Screening in vitro basato su LED per la valutazione di molecole fotoattivabili nell'inattivazione fotodinamica batterica

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo semplice ed economico per valutare l'efficacia di potenziali fotosensibilizzatori nell'inattivazione fotodinamica antibatterica (aPDI), utilizzando un formato di piastra a 96 pozzetti combinato con una sorgente luminosa a pannello LED. Questo approccio consente di testare simultaneamente più condizioni sperimentali, tra cui diverse concentrazioni, composti e ceppi batterici.

Abstract

L'aumento delle infezioni multiresistenti ai farmaci e la mancanza di nuove classi di antibiotici hanno rinnovato l'interesse per terapie alternative come l'inattivazione fotodinamica dei batteri (aPDI). Questo processo prevede la somministrazione di un fotosensibilizzatore (PS) attivato da un'adeguata sorgente di luce visibile, che produce livelli esacerbati di specie reattive dell'ossigeno (ROS) che danneggiano le biomolecole cellulari cruciali, causando infine la morte delle cellule batteriche. È fondamentale creare test iniziali standardizzati, facili da usare e riproducibili per valutare e confrontare l'efficacia della fototossicità indotta dalla luce di potenziali fotosensibilizzanti. Questo studio introduce una tecnica in vitro semplice ed efficace per valutare l'attività fotodinamica contro le cellule batteriche planctoniche. Utilizzando un formato di micropiastra a 96 pozzetti insieme a un ampio pannello LED, il sistema facilita la valutazione sistematica di vari composti. Tale configurazione consente lo screening ad alto rendimento di potenziali fotosensibilizzatori in un ambiente controllato e coerente, semplificando il processo di identificazione di candidati promettenti per un ulteriore sviluppo. Questa piattaforma flessibile rappresenta un passo importante per far progredire lo sviluppo di terapie fotodinamiche innovative per la gestione delle infezioni resistenti agli antibiotici.

Introduzione

La terapia fotodinamica (PDT) è un approccio terapeutico minimamente invasivo che ha mostrato risultati promettenti negli ultimi anni, in particolare nel trattamento clinico dermatologico¹. Un'area di applicazione particolarmente interessante di questa modalità terapeutica è il trattamento delle infezioni microbiche, un processo noto come inattivazione fotodinamica antimicrobica (aPDI)². Sebbene inizialmente trascurata, soprattutto a causa della notevole efficienza degli antibiotici, l'eradicazione della crescita batterica innescata dalla luce ha subito un rinnovato interesse negli ultimi anni, guidata dall'emergere della resistenza multifarmaco antimicrobica (AMR) e dalla necessità di trovare strategie alternative ed efficienti per affrontare questo problema di salute pubblica ^3,4. È possibile ottenere risultati significativi in pochi secondi o minuti, con una precisione spaziale e temporale offerta dall'irradiazione specifica dell'area di interesse e della funzione di accensione/spegnimento della procedura, rispettivamente.

Il meccanismo alla base del principio fotodinamico si basa sulla combinazione di molecole sensibili alla luce (fotosensibilizzatore), ossigeno molecolare e una sorgente di luce esterna. Sebbene questi tre componenti siano innocui, se combinati, potrebbero diventare letali per le cellule bersaglio a causa della fotoattivazione del fotosensibilizzatore. Le reazioni innescate dalla luce provocano una massiccia generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che alla fine provoca danni gravi e irreversibili nei componenti cellulari cruciali, portando alla morte cellulare ^5,6. Inoltre, la combinazione di aPDI con altri trattamenti antimicrobici convenzionali ha mostrato risultati terapeutici promettenti, tra cui una maggiore efficacia del trattamento, tempi di trattamento ridotti e dosaggi di farmaci più bassi⁷.

Inoltre, la somministrazione topica di fotosensibilizzanti (PS) nella PDT consente un trattamento mirato con danni minimi ai tessuti circostanti e bassi effetti sistemici, rendendola un'opzione molto apprezzata per il trattamento delle infezioni cutanee superficiali⁸. La praticità del trattamento topico e la natura superficiale di molte infezioni e lesioni cutanee lo rendono un bersaglio attraente per la PDT. Gli studi hanno supportato l'efficacia dell'aPDI nel trattamento delle infezioni da ustione, delle infezioni delle ferite chirurgiche, delle lesioni ulcerate e di altri disturbi superficiali come l'acne e l'impetigine ^9,10,11.

