LED-basiertes In-vitro-Screening zur Beurteilung photoaktivierbarer Moleküle bei bakterieller photodynamischer Inaktivierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Photosensibilisatoren bei der antibakteriellen photodynamischen Inaktivierung (aPDI) unter Verwendung eines 96-Well-Plattenformats in Kombination mit einer LED-Panel-Lichtquelle. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Prüfung mehrerer experimenteller Bedingungen, einschließlich unterschiedlicher Konzentrationen, Verbindungen und Bakterienstämme.

Zusammenfassung

Die Zunahme multiresistenter Infektionen und der Mangel an neuen Antibiotikaklassen haben das Interesse an alternativen Therapien wie der photodynamischen Inaktivierung von Bakterien (aPDI) erneut geweckt. Bei diesem Prozess wird ein Photosensibilisator (PS) verabreicht, der durch eine geeignete sichtbare Lichtquelle aktiviert wird, wodurch ein erhöhter Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt wird, der wichtige zelluläre Biomoleküle schädigt und letztendlich zum bakteriellen Zelltod führt. Es ist von entscheidender Bedeutung, standardisierte, einfach zu handhabende und reproduzierbare Ersttests zu erstellen, um die Wirksamkeit der lichtinduzierten Phototoxizität potenzieller Photosensibilisatoren zu bewerten und zu vergleichen. In dieser Studie wird eine einfache und effiziente in vitro Technik zur Beurteilung der photodynamischen Aktivität gegen planktonische Bakterienzellen vorgestellt. Durch die Verwendung eines 96-Well-Mikroplattenformats in Verbindung mit einem großen LED-Panel erleichtert das System die systematische Bewertung verschiedener Verbindungen. Eine solche Konfiguration ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening potenzieller Photosensibilisatoren in einer kontrollierten und konsistenten Umgebung und vereinfacht den Prozess der Identifizierung vielversprechender Kandidaten für die weitere Entwicklung. Diese flexible Plattform ist ein wichtiger Schritt, um die Entwicklung innovativer photodynamischer Therapien zur Behandlung antibiotikaresistenter Infektionen voranzutreiben.

Einleitung

Die Photodynamische Therapie (PDT) ist ein minimal-invasiver Therapieansatz, der in den letzten Jahren insbesondere in der dermatologisch-klinischen Behandlung vielversprechende Ergebnisse gezeigt hat¹. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet dieser therapeutischen Modalität ist die Behandlung von mikrobiellen Infektionen, ein Prozess, der als antimikrobielle photodynamische Inaktivierung (aPDI)² bekannt ist. Obwohl die lichtgesteuerte Tilgung des Bakterienwachstums anfangs vor allem wegen der bemerkenswerten Wirksamkeit von Antibiotika übersehen wurde, erfuhr sie in den letzten Jahren ein erneutes Interesse, das durch das Aufkommen von Antibiotikaresistenzen (AMR) und die Notwendigkeit, alternative und effiziente Strategien zu finden, um dieses Problem für die öffentliche Gesundheit anzugehen ^3,4. Signifikante Ergebnisse können innerhalb von Sekunden oder Minuten erzielt werden, wobei räumliche und zeitliche Präzision durch gezielte Bestrahlung des interessierenden Bereichs bzw. der Ein-/Ausschaltfunktion des Eingriffs erreicht wird.

Der Mechanismus hinter dem photodynamischen Prinzip beruht auf der Kombination von lichtempfindlichen Molekülen (Photosensibilisator), molekularem Sauerstoff und einer externen Lichtquelle. Obwohl diese drei Komponenten harmlos sind, können sie in Kombination aufgrund der Photoaktivierung des Photosensibilisators für die Zielzellen tödlich werden. Lichtgetriggerte Reaktionen führen zu einer massiven Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die schließlich schwere und irreversible Schäden in wichtigen zellulären Komponenten verursachen, was zum Zelltod führt ^5,6. Auch die Kombination von aPDI mit anderen konventionellen antimikrobiellen Behandlungen hat vielversprechende therapeutische Ergebnisse gezeigt, einschließlich einer höheren Behandlungswirksamkeit, einer kürzeren Behandlungszeit und niedrigerer Arzneimitteldosierungen⁷.

