박테리아 광역학 불활성화에서 광활성 분자를 평가하기 위한 LED 기반 체외 스크리닝

요약

이 프로토콜은 LED 패널 광원과 결합된 96웰 플레이트 형식을 사용하여 항균 광역학 불활성화(aPDI)에서 잠재적인 광감작제의 효과를 평가하기 위한 간단하고 경제적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 다양한 농도, 화합물 및 박테리아 균주를 포함한 여러 실험 조건을 동시에 테스트할 수 있습니다.

초록

다제내성 감염의 증가와 새로운 항생제 계열의 부족으로 인해 박테리아의 광역학적 불활성화(aPDI)와 같은 대체 요법에 대한 관심이 다시 높아졌습니다. 이 과정에는 적절한 가시광선에 의해 활성화되는 광감작제(PS)의 투여가 포함되며, 이는 중요한 세포 생체 분자를 손상시켜 궁극적으로 박테리아 세포 사멸을 유발하는 악화된 수준의 활성 산소 종(ROS)을 생성합니다. 잠재적인 광감작제의 광 유도 광독성의 효과를 평가하고 비교하기 위해 표준화되고 사용하기 쉽고 재현 가능한 초기 테스트를 만드는 것이 중요합니다. 이 연구는 플랑크톤 박테리아 세포에 대한 광역학 활성을 평가하기 위한 간단하고 효율적인 체외 기술을 소개합니다. 이 시스템은 대형 LED 패널과 함께 96웰 마이크로플레이트 형식을 사용하여 다양한 화합물의 체계적인 평가를 용이하게 합니다. 이러한 구성을 통해 통제되고 일관된 환경에서 잠재적인 광감작제의 고처리량 스크리닝이 가능하여 추가 개발을 위한 유망한 후보 물질을 식별하는 프로세스를 단순화할 수 있습니다. 이 유연한 플랫폼은 항생제 내성 감염을 관리하기 위한 혁신적인 광역학 요법의 개발을 진전시키는 데 중요한 역할을 합니다.

서문

광역학 요법(PDT)은 최근 몇 년 동안 특히 피부과 임상 치료에서 유망한 결과를 보여준 최소 침습 치료법입니다¹. 이 치료 양식의 응용 분야 중 특히 흥미로운 분야 중 하나는 항균 광역학 불활성화(^aPDI)2로 알려진 과정인 미생물 감염 치료입니다. 처음에는 항생제의 놀라운 효능 때문에 간과되었지만, 항생제 다제내성(AMR)의 출현과 이러한 공중 보건 문제를 해결하기 위한 대안적이고 효율적인 전략을 찾아야 할 필요성에 따라 최근 몇 년 동안 광으로 인한 박테리아 성장 박멸에 대한 관심이 다시 높아졌습니다 ^3,4. 몇 초 또는 몇 분 내에 유의미한 결과를 얻을 수 있으며, 관심 영역과 절차의 켜기/끄기 기능을 각각 구체적으로 조사하여 제공되는 공간적 및 시간적 정밀도를 제공합니다.

광역학 원리의 배후에 있는 메커니즘은 빛에 민감한 분자(광감작제), 분자 산소 및 외부 광원의 조합에 의존합니다. 이 세 가지 구성 요소는 무해하지만 결합하면 광감작제의 광활성화로 인해 표적 세포에 치명적일 수 있습니다. 빛에 의한 반응은 반응성 산소종(ROS)을 대량으로 생성하며, 이는 궁극적으로 중요한 세포 구성 요소에 심각하고 돌이킬 수 없는 손상을 일으켜 세포 사멸을 초래합니다 ^5,6. 또한, aPDI와 기존의 다른 항균 치료제의 병용요법은 더 높은 치료 효능, 더 낮은 치료 시간, 더 낮은 약물 투여량 등 유망한 치료 결과를 보여주었다⁷.

또한, PDT에 광감작제(PS)를 국소적으로 투여하면 주변 조직에 대한 손상을 최소화하고 전신 효과를 낮추면서 표적 치료가 가능하여 표재성 피부 감염 치료에 매우 적합합니다⁸. 국소 치료의 편리함과 많은 피부 감염 및 병변의 표면적 특성으로 인해 PDT의 매력적인 표적이 됩니다. 연구에 따르면 화상 감염, 외과적 상처 감염, 궤양 병변 및 여드름 및 농가진과 같은 기타 표재성 질환 치료에 있어 aPDI의 효과가 입증되었습니다 ^9,10,11.