Numerose molecole, sia naturali che sintetiche, sono state testate e proposte per l'aPDI. Tuttavia, l'uso di parametri variabili e spesso non specificati nei protocolli sperimentali rende difficile il confronto dei risultati, il che influisce sulla chiarezza dei risultati scientifici. Lo sviluppo di test semplici e riproducibili può facilitare lo screening rapido di numerosi composti, accelerando l'identificazione di candidati promettenti. I protocolli semplici, riproducibili ed economici sono particolarmente preziosi nei test in fase iniziale, in quanto consentono il confronto dei risultati tra diverse strutture di ricerca. Processi di screening efficienti facilitano anche l'esplorazione di una gamma più ampia di molecole, portando potenzialmente alla scoperta e alla selezione di nuovi fotosensibilizzatori per ulteriori test in metodologie più avanzate, complesse e costose.

Questo protocollo delinea un metodo semplice per valutare la fototossicità di potenziali fotosensibilizzatori sui batteri utilizzando un pannello LED con un'intensità luminosa di 25 mW/cm². È stato utilizzato un ceppo batterico rappresentativo, S. aureus, ed è stato selezionato il canale della luce bianca, offrendo una copertura completa dello spettro visibile. La procedura prevedeva un periodo di pre-incubazione di 30 minuti seguito da un'esposizione alla luce di 15 minuti (22,5 J/cm²). Sebbene i risultati si basino su queste specifiche condizioni sperimentali, possono essere adattati in base a protocolli individuali. È essenziale definire chiaramente queste impostazioni e includerle nella descrizione procedurale.

Protocollo

Una descrizione generale del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione della coltura batterica

1. Coltiva i batteri S. aureus (ATCC 29213) su agar Mueller-Hinton (MH) da colture stock. Incubare le piastre MH a 37 °C per 24 ore prima del saggio per ottenere colture fresche.
2. Inoculare i batteri: Raccogliere 2-3 colonie fresche dalla piastra di agar e diluirle in 6 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata a pH 7,4, filtrata in modo sterile.
3. Agitare (1200 giri/min) l'inoculo 3-4 volte per garantire una corretta omogeneizzazione del campione. Prelevare 3 ml in una cuvetta monouso.
4. Misurare OD₆₀₀ e regolarlo su 0,1 (circa 1 x 10⁸ CFU/mL) utilizzando PBS.
   NOTA: L'esatta conversione da OD a CFU può variare in base al ceppo di S. aureus. È possibile stabilire una curva di crescita standard per il ceppo specifico e le condizioni sperimentali di laboratorio con cui si lavora.

2. Preparazione del fotosensibilizzante

1. Soluzione madre: Preparare una soluzione madre del composto di interesse fotosensibilizzante (vedere la sezione Risultati per i dettagli) in un solvente appropriato (ad es. DMSO o PBS; Figura 2).
2. Soluzione di lavoro: Diluire la soluzione madre in PBS. L'uso di PBS piuttosto che di terreni di coltura batterica garantisce che i componenti del terreno non interferiscano con l'assorbimento della luce durante gli esperimenti aPDI.
3. Agitare il campione per garantire una completa omogeneizzazione. Se necessario, utilizzare un bagno a ultrasuoni per garantire la completa solubilizzazione e ottenere una soluzione limpida (in tal caso, controllare attentamente. Per i composti idrofobici, potrebbe essere necessaria una regolazione del sistema solvente (ad esempio, l'aggiunta di una % di DMSO o etanolo). Assicurarsi che l'effetto del solvente sulla vitalità cellulare sia sempre controllato.
   NOTA: Le condizioni per la sonicazione variano a seconda del tipo di composto, della concentrazione e del solvente del sistema; Tempi più brevi (ad esempio, 5 minuti) potrebbero essere sufficienti per composti facilmente solubilizzabili, mentre tempi più lunghi (20-30 minuti) potrebbero essere necessari per composti altamente idrofobici.

3. Impostazione della piastra

1. Preparare due piastre separate da 96 pozzetti: una da sottoporre all'esposizione alla luce e un'altra da tenere al buio (controllo al buio).
2. In ciascuna delle piastre, miscelare 100 μl della soluzione fotosensibilizzante con 100 μl della sospensione batterica. Pipettare su e giù 5-10 volte.
3. Incubare le piastre a 37 °C per un intervallo predeterminato (in questo studio è stato utilizzato un periodo di 30 minuti) per consentire al fotosensibilizzatore di interagire con le cellule batteriche.