Darüber hinaus ermöglicht die topische Verabreichung von Photosensibilisatoren (PS) in der PDT eine gezielte Behandlung mit minimaler Schädigung des umgebenden Gewebes und geringen systemischen Effekten, was sie zu einer sehr geschätzten Option für die Behandlung oberflächlicher Hautinfektionen macht⁸. Die Bequemlichkeit der topischen Behandlung und die oberflächliche Natur vieler Hautinfektionen und -läsionen machen sie zu einem attraktiven Ziel für die PDT. Studien haben die Wirksamkeit von aPDI bei der Behandlung von Verbrennungsinfektionen, chirurgischen Wundinfektionen, ulzerierten Läsionen und anderen oberflächlichen Beschwerden wie Akne und Impetigo bestätigt ^9,10,11.

Zahlreiche Moleküle, sowohl natürliche als auch synthetische, wurden getestet und für aPDI vorgeschlagen. Die Verwendung unterschiedlicher und oft nicht spezifizierter Parameter in experimentellen Protokollen erschwert jedoch den Vergleich der Ergebnisse, was sich auf die Klarheit der wissenschaftlichen Ergebnisse auswirkt. Die Entwicklung einfacher und reproduzierbarer Tests kann das schnelle Screening zahlreicher Wirkstoffe erleichtern und die Identifizierung vielversprechender Kandidaten beschleunigen. Einfache, reproduzierbare und kostengünstige Protokolle sind besonders wertvoll in der Frühphase, da sie den Vergleich der Ergebnisse über verschiedene Forschungseinrichtungen hinweg ermöglichen. Effiziente Screening-Prozesse erleichtern auch die Erforschung eines breiteren Spektrums von Molekülen, was möglicherweise zur Entdeckung und Auswahl neuer Photosensibilisatoren für weitere Tests in fortschrittlicheren, komplexeren und kostspieligeren Methoden führt.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Bewertung der Phototoxizität potenzieller Photosensibilisatoren auf Bakterien unter Verwendung eines LED-Panels mit einer Lichtintensität von 25 mW/cm². Es wurde ein repräsentativer Bakterienstamm, S. aureus, verwendet, und es wurde der Weißlichtkanal ausgewählt, der eine vollständige Abdeckung des sichtbaren Spektrums bietet. Das Verfahren umfasste eine 30-minütige Vorinkubationsphase, gefolgt von einer 15-minütigen Lichtexposition (22,5 J/cm²). Die Ergebnisse basieren zwar auf diesen spezifischen experimentellen Bedingungen, können aber nach individuellen Protokollen angepasst werden. Es ist wichtig, diese Einstellungen klar zu definieren und in die Verfahrensbeschreibung aufzunehmen.

Protokoll

Eine allgemeine Beschreibung des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Bakterienkultur

1. Züchten Sie S. aureus-Bakterien (ATCC 29213) auf Mueller-Hinton-Agar (MH) aus Stammkulturen. Die MH-Platten werden vor dem Assay 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um frische Kulturen zu erhalten.
2. Bakterien impfen: 2-3 frische Kolonien von der Agarplatte auffangen und in 6 ml vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4, steril filtriert, verdünnen.
3. Drehen Sie das Inokulum 3-4 Mal mit einem Vortex (1200 U/min), um eine ordnungsgemäße Homogenisierung der Probe zu gewährleisten. Entnehmen Sie 3 mL in eine Einwegküvette.
4. Messen Sie OD₆₀₀ und stellen Sie ihn mit PBS auf 0,1 (ca. 1 x 10⁸ KBE/ml) ein.
   HINWEIS: Die genaue Umwandlung von Außendurchmesser in KBE kann je nach Stamm von S. aureus variieren. Man kann eine Standardwachstumskurve für den spezifischen Stamm und die experimentellen Laborbedingungen erstellen, mit denen gearbeitet wird.