천연 및 합성 분자를 포함한 수많은 분자가 aPDI에 대해 테스트되고 제안되었습니다. 그러나 실험 프로토콜에서 다양하고 종종 지정되지 않은 매개변수를 사용하면 결과를 비교하기가 어려워지며, 이는 과학적 발견의 명확성에 영향을 미칩니다. 간단하고 재현 가능한 테스트를 개발하면 수많은 화합물을 신속하게 스크리닝할 수 있어 유망한 후보 물질을 신속하게 식별할 수 있습니다. 간단하고 재현 가능하며 비용 효율적인 프로토콜은 서로 다른 연구 시설의 결과를 비교할 수 있기 때문에 초기 단계 테스트에서 특히 유용합니다. 효율적인 스크리닝 프로세스는 또한 더 넓은 범위의 분자를 더 쉽게 탐색할 수 있도록 하여 잠재적으로 보다 발전되고 복잡하며 비용이 많이 드는 방법론에서 추가 테스트를 위한 새로운 광감작제의 발견 및 선택으로 이어질 수 있습니다.

이 프로토콜은 광도가 25mW/^cm2인 LED 패널을 사용하여 박테리아에 대한 잠재적인 광감작제의 광독성을 평가하는 간단한 방법을 설명합니다. 대표적인 박테리아 균주인 S. aureus를 사용했으며, 가시 스펙트럼을 완전히 커버할 수 있는 백색광 채널을 선택했습니다. 이 절차에는 30분의 사전 배양 기간과 15분의 빛(22.5 J/cm²)에 노출되는 것이 포함되었습니다. 결과는 이러한 특정 실험 조건을 기반으로 하지만 개별 프로토콜에 따라 조정할 수 있습니다. 이러한 설정을 명확하게 정의하고 절차 설명에 포함하는 것이 중요합니다.

프로토콜

프로토콜에 대한 전반적인 설명은 그림 1에 나와 있습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 세균 배양 준비

1. 스톡 배양에서 Mueller-Hinton 한천(MH)에 S. aureus (ATCC 29213) 박테리아를 성장시킵니다. 새로운 배양물을 얻기 위해 분석 전에 37°C에서 24시간 동안 MH 플레이트를 배양합니다.
2. 박테리아 접종: 한천 플레이트에서 2-3개의 신선한 콜로니를 수집하고 멸균 여과된 예열 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4 6mL로 희석합니다.
3. 와류(1200rpm)를 접종하여 시료의 적절한 균질화를 보장합니다. 3mL를 일회용 큐벳에 넣습니다.
4. OD₆₀₀ 을 측정하고 PBS를 사용하여 0.1(약 1 x 10^8CFU /mL)로 조정합니다.
   참고: 정확한 OD에서 CFU로의 변환은 S. aureus의 균주에 따라 달라질 수 있습니다. 작업하는 특정 균주 및 실험실 실험 조건에 대한 표준 성장 곡선을 설정할 수 있습니다.

2. 광감작제 준비

1. 원액(stock solution): 적절한 용매(예: DMSO 또는 PBS)에서 관심 화합물 광감작제(자세한 내용은 결과 섹션 참조)의 원액을 준비합니다. 그림 2).
2. 작업 솔루션: PBS에서 원액을 희석합니다. 박테리아 배양 배지 대신 PBS를 사용하면 배지의 구성 요소가 aPDI 실험 중에 광 흡수를 방해하지 않습니다.
3. 완전한 균질화를 보장하기 위해 샘플을 소용돌이치십시오. 완전한 용해를 보장하고 명확한 용액을 얻기 위해 필요한 경우 초음파 수조를 사용하십시오 (이 경우 조심스럽게 제어하십시오. 소수성 화합물의 경우 용매 시스템의 조정이 필요할 수 있습니다(예: DMSO 또는 에탄올 % 추가). 세포 생존율에 대한 용매의 영향을 항상 확인하십시오.
   참고 : 초음파 처리 조건은 화합물의 유형, 농도 및 시스템 용매에 따라 달라집니다. 쉽게 용해되는 화합물의 경우 더 짧은 시간(예: 5분)이 충분할 수 있는 반면, 소수성이 높은 화합물의 경우 더 긴 시간(20-30분)이 필요할 수 있습니다.

3. 플레이트 설정

1. 두 개의 별도 96웰 플레이트를 준비합니다: 하나는 빛에 노출되고 다른 하나는 어두운 곳에 보관됩니다(어두운 제어).
2. 각 플레이트에서 100μL의 광감작 용액과 100μL의 박테리아 현탁액을 혼합합니다. 피펫을 위아래로 5-10 번.
3. 광감작제가 박테리아 세포와 상호 작용할 수 있도록 미리 결정된 간격(이 연구에서는 30분의 기간이 사용됨) 동안 플레이트를 37°C에서 배양합니다.

