Cribado in vitro basado en LED para la evaluación de moléculas fotoactivables en la inactivación fotodinámica bacteriana

Resumen

Este protocolo describe un método sencillo y económico para evaluar la eficacia de los fotosensibilizadores potenciales en la inactivación fotodinámica antibacteriana (aPDI), utilizando un formato de placa de 96 pocillos combinado con una fuente de luz de panel LED. Este enfoque permite la prueba simultánea de múltiples condiciones experimentales, incluidas diferentes concentraciones, compuestos y cepas bacterianas.

Resumen

El aumento de las infecciones multirresistentes y la falta de nuevas clases de antibióticos han renovado el interés en terapias alternativas como la inactivación fotodinámica de bacterias (aPDI). Este proceso implica la administración de un fotosensibilizador (PS) activado por una fuente de luz visible adecuada, produciendo niveles exacerbados de especies reactivas de oxígeno (ROS) que dañan biomoléculas celulares cruciales, causando en última instancia la muerte de las células bacterianas. Es crucial crear pruebas iniciales estandarizadas, fáciles de usar y reproducibles para evaluar y comparar la efectividad de la fototoxicidad inducida por la luz de los posibles fotosensibilizadores. Este estudio presenta una técnica in vitro sencilla y eficiente para evaluar la actividad fotodinámica frente a células bacterianas planctónicas. Al emplear un formato de microplaca de 96 pocillos junto con un gran panel LED, el sistema facilita la evaluación sistemática de varios compuestos. Esta configuración permite un cribado de alto rendimiento de posibles fotosensibilizadores en un entorno controlado y coherente, lo que simplifica el proceso de identificación de candidatos prometedores para su posterior desarrollo. Esta plataforma flexible es un paso importante para avanzar en el desarrollo de terapias fotodinámicas innovadoras para el tratamiento de infecciones resistentes a los antibióticos.

Introducción

La terapia fotodinámica (TFD) es un abordaje terapéutico mínimamente invasivo que ha mostrado resultados prometedores en los últimos años, especialmente en el tratamiento clínico dermatológico¹. Un área de aplicación particularmente interesante de esta modalidad terapéutica es el tratamiento de las infecciones microbianas, un proceso conocido como inactivación fotodinámica antimicrobiana (aPDI)². Aunque inicialmente se pasó por alto, principalmente debido a la notable eficiencia de los antibióticos, la erradicación del crecimiento bacteriano provocada por la luz experimentó un renovado interés en los últimos años, impulsada por la aparición de la resistencia a los antimicrobianos múltiples (RAM) y la necesidad de encontrar estrategias alternativas y eficientes para abordar este problema de salud pública ^3,4. Se pueden lograr resultados significativos en segundos o minutos, con precisión espacial y temporal ofrecida al irradiar específicamente el área de interés y la función de encendido/apagado del procedimiento, respectivamente.

El mecanismo detrás del principio fotodinámico se basa en la combinación de moléculas sensibles a la luz (fotosensibilizador), oxígeno molecular y una fuente de luz externa. Aunque estos tres componentes son inofensivos, cuando se combinan, pueden volverse letales para las células objetivo debido a la fotoactivación del fotosensibilizador. Las reacciones desencadenadas por la luz dan lugar a una generación masiva de especies reactivas de oxígeno (ROS), que en última instancia causa daños graves e irreversibles en componentes celulares cruciales, lo que conduce a la muerte celular ^5,6. Además, la combinación de aPDI con otros tratamientos antimicrobianos convencionales ha mostrado resultados terapéuticos prometedores, incluyendo una mayor eficacia del tratamiento, un menor tiempo de tratamiento y dosis más bajas de fármacos⁷.

Además, la administración tópica de fotosensibilizadores (PS) en la TFD permite un tratamiento dirigido con un daño mínimo a los tejidos circundantes y bajos efectos sistémicos, lo que la convierte en una opción muy apreciada para el tratamiento de infecciones cutáneas superficiales⁸. La conveniencia del tratamiento tópico y la naturaleza superficial de muchas infecciones y lesiones de la piel lo convierten en un objetivo atractivo para la TFD. Los estudios han respaldado la efectividad de la aPDI en el tratamiento de infecciones por quemaduras, infecciones de heridas quirúrgicas, lesiones ulceradas y otras dolencias superficiales como el acné y el impétigo ^9,10,11.

