרכובות הידרופוביות, ייתכן שתידרש התאמה של מערכת הממס (למשל, הוספת % של DMSO או אתנול). ודא כי השפעת הממס על כדאיות התא נבדקת תמיד.
   הערה: התנאים לסוניקציה ישתנו בהתאם לסוג התרכובת, הריכוז וממס המערכת; זמנים קצרים יותר (למשל, 5 דקות) עשויים להספיק לתרכובות מסיסות בקלות, בעוד שזמנים ארוכים יותר (20-30 דקות) עשויים להידרש עבור תרכובות הידרופוביות מאוד.

3. הגדרת צלחת

1. הכן שתי צלחות נפרדות של 96 בארות: אחת לעבור חשיפה לאור ואחרת להישמר בחושך (בקרת חושך).
2. בכל אחת מהצלחות מערבבים 100 מיקרוליטר מתמיסת הרגישות לאור עם 100 מיקרוליטר של התרחיף החיידקי. פיפטה למעלה ולמטה 5-10 פעמים.
3. דגרו את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס למרווח שנקבע מראש (במחקר זה נעשה שימוש בפרק זמן של 30 דקות) כדי לאפשר לרגיש לאור לקיים אינטראקציה עם תאי החיידקים.

4. הקרנה

1. הסר את הלוחות מהחממה וחשוף אחת מהן לאור הנפלט מלוח ה- LED (המכשיר ששימש בניסוי זה כלל מקרן LED מלבני בהספק של 50 וואט; IP65; מתח כניסה: AC 85-265 V), תוך שמירה על השני מוגן מפני חשיפה לאור.
2. הנח את אחת הלוחות מעל לוח ה-LED. כדי להבטיח התאמה מדויקת של הצלחת באמצעות מספר חזרות על פרוטוקול, סמן את הקצוות של לוחית 96 הבארות ישירות על משטח ה-LED.
3. חשוף את הצלחת לזמן הקרנה מתאים (במחקר זה נעשה שימוש בפרק זמן של 15 דקות).
   הערה: ודא שמינון האור מספיק כדי להפעיל את הרגישות לאור מבלי לפגוע בכדאיות התאית. מסיבה זו, יש לכלול בקרת אור (חיידקים החשופים לאור בהיעדר רגישות לאור).

5. דגימת צלחות לאחר הקרנה ואגר

1. השתמש בצלחת נוספת של 96 בארות כדי להכין את הדילולים הסדרתיים של הדגימות (בקרות, בארות לא מוקרנות ומוקרנות).
2. הוסף 180 מיקרוליטר של PBS/באר בהתאם למספר הדגימות. כדי להגדיר נכון את הפריסה, קחו בחשבון שיש צורך בשורה של 6 בארות לדילול סדרתי של דגימה אחת (דילול פי 10, ^{מ-10-1 ל-10-6}).
3. Aliquot 20 מיקרוליטר מכל באר (מהצלחת המוקרנת והלא מוקרנת של 96 בארות) לעמודה הראשונה של הצלחת שהתמלאה בעבר ב- PBS.
4. בעזרת המיקרו-פיפטה הרב-ערוצית, בצע דילול סדרתי פשוט מבאר 1 עד 6 (^10-1 עד ^10-6). הערה: הומוגניזציה של דגימה היא קריטית בשלב זה כדי להבטיח תערובת אחידה ועקבית. בכל שלב דילול, פיפטה למעלה ולמטה 5-10 פעמים.
5. חלקו את לוחית האגר לשישה חלקים שווים, כל חלק מתאים לאחד הדילולים (ראה איור 3).
6. ציטוט 10 מיקרוליטר מכל באר על החלק המתאים על פני לוחית האגר (עבור כל דגימה, כלול לפחות 3 שכפולים). הימנע מהצבת אליקוטים קרוב מדי זה לזה. העבירו בעדינות את צלחות האגר לחממה והמתינו 18-20 שעות.
   הערה: קחו בחשבון שהמורפולוגיה של CFUs משתנה באופן משמעותי בהתאם למין החיידקים. לדוגמה, בעוד שקל יחסית לספור מושבות S. aureus , P. aeruginosa נוטה ליצור מושבות מפוזרות יותר. ניתן להתאים את מספר השכפולים בהתחשב בכך.

6. קביעת כדאיות תאית (ספירת יחידות יוצרות מושבה)

1. הסר את צלחות האגר מהחממה ובחר את האזורים המתאימים לספירת תאים.
   הערה: הימנע מספירה בתוך קטעים עם מושבות בשפע, חופפות ולא מוגדרות היטב.
2. בתוך כל חלק, ספרו את מספר היחידות היוצרות מושבה (CFUs) וקבעו את הממוצע של 3 השכפולים
3. המר את מספר ה-CFU שנספר ל-CFU/mL, הכפיל את הספירה הממוצעת במקדם הדילול ופיצול בנפח התרבית המצופה במ"ל.

7. ניתוח נתונים

1. המר את הנתונים של CFU/mL לסולם הלוגריתמי וייצג את הכדאיות הסלולרית ביומן₁₀|CFU/מ"ל | כפונקציה של הריכוז שנבדק.

תוצאות

תרכובות פלביליום מבוססות אמינו (איור 2): 7-דיאתילאמינו-4′-דימתילאמינופלבליום (7NEt₂4′NMe₂), 7-דיאתילאמינו-2-(דימתילאמינוסטיריל)-1-בנזופיריליום (7NEt₂st4′NMe₂), 7-דיאתילאמינו-4′-אמינופלביליום (7NEt₂4′NH₂) ו-7-דיאתילאמינו-4′-הידרוקסיפלבי?...

Discussion

למרות שפרוטוקול זה משמש כפלטפורמת בדיקה בשלב ראשוני, חשוב לשקול תנאי בדיקה משמעותיים יותר לטיפול בזיהומים מיקרוביאליים בשלב מחקר מתקדם יותר. כאשר מעריכים את היעילות של aPDI, יש לערוך ניסויים בארגוני חיידקים מסוג ביופילם ולא בחיידקים פלנקטוניים. מקרים קליניים רבים כוללים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150