Bakteriyel Fotodinamik İnaktivasyonda Fotoaktif Moleküllerin Değerlendirilmesi için LED Tabanlı İn Vitro Tarama

Özet

Bu protokol, bir LED panel ışık kaynağı ile birleştirilmiş 96 oyuklu bir plaka formatı kullanarak, antibakteriyel fotodinamik inaktivasyonda (aPDI) potansiyel ışığa duyarlılaştırıcıların etkinliğini değerlendirmek için basit ve ekonomik bir yöntemi açıklar. Bu yaklaşım, farklı konsantrasyonlar, bileşikler ve bakteri suşları dahil olmak üzere birden fazla deneysel koşulun aynı anda test edilmesini sağlar.

Özet

Çoklu ilaca dirençli enfeksiyonların artması ve yeni antibiyotik sınıflarının olmaması, bakterilerin fotodinamik inaktivasyonu (aPDI) gibi alternatif tedavilere olan ilgiyi yenilemiştir. Bu işlem, uygun bir görünür ışık kaynağı tarafından aktive edilen ve önemli hücresel biyomoleküllere zarar veren ve sonuçta bakteri hücresi ölümüne neden olan daha yüksek seviyelerde reaktif oksijen türleri (ROS) üreten bir ışığa duyarlılaştırıcının (PS) uygulanmasını içerir. Potansiyel ışığa duyarlılaştırıcıların ışığa bağlı fototoksisitesinin etkinliğini değerlendirmek ve karşılaştırmak için standartlaştırılmış, kullanımı kolay ve tekrarlanabilir başlangıç testleri oluşturmak çok önemlidir. Bu çalışma, planktonik bakteri hücrelerine karşı fotodinamik aktiviteyi değerlendirmek için basit ve etkili bir in vitro teknik sunmaktadır. Sistem, büyük bir LED panel ile birlikte 96 oyuklu bir mikroplaka formatı kullanarak, çeşitli bileşiklerin sistematik olarak değerlendirilmesini kolaylaştırır. Böyle bir konfigürasyon, potansiyel ışığa duyarlılaştırıcıların kontrollü ve tutarlı bir ortamda yüksek verimli bir şekilde taranmasına izin vererek, daha fazla geliştirme için umut verici adayları belirleme sürecini basitleştirir. Bu esnek platform, antibiyotiğe dirençli enfeksiyonları yönetmek için yenilikçi fotodinamik tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir adım olarak hizmet vermektedir.

Giriş

Fotodinamik tedavi (PDT), son yıllarda özellikle dermatolojik klinik tedavide umut verici sonuçlar gösteren minimal invaziv bir terapötik yaklaşımdır¹. Bu terapötik modalitenin özellikle ilginç bir uygulama alanı, antimikrobiyal fotodinamik inaktivasyon (aPDI) olarak bilinen bir süreç olan mikrobiyal enfeksiyonların ^tedavisidir2. Başlangıçta göz ardı edilmesine rağmen, çoğunlukla antibiyotiklerin kayda değer etkinliği nedeniyle, bakteri büyümesinin ışıkla tetiklenen eradikasyonu, antimikrobiyal çoklu ilaç direncinin (AMR) ortaya çıkması ve bu halk sağlığı sorununu ele almak için alternatif ve etkili stratejiler bulma ihtiyacının etkisiyle son yıllarda yeniden bir ilgi görmüştür ^3,4. Sırasıyla ilgilenilen alanın özel olarak ışınlanması ve prosedürün açma/kapama özelliği ile sunulan uzamsal ve zamansal hassasiyet ile saniyeler veya dakikalar içinde önemli sonuçlar elde edilebilir.