2. Vorbereitung des Photosensibilisators

1. Stammlösung: Bereiten Sie eine Stammlösung des Photosensibilisators der interessierenden Verbindung (siehe Abschnitt "Ergebnisse" für Details) in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. DMSO oder PBS; Abbildung 2).
2. Arbeitslösung: Verdünnen Sie die Stammlösung in PBS. Die Verwendung von PBS anstelle von Bakterienkulturmedien stellt sicher, dass die Komponenten des Mediums die Lichtabsorption während aPDI-Experimenten nicht beeinträchtigen.
3. Die Probe wird vortext, um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten. Verwenden Sie bei Bedarf ein Ultraschallbad, um eine vollständige Solubilisierung zu gewährleisten und eine klare Lösung zu erhalten (in diesem Fall sorgfältig kontrollieren. Bei hydrophoben Verbindungen kann eine Anpassung des Lösungsmittelsystems erforderlich sein (z. B. Zugabe eines Prozentsatzes DMSO oder Ethanol). Stellen Sie sicher, dass die Wirkung des Lösungsmittels auf die Zellviabilität immer überprüft wird.
   HINWEIS: Die Bedingungen für die Beschallung variieren je nach Art der Verbindung, Konzentration und Systemlösungsmittel. Kürzere Zeiten (z. B. 5 min) können für leicht lösliche Verbindungen ausreichend sein, während längere Zeiten (20-30 min) für stark hydrophobe Verbindungen erforderlich sein können.

3. Platten-Setup

1. Bereiten Sie zwei separate 96-Well-Platten vor: eine für die Lichtbelichtung und eine für die Aufbewahrung im Dunkeln (Dunkelkontrolle).
2. Mischen Sie in jeder der Platten 100 μl der Photosensibilisatorlösung mit 100 μl der Bakteriensuspension. Pipettieren Sie 5-10 Mal auf und ab.
3. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für ein vorher festgelegtes Intervall (in dieser Studie wurde ein Zeitraum von 30 Minuten verwendet), damit der Photosensibilisator mit den Bakterienzellen interagieren kann.

4. Bestrahlung

1. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und setzen Sie eine von ihnen dem Licht aus, das von der LED-Platte ausgestrahlt wird (das in diesem Experiment verwendete Gerät bestand aus einem rechteckigen LED-Projektor mit einer Leistung von 50 W; Schutzart IP65; Eingangsspannung: AC 85-265 V), um den anderen vor Lichteinwirkung zu schützen.
2. Platzieren Sie eine der Platten über dem LED-Panel. Um eine präzise Einstellung der Platte durch mehrere Protokollwiederholungen zu gewährleisten, markieren Sie die Ränder der 96-Well-Platte direkt auf der LED-Oberfläche.
3. Belichten Sie die Platte für eine geeignete Bestrahlungszeit (in dieser Studie wurde ein Zeitraum von 15 min verwendet).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lichtdosis ausreicht, um den Photosensibilisator zu aktivieren, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Aus diesem Grund muss eine Lichtsteuerung einbezogen werden (Bakterien, die ohne Photosensibilisator Licht ausgesetzt sind).

