細菌の光力学的不活性化における光活性分子を評価するためのLEDベース In Vitro スクリーニング

要約

このプロトコルは、96ウェルプレートフォーマットとLEDパネル光源を組み合わせて、抗菌光線力学不活性化(aPDI)における潜在的な光増感剤の有効性を評価するための簡単で経済的な方法を説明しています。このアプローチにより、異なる濃度、化合物、細菌株など、複数の実験条件を同時に試験することができます。

要約

多剤耐性感染症の増加と新しい抗生物質クラスの欠如により、細菌の光線力学不活性化(aPDI)などの代替療法への関心が再燃しています。このプロセスでは、適切な可視光源によって活性化された光増感剤(PS)を投与し、活性酸素種(ROS)のレベルを悪化させて、重要な細胞生体分子を損傷し、最終的に細菌の細胞死を引き起こします。潜在的な光増感剤の光誘起光毒性の有効性を評価および比較するためには、標準化された、使いやすく、再現性のある初期試験を作成することが重要です。この研究では、プランクトン性細菌細胞に対する光線力学活性を評価するためのシンプルで効率的な in vitro 技術を紹介します。96ウェルマイクロプレートフォーマットと大型LEDパネルを採用することで、さまざまな化合物の体系的な評価を容易にします。このような構成により、制御された一貫した環境で潜在的な光増感剤のハイスループットスクリーニングが可能になり、さらなる開発のための有望な候補を特定するプロセスが簡素化されます。この柔軟なプラットフォームは、抗生物質耐性感染症を管理するための革新的な光線力学療法の開発を進める上で重要なステップとして機能します。

概要

光線力学療法(PDT)は、近年、特に皮膚科の臨床治療において有望な結果を示している低侵襲治療アプローチです¹。この治療法の応用分野で特に興味深いのは、抗菌性光線力学不活性化(aPDI)²として知られる微生物感染症の治療です。当初は見過ごされていましたが、主に抗生物質の驚くべき効率性のために見過ごされていましたが、抗菌薬多剤耐性(AMR)の出現と、この公衆衛生上の懸念に対処するための代替的かつ効率的な戦略を見つける必要性により、近年、光による細菌増殖の根絶が新たな関心を集めています^3,4.重要な結果は、数秒または数分以内に達成でき、空間的および時間的な精度は、それぞれ関心のある領域と手順のオン/オフ機能を特異的に照射することによって提供されます。

光力学の原理の背後にあるメカニズムは、光感受性分子(光増感剤)、分子状酸素、および外部光源の組み合わせに依存しています。これらの3つの成分は無害ですが、組み合わせると、光増感剤の光活性化により、標的細胞に対して致命的となる可能性があります。光をトリガーとする反応により、活性酸素種(ROS)が大量に発生し、最終的には重要な細胞成分に重篤で不可逆的な損傷を引き起こし、細胞死につながります^5,6。また、aPDIと他の従来の抗菌薬治療との併用は、治療効果の向上、治療時間の短縮、薬剤投与量の減少など、有望な治療結果を示しています⁷。

さらに、PDTにおける光増感剤(PS)の局所投与は、周囲の組織への損傷を最小限に抑え、全身への影響を抑えた標的治療を可能にし、表在性皮膚感染症を治療するための高く評価されている選択肢^{となっています8。}局所治療の利便性と、多くの皮膚感染症や病変の表面的な性質により、PDTの魅力的な標的となっています。研究は、火傷感染症、外科的創傷感染症、潰瘍性病変、およびにきびや膿痂疹などの他の表在性疾患の治療におけるaPDIの有効性を支持しています9,10,11。

天然および合成の両方の多数の分子が、aPDIに対してテストされ、提案されています。しかし、実験プロトコルでさまざまなパラメータを使用し、しばしば不特定のパラメータを使用すると、結果の比較が困難になり、科学的知見の明確さに影響を及ぼします。シンプルで再現性の高い検査を開発することで、多数の化合物の迅速なスクリーニングが容易になり、有望な候補の特定が促進されます。簡単で再現性があり、費用対効果の高いプロトコルは、異なる研究施設間で結果を比較できるため、初期段階の試験で特に価値があります。また、効率的なスクリーニングプロセスにより、より幅広い分子の探索が容易になり、より高度で複雑、かつコストのかかる方法でのさらなる試験のための新しい光増感剤の発見と選択につながる可能性があります。

このプロトコルは、光強度が25mW/cm²のLEDパネルを使用して、細菌に対する潜在的な光増感剤の光毒性を評価するための簡単な方法を概説しています。代表的な細菌株である 黄色ブドウ球菌を使用し、可視スペクトルを完全にカバーする白色光チャネルを選択しました。この手順では、30分間のインキュベーション前期間と、その後の15分間の光(22.5 J/cm²)への曝露を行いました。結果はこれらの特定の実験条件に基づいていますが、個々のプロトコルに従って調整することができます。これらの設定を明確に定義し、手続きの説明に含めることが不可欠です。

プロトコル

プロトコルの全体的な説明を 図 1 に示します。使用した試薬や機器の詳細は、資料表に記載されています。

1. 細菌培養の準備

1. ストック培養物からMueller-Hinton寒天培地(MH)で 黄色ブドウ球菌 (ATCC 29213)を増殖させます。MHプレートをアッセイの前に37°Cで24時間インキュベートして、新鮮な培養物を得ます。
2. 細菌を接種する:寒天プレートから2〜3個の新鮮なコロニーを収集し、滅菌ろ過した6 mLの予熱済みリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.4で希釈します。
3. 渦巻き(1200 rpm)を接種材料を3〜4回回して、サンプルの適切な均質化を確保します。3 mLを使い捨てキュベットに引き出します。.
4. OD₆₀₀ を測定し、PBSを使用して0.1(約1 x 10⁸ CFU/mL)に調整します。
   注:正確なODからCFUへの変換は、 黄色ブドウ球菌の株によって異なる場合があります。特定の菌株と実験室の実験条件に対する標準的な成長曲線を確立できます。