Fotodinamik ilkenin arkasındaki mekanizma, ışığa duyarlı moleküller (ışığa duyarlılaştırıcı), moleküler oksijen ve harici bir ışık kaynağının kombinasyonuna dayanır. Bu üç bileşen zararsız olsa da, bir araya getirildiğinde, ışığa duyarlılaştırıcının fotoaktivasyonu nedeniyle hedef hücreler için öldürücü hale gelebilirler. Işıkla tetiklenen reaksiyonlar, sonuçta önemli hücresel bileşenlerde ciddi ve geri dönüşü olmayan hasara neden olan ve hücre ölümüne^{yol açan büyük} bir reaktif oksijen türü (ROS) oluşumuna neden ^olur. Ayrıca, aPDI'nin diğer geleneksel antimikrobiyal tedavilerle kombinasyonu, daha yüksek tedavi etkinliği, daha az tedavi süresi ve daha düşük ilaç dozajları dahil olmak üzere umut verici terapötik sonuçlar göstermiştir⁷.

Ayrıca, PDT'de ışığa duyarlılaştırıcıların (PS) topikal uygulaması, çevre dokulara minimum hasar ve düşük sistemik etki ile hedefe yönelik tedaviye izin vererek, yüzeysel cilt enfeksiyonlarının tedavisi için iyi takdir edilen bir seçenek haline getirir⁸. Topikal tedavinin rahatlığı ve birçok deri enfeksiyonu ve lezyonunun yüzeyel doğası onu PDT için çekici bir hedef haline getirmektedir. Çalışmalar, yanık enfeksiyonları, cerrahi yara enfeksiyonları, ülsere lezyonlar ve akne ve impetigo gibi diğer yüzeysel rahatsızlıkların tedavisinde aPDI'nin etkinliğini desteklemiştir ^9,10,11.

Hem doğal hem de sentetik çok sayıda molekül aPDI için test edilmiş ve önerilmiştir. Bununla birlikte, deneysel protokollerde değişen ve genellikle belirtilmemiş parametrelerin kullanılması, sonuçları karşılaştırmayı zorlaştırır ve bu da bilimsel bulguların netliğini etkiler. Basit ve tekrarlanabilir testlerin geliştirilmesi, çok sayıda bileşiğin hızlı bir şekilde taranmasını kolaylaştırabilir ve gelecek vaat eden adayların belirlenmesini hızlandırabilir. Basit, tekrarlanabilir ve uygun maliyetli protokoller, sonuçların farklı araştırma tesislerinde karşılaştırılmasını sağladıkları için erken aşama testlerinde özellikle değerlidir. Verimli tarama süreçleri ayrıca daha geniş bir molekül yelpazesini keşfetmeyi kolaylaştırır ve potansiyel olarak daha gelişmiş, karmaşık ve maliyetli metodolojilerde daha fazla test için yeni ışığa duyarlılaştırıcıların keşfedilmesine ve seçilmesine yol açar.

Bu protokol, 25 mW/^cm2 ışık yoğunluğuna sahip bir LED panel kullanarak bakteriler üzerindeki potansiyel ışığa duyarlılaştırıcıların fototoksisitesini değerlendirmek için basit bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. Temsili bir bakteri suşu olan S. aureus kullanıldı ve görünür spektrumun tam kapsamını sunan beyaz ışık kanalı seçildi. Prosedür, 30 dakikalık bir ön inkübasyon periyodu ve ardından 15 dakikalık bir ışığa (22.5 J /^cm2) maruz kalmayı içeriyordu. Sonuçlar bu özel deneysel koşullara dayanmakla birlikte, bireysel protokollere göre uyarlanabilir. Bu ayarların net bir şekilde tanımlanması ve prosedürel açıklamaya dahil edilmesi esastır.

