Criblage in vitro à base de LED pour l’évaluation de molécules photoactivables dans l’inactivation photodynamique bactérienne

Résumé

Ce protocole décrit une méthode simple et économique pour évaluer l’efficacité des photosensibilisants potentiels dans l’inactivation photodynamique antibactérienne (aPDI), en utilisant un format de plaque à 96 puits combiné à une source lumineuse de panneau LED. Cette approche permet de tester simultanément plusieurs conditions expérimentales, y compris différentes concentrations, composés et souches bactériennes.

Résumé

L’augmentation des infections multirésistantes et l’absence de nouvelles classes d’antibiotiques ont ravivé l’intérêt pour les thérapies alternatives comme l’inactivation photodynamique des bactéries (aPDI). Ce processus implique l’administration d’un photosensibilisateur (PS) activé par une source de lumière visible appropriée, produisant des niveaux exacerbés d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui endommagent les biomolécules cellulaires cruciales, provoquant finalement la mort des cellules bactériennes. Il est crucial de créer des tests initiaux standardisés, faciles à utiliser et reproductibles pour évaluer et comparer l’efficacité de la phototoxicité induite par la lumière des photosensibilisants potentiels. Cette étude présente une technique in vitro simple et efficace pour évaluer l’activité photodynamique contre les cellules bactériennes planctoniques. En utilisant un format de microplaque à 96 puits avec un grand panneau LED, le système facilite l’évaluation systématique de divers composés. Une telle configuration permet un criblage à haut débit de photosensibilisants potentiels dans un environnement contrôlé et cohérent, simplifiant ainsi le processus d’identification de candidats prometteurs pour un développement ultérieur. Cette plateforme flexible constitue une étape importante dans le développement de thérapies photodynamiques innovantes pour la gestion des infections résistantes aux antibiotiques.

Introduction

La thérapie photodynamique (TPD) est une approche thérapeutique mini-invasive qui a montré des résultats prometteurs ces dernières années, notamment dans le traitement clinique dermatologique¹. Un domaine d’application particulièrement intéressant de cette modalité thérapeutique est le traitement des infections microbiennes, un processus connu sous le nom d’inactivation photodynamique antimicrobienne (aPDI)². Bien qu’initialement négligée, principalement en raison de l’efficacité remarquable des antibiotiques, l’éradication de la croissance bactérienne déclenchée par la lumière a connu un regain d’intérêt au cours des dernières années, en raison de l’émergence de la multirésistance aux antimicrobiens (RAM) et de la nécessité de trouver des stratégies alternatives et efficaces pour répondre à ce problème de santé publique ^3,4. Des résultats significatifs peuvent être obtenus en quelques secondes ou minutes, avec une précision spatiale et temporelle offerte par l’irradiation spécifique de la zone d’intérêt et la fonction marche/arrêt de la procédure, respectivement.

Le mécanisme derrière le principe photodynamique repose sur la combinaison de molécules sensibles à la lumière (photosensibilisant), d’oxygène moléculaire et d’une source de lumière externe. Bien que ces trois composants soient inoffensifs, lorsqu’ils sont combinés, ils peuvent devenir létaux pour les cellules cibles en raison de la photoactivation du photosensibilisateur. Les réactions déclenchées par la lumière entraînent une génération massive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ce qui finit par causer des dommages graves et irréversibles dans des composants cellulaires cruciaux, conduisant à la mort cellulaire ^5,6. De plus, l’association de l’aPDI avec d’autres traitements antimicrobiens conventionnels a montré des résultats thérapeutiques prometteurs, notamment une efficacité thérapeutique plus élevée, une réduction de la durée du traitement et des doses de médicament plus faibles⁷.

De plus, l’administration topique de photosensibilisants (PS) dans la PDT permet un traitement ciblé avec des dommages minimes aux tissus environnants et de faibles effets systémiques, ce qui en fait une option très appréciée pour traiter les infections cutanées superficielles⁸. La commodité du traitement topique et la nature superficielle de nombreuses infections et lésions cutanées en font une cible attrayante pour la PDT. Des études ont soutenu l’efficacité de l’aPDI dans le traitement des infections des brûlures, des infections des plaies chirurgicales, des lésions ulcérées et d’autres affections superficielles telles que l’acné et l’impétigo ^9,10,11.

De nombreuses molécules, à la fois naturelles et synthétiques, ont été testées et proposées pour l’aPDI. Cependant, l’utilisation de paramètres variables et souvent non spécifiés dans les protocoles expérimentaux rend difficile la comparaison des résultats, ce qui affecte la clarté des résultats scientifiques. La mise au point de tests simples et reproductibles peut faciliter le criblage rapide de nombreux composés, accélérant ainsi l’identification de candidats prometteurs. Des protocoles simples, reproductibles et rentables sont particulièrement précieux dans les tests à un stade précoce, car ils permettent de comparer les résultats entre différentes installations de recherche. Des processus de criblage efficaces facilitent également l’exploration d’un plus large éventail de molécules, ce qui peut conduire à la découverte et à la sélection de nouveaux photosensibilisants pour des tests plus approfondis dans des méthodologies plus avancées, complexes et coûteuses.