4. 조사

1. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 그 중 하나를 LED 패널에서 방출되는 빛에 노출시킵니다(이 실험에 사용된 장치는 50W 전력의 직사각형 LED 프로젝터로 구성되었습니다. IP65; 입력 볼륨tage: AC 85-265V), 다른 하나를 빛 노출로부터 보호합니다.
2. 플레이트 중 하나를 LED 패널 위에 놓습니다. 여러 프로토콜 반복을 통해 플레이트를 정밀하게 조정하려면 96웰 플레이트의 가장자리를 LED 표면에 직접 표시하십시오.
3. 적절한 조사 시간 동안 플레이트를 노출시킵니다(이 연구에서는 15분의 기간이 사용됨).
   참고: 광량이 세포 생존력을 손상시키지 않고 광감작제를 활성화하기에 충분한지 확인하십시오. 이러한 이유로 광 제어가 포함되어야 합니다(광감작제가 없는 경우 빛에 노출되는 박테리아).

5. 방사선 조사 후 및 한천 플레이트 샘플링

1. 다른 96웰 플레이트를 사용하여 샘플의 연속 희석액(대조군, 조사되지 않은 웰 및 조사된 웰)을 준비합니다.
2. 샘플 수에 따라 180μL의 PBS/well을 추가합니다. 레이아웃을 적절하게 정의하려면 한 샘플의 연속 희석(^{10-1에서 10-6}까지 10배 희석)을 위해 6개의 웰 행이 필요하다는 점을 ^{고려하십시오.}
3. 각 웰(조사된 96웰 플레이트와 조사되지 않은 96웰 플레이트로부터)에서 이전에 PBS로 채워진 플레이트의 첫 번째 컬럼까지 20μL를 분취합니다.
4. 멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 웰 1에서 6까지(^10-1 에서 ^10-6까지) 간단한 연속 희석을 수행합니다. 참고: 이 시점에서 시료 균질화는 균일하고 일관된 혼합물을 보장하는 데 중요합니다. 모든 희석 단계에서 피펫을 5-10회 위아래로 움직입니다.
5. 한천 플레이트를 6개의 동일한 부분으로 나누고 각 섹션은 희석액 중 하나에 해당합니다( 그림 3 참조).
6. 각 웰에서 한천 플레이트 표면의 해당 섹션으로 10μL를 분취합니다(각 샘플에 대해 최소 3회 반복 포함). 부분 표본을 서로 너무 가깝게 두지 마십시오. 한천 플레이트를 인큐베이터로 부드럽게 운반하고 18-20 시간 동안 기다립니다.
   참고: CFU의 형태는 박테리아 종에 따라 크게 다르다는 점을 고려하십시오. 예를 들어, S. aureus 군체는 비교적 계수하기 쉽지만 녹농균은 더 확산형 군체를 형성하는 경향이 있습니다. 이를 고려하여 반복 횟수를 조정할 수 있습니다.

6. 세포 생존율 측정(집락 형성 단위 계산)

1. 인큐베이터에서 한천 플레이트를 제거하고 세포 계수에 적합한 영역을 선택합니다.
   참고: 풍부하고, 겹치고, 잘 정의되지 않은 군체가 있는 섹션 내에서 계산하지 마십시오.
2. 각 섹션 내에서 CFU(Colony Forming Unit)의 수를 세고 3회 반복의 평균을 결정합니다
3. 계수된 CFU의 수를 CFU/mL로 변환하고, 평균 계수에 희석 계수를 곱하고 배양액을 mL 단위로 도금한 부피로 나눕니다.

7. 데이터 분석

1. CFU/mL의 데이터를 로그 스케일로 변환하고 log₁₀|CFU/mL| 테스트된 농도의 함수로.

결과

아미노 기반 플라빌리움 화합물(그림 2): 7-디에틸아미노-4'-디메틸아미노플라빌리움(7NEt₂4'NMe₂), 7-디에틸아미노-2-(디메틸아미노스티릴)-1-벤조피릴륨(7NEt₂st4'NMe₂), 7-디에틸아미노-4'-아미노플라빌리움(7NEt₂4'NH₂) 및 7-디에틸아미노-4'-하이드록시플라빌륨(7NEt₂4'OH)은 이전에 광 반응 특성이 논의된<...

토론

이 프로토콜은 초기 단계 테스트 플랫폼 역할을 하지만, 보다 발전된 연구 단계에서 미생물 감염 치료를 위한 보다 의미 있는 테스트 조건을 고려하는 것이 중요합니다. aPDI의 효과를 평가할 때는 플랑크톤 박테리아가 아닌 생물막 유형의 박테리아 조직에 대한 실험을 수행해야 합니다. 많은 임상 사례는 만성 상처, 낭포성 섬유증 및 이식된 의료 기기와 같이 더 내성이 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150