5. Nachbestrahlung und Probenahme von Agarplatten

1. Verwenden Sie eine weitere 96-Well-Platte, um die seriellen Verdünnungen der Proben vorzubereiten (Kontrollen, unbestrahlte und bestrahlte Wells).
2. Fügen Sie 180 μl PBS/Vertiefung entsprechend der Anzahl der Proben hinzu. Um das Layout richtig zu definieren, ist zu berücksichtigen, dass für die serielle Verdünnung einer Probe (^10-fache Verdünnung, von 10-1 bis 10-6) eine Reihe von 6 Vertiefungen benötigt wird.
3. Aliquotieren Sie 20 μl aus jeder Vertiefung (von der bestrahlten und der unbestrahlten 96-Well-Platte) in die erste Säule der Platte, die zuvor mit PBS gefüllt wurde.
4. Führen Sie mit der Mehrkanal-Mikropipette eine einfache serielle Verdünnung von Vertiefung 1 bis 6 (^10-1 bis ^10-6) durch. HINWEIS: Die Homogenisierung der Probe ist an dieser Stelle von entscheidender Bedeutung, um eine gleichmäßige und konsistente Mischung zu gewährleisten. Bei jedem Verdünnungsschritt 5-10 Mal auf und ab pipettieren.
5. Teilen Sie die Agarplatte in sechs gleiche Teile, wobei jeder Abschnitt einer der Verdünnungen entspricht (siehe Abbildung 3).
6. Aliquotieren Sie 10 μl aus jeder Vertiefung auf den entsprechenden Abschnitt auf der Oberfläche der Agarplatte (für jede Probe mindestens 3 Wiederholungen enthalten). Vermeiden Sie es, Aliquote zu nahe beieinander zu platzieren. Transportieren Sie die Agarplatten vorsichtig zum Inkubator und warten Sie 18-20 h.
   HINWEIS: Beachten Sie, dass die Morphologie von KBE je nach Bakterienart erheblich variiert. Während beispielsweise S. aureus-Kolonien relativ einfach zu zählen sind, neigt P. aeruginosa dazu, eher diffuse Kolonien zu bilden. Die Anzahl der Replikate kann unter Berücksichtigung dieses Problems angepasst werden.

6. Bestimmung der zellulären Lebensfähigkeit (Zählung koloniebildender Einheiten)

1. Nehmen Sie die Agarplatten aus dem Inkubator und wählen Sie die für die Zellzählung geeigneten Bereiche aus.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Zählung innerhalb von Abschnitten mit häufigen, überlappenden und nicht genau definierten Kolonien.
2. Zählen Sie innerhalb jedes Abschnitts die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) und bestimmen Sie den Durchschnitt der 3 Replikate
3. Rechnen Sie die Anzahl der gezählten KBE in KBE/ml um, multiplizieren Sie die durchschnittliche Zählung mit dem Verdünnungsfaktor und teilen Sie sie durch das Volumen der in ml plattierten Kultur.

7. Datenanalyse

1. Konvertieren Sie die Daten von KBE/ml in die logarithmische Skala und stellen Sie die zelluläre Lebensfähigkeit in log₁₀|KBE/ml| in Abhängigkeit von der geprüften Konzentration.

Ergebnisse

Aminobasierte Flavyliumverbindungen (Abbildung 2): 7-Diethylamino-4′-dimethylaminoflavylium (7NEt₂4′_{NMe 2}), 7-Diethylamino-2-(dimethylaminostyryl)-1-benzopyrylium (7NEt₂st4′NMe₂), 7-Diethylamino-4′-aminoflavylium(7NEt₂4′_NH2) und 7-Diethylamino-4′-hydroxyflavylium (7NEt₂4′OH), deren lichtempfindliche Natur zuvor diskutiert wurde^12,13

Diskussion

Obwohl dieses Protokoll als Testplattform in der Anfangsphase dient, ist es wichtig, in einer fortgeschritteneren Studienphase aussagekräftigere Testbedingungen für die Behandlung mikrobieller Infektionen in Betracht zu ziehen. Bei der Beurteilung der Wirksamkeit von aPDI sollten Experimente mit biofilmartigen Bakterienorganisationen und nicht mit planktonischen Bakterien durchgeführt werden. In vielen klinischen Fällen sind Mikroorganismen beteiligt, die in dieser widerstandsfähige...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150