2. 光増感剤の調製

1. ストック溶液:目的の化合物の光増感剤のストック溶液を調製します(詳細については結果のセクションを参照)適切な溶媒(DMSOまたはPBSなど; 図 2)。
2. 標準溶液:ストック溶液をPBSで希釈します。細菌培養培地ではなくPBSを使用することで、培地の成分がaPDI実験中の光吸収を妨げないようにします。
3. サンプルをボルテックスして、完全な均質化を確保します。必要に応じて超音波浴を使用して、完全な可溶化を保証し、透明な溶液を実現します(その場合は、慎重に制御します。疎水性化合物の場合、溶媒システムの調整が必要になる場合があります(例:DMSOまたはエタノールの%を添加する)。細胞の生存率に対する溶媒の影響を常にチェックしていることを確認してください。
   注:超音波処理の条件は、化合物の種類、濃度、およびシステム溶媒によって異なります。容易に溶解する化合物には短い時間(例えば、5分)で十分な場合があり、疎水性の高い化合物にはより長い時間(20〜30分)が必要な場合があります。

3. プレートのセットアップ

1. 2つの別々の96ウェルプレートを準備します:1つは光にさらされ、もう1つは暗闇に保管されます(ダークコントロール)。
2. 各プレートで、100 μLの光増感剤溶液と100 μLの細菌懸濁液を混合します。ピペットを5〜10回上下します。
3. プレートを37°Cであらかじめ決められた間隔(この研究では30分間使用)でインキュベートし、光増感剤が細菌細胞と相互作用できるようにします。

4. 照射

1. インキュベーターからプレートを取り外し、そのうちの1つをLEDパネルから放射される光にさらします(この実験で使用したデバイスは、50Wの電力の長方形のLEDプロジェクターで構成されていました。IP65の;入力電圧:AC 85-265 V)、もう一方を光にさらされないようにします。
2. プレートの1つをLEDパネルの上に置きます。プロトコルを数回繰り返してプレートを正確に調整するには、96ウェルプレートの端をLED表面に直接マークします。
3. プレートを適切な照射時間でさらします(この研究では、15分間の期間を使用しました)。
   注:光量が、細胞の生存率を損なうことなく光増感剤を活性化するのに十分であることを確認してください。そのため、光制御を含める必要があります(光増感剤の不在下で光にさらされる細菌)。

5. 照射後および寒天プレートサンプリング

1. 別の96ウェルプレートを使用して、サンプルの段階希釈液を調製します(コントロール、非照射ウェル、および照射ウェル)。
2. サンプル数に応じて180μLのPBS/ウェルを添加します。レイアウトを適切に定義するには、1つのサンプルの段階希釈(^{10-1から10-6}までの10倍希釈)に6ウェルの列が必要であることを考慮に入れてください。
3. 各ウェル(照射済みおよび非照射済みの96ウェルプレートから)から、PBSを以前に充填したプレートの最初のカラムまで20μLを分注します。
4. マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、ウェル1から6(^10-1 から^10-6)への簡単な段階希釈を行います。注:この時点では、均一で一貫性のある混合物を確保するために、サンプルの均質化が重要です。希釈ステップごとに、ピペットを5〜10回上下します。
5. 寒天プレートを6等分し、各セクションを希釈液の1つに対応します( 図3を参照)。
6. 各ウェルから10 μLを寒天プレート表面の対応する切片に分注します(各サンプルについて、少なくとも3回の繰り返しを含めます)。アリコートを互いに近づけすぎないようにしてください。寒天プレートをインキュベーターに静かに運び、18〜20時間待ちます。
   注:CFUの形態は細菌種によって大きく異なることを考慮に入れてください。例えば、 黄色ブドウ球菌 のコロニーは比較的簡単に数えることができますが、 緑膿菌はより 拡散型のコロニーを形成する傾向があります。これを考慮して、レプリケート数が調整される場合があります。

6. 細胞生存率の決定(コロニー形成単位カウント)

1. インキュベーターから寒天プレートを取り外し、細胞計数に適した領域を選択します。
   注:コロニーが豊富で、重複し、明確に定義されていないコロニーがあるセクション内でのカウントは避けてください。
2. 各セクション内で、コロニー形成単位(CFU)の数をカウントし、3回の反復の平均を決定します
3. カウントしたCFUの数をCFU/mLに変換し、平均カウントに希釈係数を掛け、mLでメッキした培養物の量で分割します。

7. データ分析

1. CFU/mLのデータを対数スケールに変換し、細胞生存率をlog₁₀|CFU/mL|テストされた濃度の関数として。

結果

アミノ系フラビリウム化合物(図2):7-ジエチルアミノ-4′-ジメチルアミノフラビリウム(7NEt₂4′NMe₂)、7-ジエチルアミノ-2-(ジメチルアミノスチリル)-1-ベンゾピリリウム(7NEt₂st4′NMe₂)、7-ジエチルアミノ-4′-アミノフラビリウム(7NEt₂4′NH₂)および7-ジエチルアミノ-4′-ヒドロキシフラビリウム(7NEt₂

ディスカッション

このプロトコルは初期段階の試験プラットフォームとして機能しますが、より高度な研究段階では、微生物感染症の治療のためのより意味のある試験条件を考慮することが重要です。aPDIの有効性を評価する際には、プランクトン性細菌ではなく、バイオフィルム型の細菌組織で実験を行う必要があります。多くの臨床例は、慢性創傷、嚢胞性線維症、および埋め込?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150