Triagem in vitro baseada em LED para avaliação de moléculas fotoativáveis na inativação fotodinâmica bacteriana

Resumo

Este protocolo descreve um método simples e econômico para avaliar a eficácia de potenciais fotossensibilizadores na inativação fotodinâmica antibacteriana (aPDI), usando um formato de placa de 96 poços combinado com uma fonte de luz de painel de LED. Essa abordagem permite o teste simultâneo de várias condições experimentais, incluindo diferentes concentrações, compostos e cepas bacterianas.

Resumo

O aumento de infecções multirresistentes e a falta de novas classes de antibióticos renovaram o interesse em terapias alternativas, como a inativação fotodinâmica de bactérias (aPDI). Este processo envolve a administração de um fotossensibilizador (PS) ativado por uma fonte de luz visível adequada, produzindo níveis exacerbados de espécies reativas de oxigênio (ROS) que danificam biomoléculas celulares cruciais, causando a morte celular bacteriana. É crucial criar testes iniciais padronizados, fáceis de usar e reprodutíveis para avaliar e comparar a eficácia da fototoxicidade induzida pela luz de potenciais fotossensibilizadores. Este estudo apresenta uma técnica in vitro simples e eficiente para avaliar a atividade fotodinâmica contra células bacterianas planctônicas. Ao empregar um formato de microplaca de 96 poços junto com um grande painel de LED, o sistema facilita a avaliação sistemática de vários compostos. Essa configuração permite a triagem de alto rendimento de potenciais fotossensibilizadores em um ambiente controlado e consistente, simplificando o processo de identificação de candidatos promissores para desenvolvimento posterior. Essa plataforma flexível serve como um passo importante no avanço do desenvolvimento de terapias fotodinâmicas inovadoras para o gerenciamento de infecções resistentes a antibióticos.

Introdução

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma abordagem terapêutica minimamente invasiva que tem mostrado resultados promissores nos últimos anos, particularmente no tratamento clínico dermatológico¹. Uma área de aplicação particularmente interessante dessa modalidade terapêutica é o tratamento de infecções microbianas, um processo conhecido como inativação fotodinâmica antimicrobiana (aPDI)². Embora inicialmente negligenciada, principalmente devido à notável eficiência dos antibióticos, a erradicação do crescimento bacteriano desencadeada pela luz passou por um interesse renovado nos últimos anos, impulsionado pelo surgimento da multirresistência antimicrobiana (AMR) e pela necessidade de encontrar estratégias alternativas e eficientes para lidar com esse problema de saúde pública ^3,4. Resultados significativos podem ser alcançados em segundos ou minutos, com precisão espacial e temporal oferecida pela irradiação específica da área de interesse e do recurso liga/desliga do procedimento, respectivamente.

O mecanismo por trás do princípio fotodinâmico depende da combinação de moléculas sensíveis à luz (fotossensibilizador), oxigênio molecular e uma fonte de luz externa. Embora esses três componentes sejam inofensivos, quando combinados, eles podem se tornar letais para as células-alvo devido à fotoativação do fotossensibilizador. As reações desencadeadas pela luz resultam em uma geração massiva de espécies reativas de oxigênio (ROS), que acabam causando danos graves e irreversíveis em componentes celulares cruciais, levando à morte celular ^5,6. Além disso, a combinação de aPDI com outros tratamentos antimicrobianos convencionais mostrou resultados terapêuticos promissores, incluindo maior eficácia do tratamento, tempo de tratamento reduzido e dosagens mais baixas do medicamento⁷.

Além disso, a administração tópica de fotossensibilizadores (PS) na TFD permite um tratamento direcionado com danos mínimos aos tecidos circundantes e baixos efeitos sistêmicos, tornando-se uma opção muito apreciada para o tratamento de infecções superficiais da pele⁸. A conveniência do tratamento tópico e a natureza superficial de muitas infecções e lesões de pele o tornam um alvo atraente para a TFD. Estudos têm apoiado a eficácia da aPDI no tratamento de infecções por queimaduras, infecções de feridas cirúrgicas, lesões ulceradas e outras doenças superficiais, como acne e impetigo ^9,10,11.