Protokol

Protokolün genel bir açıklaması Şekil 1'de gösterilmiştir. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bakteri kültürü hazırlığı

1. Stok kültürlerinden Mueller-Hinton agar (MH) üzerinde S. aureus (ATCC 29213) bakterilerini büyütün. Taze kültürler elde etmek için MH plakalarını testten önce 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. Bakterileri aşılayın: Agar plakasından 2-3 taze koloni toplayın ve steril filtrelenmiş 6 mL önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 ile seyreltin.
3. Numunenin uygun şekilde homojenizasyonunu sağlamak için aşılamayı 3-4 kez vorteksleyin (1200 rpm). Tek kullanımlık bir küvete 3 mL çekin.
4. OD_600'ü ölçün ve PBS kullanarak 0.1'e (yaklaşık 1 x 10⁸ CFU/mL) ayarlayın.
   NOT: Tam OD'den CFU'ya dönüşüm, S. aureus'un türüne bağlı olarak değişebilir. Spesifik suş ve laboratuvar deney koşulları ile çalışmak için standart bir büyüme eğrisi oluşturulabilir.

2. Işığa duyarlılaştırıcı hazırlama

1. Stok çözeltisi: Uygun bir çözücü (örneğin, DMSO veya PBS; Şekil 2).
2. Çalışma çözümü: Stok çözeltisini PBS'de seyreltin. Bakteriyel kültür ortamı yerine PBS'nin kullanılması, ortamın bileşenlerinin aPDI deneyleri sırasında ışık emilimini engellememesini sağlar.
3. Tam homojenizasyonu sağlamak için numuneyi vorteksleyin. Tam çözünürlüğü garanti etmek ve net bir çözüm elde etmek için gerekirse ultrasonik bir banyo kullanın (bu durumda, dikkatlice kontrol edin. Hidrofobik bileşikler için, çözücü sisteminin ayarlanması gerekebilir (örneğin, bir % DMSO veya etanol eklenmesi). Çözücünün hücresel canlılık üzerindeki etkisinin her zaman kontrol edildiğinden emin olun.
   NOT: Sonikasyon koşulları, bileşiğin türüne, konsantrasyona ve sistem çözücüsüne bağlı olarak değişecektir; Kolayca çözünen bileşikler için daha kısa süreler (örneğin, 5 dakika) yeterli olabilirken, yüksek hidrofobik bileşikler için daha uzun süreler (20-30 dakika) gerekebilir.

3. Plaka kurulumu

1. İki ayrı 96 oyuklu plaka hazırlayın: biri ışığa maruz kalacak ve diğeri karanlıkta tutulacak (karanlık kontrol).
2. Plakaların her birinde, 100 μL ışığa duyarlılaştırıcı çözeltiyi 100 μL bakteri süspansiyonu ile karıştırın. 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
3. Işığa duyarlılaştırıcının bakteri hücreleri ile etkileşime girmesine izin vermek için plakaları önceden belirlenmiş bir aralıkta (bu çalışmada 30 dakikalık bir süre kullanılmıştır) 37 ° C'de inkübe edin.

4. Işınlama

1. Plakaları inkübatörden çıkarın ve bunlardan birini LED panelden yayılan ışığa maruz bırakın (bu deneyde kullanılan cihaz, 50W gücünde dikdörtgen bir LED projektörden oluşuyordu; IP65; giriş voltajı: AC 85-265 V), diğerini ışığa maruz kalmaktan korur.
2. Plakalardan birini LED panelin üzerine yerleştirin. Plakanın birkaç protokol tekrarı ile hassas bir şekilde ayarlanmasını sağlamak için, 96 oyuklu plakanın kenarlarını doğrudan LED yüzeyinde işaretleyin.
3. Plakayı uygun bir ışınlama süresi boyunca maruz bırakın (bu çalışmada 15 dakikalık bir süre kullanılmıştır).
   NOT: Hücresel canlılıktan ödün vermeden ışığa duyarlılaştırıcıyı etkinleştirmek için ışık dozunun yeterli olduğundan emin olun. Bu nedenle, ışık kontrolü dahil edilmelidir (ışığa duyarlılaştırıcı yokluğunda ışığa maruz kalan bakteriler).