Ce protocole décrit une méthode simple pour évaluer la phototoxicité des photosensibilisants potentiels sur les bactéries à l’aide d’un panneau LED d’une intensité lumineuse de 25 mW/^cm2. Une souche bactérienne représentative, S. aureus, a été utilisée, et le canal de lumière blanche a été sélectionné, offrant une couverture complète du spectre visible. La procédure impliquait une période de pré-incubation de 30 minutes suivie d’une exposition de 15 minutes à la lumière (22,5 J/cm²). Bien que les résultats soient basés sur ces conditions expérimentales spécifiques, ils peuvent être adaptés en fonction de protocoles individuels. Il est essentiel de définir clairement ces paramètres et de les inclure dans la description de la procédure.

Protocole

Une description générale du protocole est illustrée à la figure 1. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de la culture bactérienne

1. Cultiver des bactéries S. aureus (ATCC 29213) sur gélose Mueller-Hinton (MH) à partir de cultures mères. Incuber les plaques MH à 37 °C pendant 24 h avant le test pour obtenir des cultures fraîches.
2. Inoculer les bactéries : Prélever 2 à 3 colonies fraîches de la plaque de gélose et les diluer dans 6 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée pH 7,4, filtrée stérilement.
3. Vortex (1200 tr/min) l’inoculum 3-4 fois pour assurer une bonne homogénéisation de l’échantillon. Retirer 3 ml dans une cuvette jetable.
4. Mesurez la DO₆₀₀ et ajustez-la à 0,1 (environ 1 x 10⁸ UFC/mL) à l’aide du PBS.
   REMARQUE : La conversion exacte de la DO en UFC peut varier en fonction de la souche de S. aureus. On peut établir une courbe de croissance standard pour la souche spécifique et les conditions expérimentales de laboratoire avec lesquelles on travaille.

2. Préparation du photosensibilisateur

1. Solution mère : Préparer une solution mère du composé photosensibilisant d’intérêt (voir la section Résultats pour plus de détails) dans un solvant approprié (p. ex., DMSO ou PBS ; Figure 2).
2. Solution de travail : Diluer la solution mère dans du PBS. L’utilisation de PBS plutôt que de milieux de culture bactériens garantit que les composants du milieu n’interfèrent pas avec l’absorption de la lumière pendant les expériences d’aPDI.
3. Vortex l’échantillon pour assurer une homogénéisation complète. Utilisez un bain à ultrasons si nécessaire pour garantir une solubilisation complète et obtenir une solution claire (dans ce cas, contrôlez soigneusement. Pour les composés hydrophobes, il peut être nécessaire d’ajuster le système de solvant (p. ex., ajouter un % de DMSO ou d’éthanol). Assurez-vous que l’effet du solvant sur la viabilité cellulaire est toujours vérifié.
   REMARQUE : Les conditions de sonication varient en fonction du type de composé, de la concentration et du solvant du système ; Des temps plus courts (p. ex., 5 min) peuvent être suffisants pour les composés facilement solubilisés, tandis que des temps plus longs (20 à 30 min) peuvent être nécessaires pour les composés hautement hydrophobes.

3. Configuration de la plaque

1. Préparez deux plaques distinctes à 96 puits : l’une pour être exposée à la lumière et l’autre pour être maintenue dans l’obscurité (contrôle de l’obscurité).
2. Dans chacune des plaques, mélanger 100 μL de la solution photosensibilisante avec 100 μL de suspension bactérienne. Pipette vers le haut et vers le bas 5 à 10 fois.
3. Incuber les plaques à 37 °C pendant un intervalle prédéterminé (dans cette étude, une période de 30 minutes a été utilisée) pour permettre au photosensibilisateur d’interagir avec les cellules bactériennes.

4. Irradiation

1. Retirez les plaques de l’incubateur et exposez l’une d’entre elles à la lumière émise par le panneau LED (l’appareil utilisé dans cette expérience consistait en un projecteur LED rectangulaire d’une puissance de 50W ; IP65 ; tension d’entrée : AC 85-265 V), en gardant l’autre protégé de l’exposition à la lumière.
2. Placez l’une des plaques au-dessus du panneau LED. Pour assurer un réglage précis de la plaque à travers plusieurs répétitions de protocole, marquez les bords de la plaque à 96 puits directement sur la surface de la LED.
3. Exposez la plaque pendant un temps d’irradiation approprié (dans cette étude, une période de 15 min a été utilisée).
   REMARQUE : Assurez-vous que la dose de lumière est suffisante pour activer le photosensibilisateur sans compromettre la viabilité cellulaire. Pour cette raison, le contrôle de la lumière doit être inclus (bactéries exposées à la lumière en l’absence de photosensibilisant).