Numerosas moléculas, naturais e sintéticas, foram testadas e propostas para aPDI. No entanto, o uso de parâmetros variados e muitas vezes não especificados em protocolos experimentais dificulta a comparação dos resultados, o que afeta a clareza dos achados científicos. O desenvolvimento de testes simples e reprodutíveis pode facilitar a triagem rápida de vários compostos, agilizando a identificação de candidatos promissores. Protocolos simples, reprodutíveis e econômicos são especialmente valiosos em testes em estágio inicial, pois permitem a comparação de resultados em diferentes instalações de pesquisa. Processos de triagem eficientes também facilitam a exploração de uma gama mais ampla de moléculas, potencialmente levando à descoberta e seleção de novos fotossensibilizadores para testes adicionais em metodologias mais avançadas, complexas e caras.

Este protocolo descreve um método simples para avaliar a fototoxicidade de potenciais fotossensibilizadores em bactérias usando um painel de LED com intensidade de luz de 25 mW/cm². Uma cepa bacteriana representativa, S. aureus, foi usada, e o canal de luz branca foi selecionado, oferecendo cobertura total do espectro visível. O procedimento envolveu um período de pré-incubação de 30 minutos, seguido de uma exposição de 15 minutos à luz (22,5 J/^cm2). Embora os resultados sejam baseados nessas condições experimentais específicas, eles podem ser adaptados de acordo com protocolos individuais. É essencial definir claramente essas configurações e incluí-las na descrição do procedimento.

Protocolo

Uma descrição geral do protocolo é ilustrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da cultura bacteriana

1. Cultive bactérias S. aureus (ATCC 29213) em ágar Mueller-Hinton (MH) a partir de culturas de estoque. Incubar as placas MH a 37 °C durante 24 h antes do ensaio para obter culturas frescas.
2. Inocular bactérias: Colete 2-3 colônias frescas da placa de ágar e dilua em 6 mL de solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS) pH 7,4, filtrada estéril.
3. Vórtice (1200 rpm) o inóculo 3-4 vezes para garantir a homogeneização adequada da amostra. Retire 3 mL para uma cubeta descartável.
4. Meça OD₆₀₀ e ajuste-o para 0,1 (aproximadamente 1 x 10⁸ UFC/mL) usando PBS.
   NOTA: A conversão exata de OD para UFC pode variar de acordo com a cepa de S. aureus. Pode-se estabelecer uma curva de crescimento padrão para a cepa específica e as condições experimentais de laboratório com as quais trabalha.

2. Preparação do fotossensibilizador

1. Solução estoque: Prepare uma solução estoque do fotossensibilizador composto de interesse (consulte a seção Resultados para obter detalhes) em um solvente apropriado (por exemplo, DMSO ou PBS; Figura 2).
2. Solução de trabalho: Diluir a solução-mãe em PBS. O uso de PBS em vez de meios de cultura bacterianos garante que os componentes do meio não interfiram na absorção de luz durante os experimentos de aPDI.
3. Vortex a amostra para garantir a homogeneização completa. Use um banho ultrassônico, se necessário, para garantir a solubilização completa e obter uma solução clara (nesse caso, controle cuidadosamente. Para compostos hidrofóbicos, pode ser necessário ajustar o sistema de solvente (por exemplo, adicionar uma % de DMSO ou etanol). Certifique-se de que o efeito do solvente na viabilidade celular seja sempre verificado.
   NOTA: As condições de sonicação variam dependendo do tipo de composto, concentração e solvente do sistema; Tempos mais curtos (por exemplo, 5 min) podem ser suficientes para compostos facilmente solubilizados, enquanto tempos mais longos (20-30 min) podem ser necessários para compostos altamente hidrofóbicos.

3. Configuração da placa

1. Prepare duas placas separadas de 96 poços: uma para ser exposta à luz e outra para ser mantida no escuro (controle escuro).
2. Em cada uma das placas, misturar 100 μL da solução fotossensibilizadora com 100 μL da suspensão bacteriana. Pipete para cima e para baixo 5 a 10 vezes.
3. Incubar as placas a 37 °C por um intervalo pré-determinado (neste estudo, foi utilizado um período de 30 min) para permitir que o fotossensibilizador interaja com as células bacterianas.