4. Irradiazione

1. Togliete le piastre dall'incubatrice ed esponete una di esse alla luce emessa dal pannello LED (il dispositivo utilizzato in questo esperimento consisteva in un proiettore LED rettangolare da 50W di potenza; Grado di protezione IP65; tensione di ingresso: AC 85-265 V), mantenendo l'altra al riparo dall'esposizione alla luce.
2. Posizionare una delle piastre sopra il pannello LED. Per garantire una regolazione precisa della piastra attraverso diverse ripetizioni del protocollo, segnare i bordi della piastra a 96 pozzetti direttamente sulla superficie del LED.
3. Esporre la piastra per un tempo di irradiazione adeguato (in questo studio è stato utilizzato un periodo di 15 minuti).
   NOTA: Assicurarsi che la dose di luce sia sufficiente per attivare il fotosensibilizzatore senza compromettere la vitalità cellulare. Per questo motivo, è necessario includere il controllo della luce (batteri esposti alla luce in assenza di fotosensibilizzante).

5. Post-irradiazione e campionamento su piastra di agar

1. Utilizzare un'altra piastra da 96 pozzetti per preparare le diluizioni seriali dei campioni (pozzetti di controllo, non irradiati e irradiati).
2. Aggiungere 180 μl di PBS/pozzetto in base al numero di campioni. Per definire correttamente il layout, tenere in considerazione che è necessaria una fila di 6 pozzetti per la diluizione seriale di un campione (diluizione di 10 volte, da 10⁻¹ a 10⁻⁶).
3. Aliquotare 20 μl da ciascun pozzetto (dalla piastra a 96 pozzetti irradiata e non irradiata) alla prima colonna della piastra precedentemente riempita con PBS.
4. Con la micropipetta multicanale, eseguire una semplice diluizione seriale dal pozzetto 1 al 6 (da ^10-1 a ^10-6). NOTA: L'omogeneizzazione dei campioni è fondamentale a questo punto per garantire una miscela uniforme e coerente. Ad ogni fase di diluizione, pipettare su e giù 5-10 volte.
5. Dividere la piastra di agar in sei parti uguali, ciascuna delle quali corrisponde a una delle diluizioni (vedi Figura 3).
6. Aliquotare 10 μl da ciascun pozzetto sulla sezione corrispondente sulla superficie della piastra di agar (per ogni campione, includere almeno 3 repliche). Evitare di posizionare le aliquote troppo vicine l'una all'altra. Trasportare delicatamente le piastre di agar nell'incubatrice e attendere 18-20 ore.
   NOTA: Si tenga in considerazione che la morfologia delle CFU varia in modo significativo a seconda della specie batterica. Ad esempio, mentre le colonie di S. aureus sono relativamente facili da contare, P. aeruginosa tende a formare colonie di tipo più diffuso. Il numero di repliche potrebbe essere regolato tenendo conto di ciò.

6. Determinazione della vitalità cellulare (conteggio delle unità formanti colonie)

1. Rimuovere le piastre di agar dall'incubatore e selezionare le aree adatte per il conteggio delle cellule.
   NOTA: Evitare di contare all'interno di sezioni con colonie abbondanti, sovrapposte e non ben definite.
2. All'interno di ogni sezione, contare il numero di unità formanti colonie (CFU) e determinare la media delle 3 repliche
3. Convertire il numero di CFU contate in CFU/mL, moltiplicando il conteggio medio per il fattore di diluizione e dividendo per il volume di coltura piastrata in mL.

7. Analisi dei dati

1. Convertire i dati di CFU/mL nella scala logaritmica e rappresentare la vitalità cellulare in log₁₀|CFU/mL| in funzione della concentrazione testata.

Risultati

Composti flavilici a base di amminici (Figura 2): 7-dietilammino-4′-dimetilamminoflavilio (7NEt₂4′NMe₂), 7-dietilammino-2-(dimetilamminostil)-1-benzopirilio (7NEt₂st4′NMe₂), 7-dietilammino-4′-amminoflavilio (7NEt₂4′NH₂) e 7-dietilammino-4′-idrossiflavilio (7NEt₂4′OH), la cui natura sensibile alla luce è stata precedentemente discussa^12,13<...

Discussione

Sebbene questo protocollo funga da piattaforma di test nella fase iniziale, è importante considerare condizioni di test più significative per il trattamento delle infezioni microbiche in una fase di studio più avanzata. Quando si valuta l'efficacia dell'aPDI, dovrebbero essere condotti esperimenti su organizzazioni batteriche di tipo biofilm piuttosto che su batteri planctonici. Molti casi clinici coinvolgono microrganismi organizzati in questa conformazione più resistente, come le f...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150