5. Işınlama sonrası ve agar plakası örneklemesi

1. Numunelerin seri seyreltmelerini hazırlamak için başka bir 96 oyuklu plaka kullanın (kontroller, ışınlanmamış ve ışınlanmış kuyucuklar).
2. Numune sayısına göre 180 μL PBS/kuyu ekleyin. Yerleşimi doğru bir şekilde tanımlamak için, bir numunenin seri seyreltilmesi için 6 kuyucuklu bir sıranın gerekli olduğunu göz önünde bulundurun (10^−1'den 10^−6'ya kadar 10 kat seyreltme).
3. Her oyuktan (ışınlanmış ve ışınlanmamış 96 oyuklu plakadan) daha önce PBS ile doldurulmuş plakanın ilk sütununa 20 μL alikot.
4. Çok kanallı mikropipet ile kuyu 1'den 6'ya (^{10-1 ila 10-6}) basit bir seri seyreltme gerçekleştirin. NOT: Homojen ve tutarlı bir karışım sağlamak için numune homojenizasyonu bu noktada kritik öneme sahiptir. Her seyreltme adımında 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
5. Agar plakasını altı eşit parçaya bölün, her bölüm seyreltmelerden birine karşılık gelir (bkz. Şekil 3).
6. Her bir oyuktan 10 μL'yi agar plakasının yüzeyindeki ilgili bölüme alikotlayın (her numune için en az 3 kopya ekleyin). Alikotları birbirine çok yakın yerleştirmekten kaçının. Agar plakalarını yavaşça inkübatöre taşıyın ve 18-20 saat bekleyin.
   NOT: CFU'ların morfolojisinin bakteri türlerine bağlı olarak önemli ölçüde değiştiğini göz önünde bulundurun. Örneğin, S. aureus kolonilerinin sayılması nispeten kolayken, P. aeruginosa daha yaygın tip koloniler oluşturma eğilimindedir. Kopya sayısı bu göz önünde bulundurularak ayarlanabilir.

6. Hücresel canlılık tayini (koloni oluşturan birimlerin sayımı)

1. Agar plakalarını inkübatörden çıkarın ve hücre sayımı için uygun alanları seçin.
   NOT: Bol, üst üste binen ve iyi tanımlanmamış kolonilerin bulunduğu bölümlerde saymaktan kaçının.
2. Her bölümde, koloni oluşturan birimlerin (CFU'lar) sayısını sayın ve 3 kopyanın ortalamasını belirleyin
3. Sayılan CFU sayısını CFU/mL'ye dönüştürün, ortalama sayımı seyreltme faktörü ile çarpın ve mL cinsinden kaplanan kültür hacmine bölün.

7. Veri analizi

1. CFU/mL verilerini logaritmik ölçeğe dönüştürün ve günlük₁₀|CFU/mL| test edilen konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak.

Sonuçlar

Amino bazlı flavylium bileşikleri (Şekil 2): 7-dietilaminoflavylium (7NEt₂4′NMe₂), 7-dietilamino-2-(dimetilaminostiril)-1-benzopyrylium (7NEt₂st4′NMe₂), 7-dietilamino-4′-aminoflavylium(7NEt₂4′NH₂) ve ışığa duyarlı doğası daha önce tartışılan 7-dietilamino-4′-hidroksiflavylium (7NEt₂4′OH)^12,13, S...

Tartışmalar

Bu protokol bir başlangıç aşaması test platformu olarak hizmet etse de, daha ileri bir çalışma aşamasında mikrobiyal enfeksiyonların tedavisi için daha anlamlı test koşullarının dikkate alınması önemlidir. aPDI'nin etkinliğini değerlendirirken, planktonik bakterilerden ziyade biyofilm tipi bakteri organizasyonları üzerinde deneyler yapılmalıdır. Birçok klinik vaka, kronik yaralar, kistik fibroz ve implante edilmiş tıbbi cihazlar gibi bu daha dirençli konform...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150