Numerosas moléculas, tanto naturales como sintéticas, han sido probadas y propuestas para aPDI. Sin embargo, el uso de parámetros variables y a menudo no especificados en los protocolos experimentales dificulta la comparación de los resultados, lo que afecta a la claridad de los hallazgos científicos. El desarrollo de pruebas sencillas y reproducibles puede facilitar la detección rápida de numerosos compuestos, lo que agiliza la identificación de candidatos prometedores. Los protocolos sencillos, reproducibles y rentables son especialmente valiosos en las pruebas en fase inicial, ya que permiten la comparación de los resultados en diferentes centros de investigación. Los procesos de cribado eficientes también facilitan la exploración de una gama más amplia de moléculas, lo que puede conducir al descubrimiento y la selección de nuevos fotosensibilizadores para realizar pruebas adicionales en metodologías más avanzadas, complejas y costosas.

Este protocolo describe un método sencillo para evaluar la fototoxicidad de los posibles fotosensibilizadores sobre las bacterias utilizando un panel LED con una intensidad de luz de 25 mW/^cm2. Se utilizó una cepa bacteriana representativa, S. aureus, y se seleccionó el canal de luz blanca, que ofrece una cobertura completa del espectro visible. El procedimiento implicó un período de preincubación de 30 minutos seguido de una exposición a la luz de 15 minutos (22,5 J/^cm2). Si bien los resultados se basan en estas condiciones experimentales específicas, se pueden adaptar de acuerdo con protocolos individuales. Es esencial definir claramente estos ajustes e incluirlos en la descripción del procedimiento.

Protocolo

En la Figura 1 se ilustra una descripción general del protocolo. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del cultivo bacteriano

1. Cultive bacterias S. aureus (ATCC 29213) en agar Mueller-Hinton (MH) a partir de cultivos de stock. Incubar las placas MH a 37 °C durante 24 h antes del ensayo para obtener cultivos frescos.
2. Inocular bacterias: Recoger 2-3 colonias frescas de la placa de agar y diluir en 6 mL de solución salina precalentada tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4, filtrada estérilmente.
3. Vórtice (1200 rpm) el inóculo 3-4 veces para asegurar una correcta homogeneización de la muestra. Retirar 3 ml a una cubeta desechable.
4. Mida el diámetro exterior_{de 600} y ajústelo a 0,1 (aproximadamente 1 x 10⁸ UFC/mL) utilizando PBS.
   NOTA: La conversión exacta de OD a CFU puede variar según la cepa de S. aureus. Se puede establecer una curva de crecimiento estándar para la cepa específica y las condiciones experimentales de laboratorio con las que se trabaja.

2. Preparación del fotosensibilizador

1. Solución madre: Prepare una solución madre del fotosensibilizador compuesto de interés (consulte la sección Resultados para obtener más detalles) en un disolvente adecuado (por ejemplo, DMSO o PBS; Figura 2).
2. Solución de trabajo: Diluir la solución madre en PBS. El uso de PBS en lugar de medios de cultivo bacterianos garantiza que los componentes del medio no interfieran con la absorción de luz durante los experimentos de aPDI.
3. Agite la muestra para asegurar una homogeneización completa. Utilice un baño ultrasónico si es necesario para garantizar una solubilización completa y lograr una solución clara (en ese caso, controle cuidadosamente. En el caso de los compuestos hidrofóbicos, puede ser necesario ajustar el sistema de disolventes (por ejemplo, añadir un % de DMSO o etanol). Asegúrese de que siempre se comprueba el efecto del disolvente sobre la viabilidad celular.
   NOTA: Las condiciones de sonicación variarán en función del tipo de compuesto, la concentración y el disolvente del sistema; Tiempos más cortos (por ejemplo, 5 min) pueden ser suficientes para compuestos fácilmente solubilizables, mientras que tiempos más largos (20-30 min) pueden ser necesarios para compuestos altamente hidrofóbicos.

3. Configuración de la placa

1. Prepare dos placas separadas de 96 pocillos: una para someterla a una exposición a la luz y otra para mantenerla en la oscuridad (control de oscuridad).
2. En cada una de las placas, mezcle 100 μL de la solución fotosensibilizadora con 100 μL de la suspensión bacteriana. Pipetea hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces.
3. Incubar las placas a 37 °C durante un intervalo predeterminado (en este estudio, se utilizó un período de 30 min) para permitir que el fotosensibilizador interactúe con las células bacterianas.