4. Irradiação

1. Retire as placas da incubadora e exponha uma delas à luz emitida pelo painel de LED (o dispositivo utilizado neste experimento consistia em um projetor LED retangular de 50W de potência; IP65; tensão de entrada: AC 85-265 V), mantendo a outra protegida da exposição à luz.
2. Coloque uma das placas acima do painel de LED. Para garantir o ajuste preciso da placa por meio de várias repetições de protocolo, marque as bordas da placa de 96 poços diretamente na superfície do LED.
3. Exponha a placa por um tempo de irradiação adequado (neste estudo, foi utilizado um período de 15 min).
   NOTA: Certifique-se de que a dose de luz seja suficiente para ativar o fotossensibilizador sem comprometer a viabilidade celular. Por esse motivo, o controle de luz deve ser incluído (bactérias expostas à luz na ausência de fotossensibilizador).

5. Amostragem pós-irradiação e placa de ágar

1. Use outra placa de 96 poços para preparar as diluições seriadas das amostras (controles, poços não irradiados e irradiados).
2. Adicionar 180 μL de PBS/poço de acordo com o número de amostras. Para definir corretamente o layout, leve em consideração que uma fileira de 6 poços é necessária para a diluição em série de uma amostra (diluição de 10 vezes, de 10⁻¹ a 10⁻⁶).
3. Alíquota de 20 μL de cada poço (da placa de 96 poços irradiada e não irradiada) até a primeira coluna da placa previamente preenchida com PBS.
4. Com a micropipeta multicanal, execute uma diluição serial simples do poço 1 ao 6 (^10-1 a ^10-6). NOTA: A homogeneização da amostra é crítica neste ponto para garantir uma mistura uniforme e consistente. Em cada etapa de diluição, pipetar para cima e para baixo 5 a 10 vezes.
5. Dividir a placa de ágar-ágar em seis partes iguais, correspondendo cada secção a uma das diluições (ver figura 3).
6. Alíquota de 10 μl de cada alvéolo para a secção correspondente na superfície da placa de ágar (incluir, para cada amostra, pelo menos 3 réplicas). Evite colocar alíquotas muito próximas umas das outras. Transporte suavemente as placas de ágar para a incubadora e aguarde 18-20 h.
   NOTA: Leve em consideração que a morfologia das UFCs varia significativamente dependendo da espécie de bactéria. Por exemplo, enquanto as colônias de S. aureus são relativamente fáceis de contar, P. aeruginosa tende a formar colônias mais difusas. O número de repetições pode ser ajustado considerando isso.

6. Determinação da viabilidade celular (contagem de unidades formadoras de colónias)

1. Remova as placas de ágar da incubadora e selecione as áreas adequadas para a contagem de células.
   NOTA: Evite contar dentro de seções com colônias abundantes, sobrepostas e não bem definidas.
2. Dentro de cada seção, conte o número de unidades formadoras de colônias (UFCs) e determine a média das 3 réplicas
3. Converter o número de UFC contado em UFC/ml, multiplicando a contagem média pelo factor de diluição e dividindo pelo volume de cultura plaqueada em ml.

7. Análise dos dados

1. Converta os dados de UFC/mL para a escala logarítmica e represente a viabilidade celular em log₁₀|UFC/mL| em função da concentração ensaiada.

Resultados

Compostos flavílicos à base de aminoácidos (Figura 2): 7-dietilamino-4′-dimetilaminoflavílio (7NEt₂4′NMe₂), 7-dietilamino-2-(dimetilaminoestiril)-1-benzopirílio (7NEt₂st4′NMe₂), 7-dietilamino-4′-aminoflavilium (7NEt₂4′NH₂) e 7-dietilamino-4′-hidroxiflavílio (7NEt₂4′OH), cuja natureza responsiva à luz foi discutida anteriormente^12,13<...

Discussão

Embora este protocolo sirva como uma plataforma de teste em estágio inicial, é importante considerar condições de teste mais significativas para o tratamento de infecções microbianas em uma fase de estudo mais avançada. Ao avaliar a eficácia da aPDI, experimentos em organizações bacterianas do tipo biofilme em vez de bactérias planctônicas devem ser conduzidos. Muitos casos clínicos envolvem microrganismos organizados nessa conformação mais resistente, como feridas crônic...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150