5. Post-irradiation et prélèvement sur plaque de gélose

1. Utiliser une autre plaque de 96 puits pour préparer les dilutions en série des échantillons (témoins, puits non irradiés et puits irradiés).
2. Ajouter 180 μL de PBS/puits en fonction du nombre d’échantillons. Pour bien définir l’agencement, il faut tenir compte du fait qu’une rangée de 6 puits est nécessaire pour la dilution en série d’un échantillon (dilution 10 fois, de 10⁻¹ à 10⁻⁶).
3. Aliquote 20 μL de chaque puits (à partir de la plaque irradiée et non irradiée à 96 puits) jusqu’à la première colonne de la plaque préalablement remplie de PBS.
4. Avec la micropipette multicanaux, effectuez une simple dilution en série du puits 1 à 6 (^10-1 à ^10-6). REMARQUE : L’homogénéisation de l’échantillon est essentielle à ce stade pour assurer un mélange uniforme et cohérent. À chaque étape de dilution, pipetez vers le haut et vers le bas 5 à 10 fois.
5. Divisez la plaque de gélose en six parties égales, chaque section correspondant à l’une des dilutions (voir figure 3).
6. Aliquote 10 μL de chaque puits sur la section correspondante à la surface de la plaque de gélose (pour chaque échantillon, inclure au moins 3 répétitions). Évitez de placer les aliquotes trop près les unes des autres. Transportez délicatement les plaques de gélose dans l’incubateur et attendez 18 à 20 h.
   REMARQUE : Prendre en considération que la morphologie des UFC varie considérablement en fonction de l’espèce bactérienne. Par exemple, alors que les colonies de S. aureus sont relativement faciles à compter, P. aeruginosa a tendance à former des colonies de type plus diffus. Le nombre de répétitions peut être ajusté en tenant compte de cela.

6. Détermination de la viabilité cellulaire (comptage des unités formant des colonies)

1. Retirez les plaques de gélose de l’incubateur et sélectionnez les zones appropriées pour le comptage des cellules.
   REMARQUE : Évitez de compter dans les sections où les colonies sont abondantes, chevauchées et mal définies.
2. Dans chaque section, comptez le nombre d’unités formant colonies (UFC) et déterminez la moyenne des 3 répétitions
3. Convertir le nombre d’UFC comptés en UFC/mL, en multipliant le comptage moyen par le facteur de dilution et en divisant par le volume de culture emballé en mL.

7. Analyse des données

1. Convertir les données de UFC/mL sur l’échelle logarithmique et représenter la viabilité cellulaire en log₁₀|UFC/mL| en fonction de la concentration testée.

Résultats

Composés de flavylium à base d’amino (Figure 2) : 7-diéthylamino-4′-diméthylaminoflavylium (7NEt₂4′NMe₂), 7-diéthylamino-2-(diméthylaminostyryl)-1-benzopyrylium (7NEt₂st4′NMe₂), 7-diéthylamino-4′-aminoflavylium (7NEt₂4′NH₂) et 7-diéthylamino-4′-hydroxyflavylium (7NEt₂4′OH), dont la nature sensible à la lumière a été discutée précédemment

Discussion

Bien que ce protocole serve de plate-forme d’essai initiale, il est important d’envisager des conditions de test plus significatives pour le traitement des infections microbiennes dans une phase d’étude plus avancée. Lors de l’évaluation de l’efficacité de l’aPDI, des expériences sur des organisations bactériennes de type biofilm plutôt que sur des bactéries planctoniques doivent être menées. De nombreux cas cliniques impliquent des micro-organismes organisés dans ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent	G6860A
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable cuvettes PMMA	BRAND GMBH + CO KG	759030
Eppendorfs (500 mL)	Fisher Scientific	15625367
Falcon tubes (15 mL)	Corning	430791
Falcon tubes (50 mL)	Corning	430291
LED panel IP65 50W
Micropippete (100 uL)	Transferpette S	705874
Micropippete (1000 uL)	Transferpette S	705880
Mueller Hinton agar	Oxoid	CM0405
Multichannel pippete 12-channel	Transferpette S
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	260844
Phospate Buffered Saline tablets pH 7.4	Panreac Applichem	A9177
Serological Pipets (10 mL)	Thermo Scientific	170356N
Serological Pipets (5 mL)	Thermo Scientific	170366N
Tissue Culture Dish	TPP Techno Plastic Products AG	93150