4. Irradiación

1. Retire las placas de la incubadora y exponga una de ellas a la luz emitida por el panel LED (el dispositivo utilizado en este experimento consistió en un proyector LED rectangular de 50W de potencia; IP65; voltaje de entrada: CA 85-265 V), manteniendo el otro protegido de la exposición a la luz.
2. Coloque una de las placas sobre el panel LED. Para garantizar un ajuste preciso de la placa a través de varias repeticiones de protocolo, marque los bordes de la placa de 96 pocillos directamente en la superficie del LED.
3. Exponga la placa durante un tiempo de irradiación adecuado (en este estudio, se utilizó un período de 15 min).
   NOTA: Asegúrese de que la dosis de luz sea suficiente para activar el fotosensibilizador sin comprometer la viabilidad celular. Por esa razón, se debe incluir el control de la luz (bacterias expuestas a la luz en ausencia de fotosensibilizador).

5. Muestreo posterior a la irradiación y en placa de agar

1. Utilice otra placa de 96 pocillos para preparar las diluciones en serie de las muestras (pocillos control, no irradiados e irradiados).
2. Añadir 180 μL de PBS/pocillo según el número de muestras. Para definir correctamente el diseño, tenga en cuenta que se necesita una fila de 6 pocillos para la dilución en serie de una muestra (dilución de 10 veces, de ^10-1 a ^10-6).
3. Alícuota 20 μL de cada pocillo (de la placa de 96 pocillos irradiada y no irradiada) hasta la primera columna de la placa previamente rellenada con PBS.
4. Con la micropipeta multicanal, realice una dilución en serie simple desde el pocillo 1 hasta el 6 (^10-1 a ^10-6). NOTA: La homogeneización de la muestra es fundamental en este punto para garantizar una mezcla uniforme y consistente. En cada paso de dilución, pipetear hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces.
5. Divida la placa de agar en seis partes iguales, cada sección correspondiente a una de las diluciones (ver Figura 3).
6. Alícuota 10 μL de cada pocillo en la sección correspondiente en la superficie de la placa de agar (para cada muestra, incluir al menos 3 repeticiones). Evite colocar alícuotas demasiado cerca unas de otras. Transporte suavemente las placas de agar a la incubadora y espere 18-20 h.
   NOTA: Tenga en cuenta que la morfología de las UFC varía significativamente según la especie de bacteria. Por ejemplo, mientras que las colonias de S. aureus son relativamente fáciles de contar, P. aeruginosa tiende a formar colonias de tipo más difuso. Teniendo en cuenta esto, el número de réplicas podría ajustarse.

6. Determinación de la viabilidad celular (conteo de unidades formadoras de colonias)

1. Retire las placas de agar de la incubadora y seleccione las áreas adecuadas para el recuento de células.
   NOTA: Evite contar dentro de secciones con colonias abundantes, superpuestas y no bien definidas.
2. Dentro de cada sección, cuente el número de unidades formadoras de colonias (UFC) y determine el promedio de las 3 réplicas
3. Convierta el número de UFC contadas a UFC/mL, multiplicando el conteo promedio por el factor de dilución y dividiendo por el volumen de cultivo sembrado en mL.

7. Análisis de datos

1. Convierta los datos de UFC/mL a la escala logarítmica y represente la viabilidad celular en log₁₀|UFC/mL| en función de la concentración ensayada.

Resultados

Compuestos de flavilio a base de amino (Figura 2): 7-dietilamino-4′-dimetilaminoflavilio (7NEt₂4′NMe₂), 7-dietilamino-2-(dimetilaminostiril)-1-benzopirilio (7NEt₂st4′NMe₂), 7-dietilamino-4′-aminoflavilio (7NEt₂4′NH₂) y 7-dietilamino-4′-hidroxiflavilio (7NEt₂4′OH), cuya naturaleza sensible a la luz se discutió anteriormente^12,13

Discusión

Aunque este protocolo sirve como una plataforma de prueba de etapa inicial, es importante considerar condiciones de prueba más significativas para el tratamiento de infecciones microbianas en una fase de estudio más avanzada. Al evaluar la eficacia de la aPDI, se deben realizar experimentos con organizaciones bacterianas de tipo biopelícula en lugar de bacterias planctónicas. Muchos casos clínicos involucran microorganismos organizados en esta conformación más resistente, como her...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150