盐水条件下丛枝菌根 （AM） 真菌接种物的生产及水稻与 AM 共生的表型评价

摘要

本文介绍了一种生成丛枝菌根 （AM） 真菌接种物的方案，以研究 AM 增强的水稻耐盐性。

摘要

水稻 （Oryza sativa L.） 是全球一半以上人口的重要粮食作物。然而，它的生长受到盐碱土壤的严重影响，这对全球作物生产构成了重大挑战。丛枝菌根 （AM） 真菌与超过 90% 的农业植物和 80% 的陆生植物物种形成互惠共生关系，已被证明可以增强水稻植物的耐盐性。AM 真菌是专性共生体，没有宿主根就无法完成其生命周期。因此，有效利用植物生产 AM 真菌接种物对于推进该领域的研究至关重要。在这项研究中，我们提出了一系列稳健的方法，这些方法首先使用 Allium tuberosum L 生成含有不规则根瘤菌孢子的沙子接种物。这些方法包括用沙子接种物接种水稻幼苗，分析菌根稻的生长表型，以及在盐胁迫下使用台盼蓝染色量化真菌定植水平。这些方法可以有效地产生 AM 真菌接种物，以进一步研究 AM 共生如何增强水稻的耐盐性。

引言

盐渍土壤是全球作物生产的重大障碍 ^1,2,3。最近的研究表明，到 2050 年，由于盐碱化，高达 50% 的耕地将退化⁴。受盐影响的土壤主要由于钠 （Na⁺） 和氯离子 （Cl⁻） 在植物组织中积累而对植物造成毒性。这些离子在盐渍土壤中占主导地位，也是对植物最有害的离子 ^5,6,7。例如，钠会抑制许多胞质酶活性⁸。盐胁迫还会影响光合效率，并诱导离子毒性、渗透压和细胞壁结构的变化，共同导致活性氧 （ROS） 的积累9,10,11,12,13。

丛枝菌根 （AM） 共生是 Glomeromycota 门真菌与植物根之间的内共生关联，大约在 400-4.5 亿年前随着早期陆地植物的出现而进化^14,15。超过 80% 的维管植物可被 AM 真菌定植¹⁶。这种互惠关系增强了植物从土壤中吸收养分，从而提高了生长和抗逆性 17,18,19,20。例如，在盐胁迫期间，AM 真菌可以维持离子平衡，并有助于提高水和养分的可用性、抗氧化活性、光合作用效率和植物的次生代谢物产生 2,21,22,23。此外，AM 共生可防止 Na+ 的过度吸收和从根部到芽的运输，促进 K⁺、Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 等必需阳离子的吸收。这个过程增加了盐水条件下植物中的 Mg²⁺/Na⁺ 或 K⁺/Na⁺ 比率 23,24,25,26,27,28,29。

水稻 （Oryza sativa L.） 是全球一半以上人口的重要粮食作物，属于禾本科 （Poaceae） 科，极易受到盐胁迫³⁰。研究还强调了 AM 真菌在增强水稻耐盐胁迫性方面的作用 31,32,33。例如，AM 真菌 Claroideoglomus etunicatum 提高了盐胁迫下水稻 （Oryza sativa L. cv. Puntal） 的 CO₂ 固定效率³¹。此外，在盐胁迫下，与 液泡钠螯合和 Na + 从芽到根再循环相关的关键水稻转运蛋白基因的表达在 AM 定植植物中增强³²。此外，在盐碱条件下，接种 Glomus etunicatum 的陆地稻植物显示出增强的光合能力、更高的渗透液产生、更高的渗透潜力和更高的谷物产量³³。我们之前的研究还表明，菌根稻 （Oryza sativaL. cv. Nipponbare） 表现出更好的芽和生殖生长，芽中的 K⁺/Na ⁺ 比率明显更高，并且由于 AM 共生³⁴ 提高了活性氧 （ROS） 清除能力。这些发现都通过表型方法证明了 AM 共生对水稻耐盐胁迫性的积极影响。然而，实验方法尚未以视频格式发布。

AM 真菌是专性共生体，需要宿主根才能完成其生命周期，这使得利用植物产生 AM 真菌接种物对研究进展至关重要³⁵。基于基质的生产系统，其中 AM 真菌在蛭石或沙子等基质中生长，并收集孢子用于接种³⁶，为大规模 AM 真菌接种物生产提供了一种经济高效的解决方案。孢子生产的效率取决于植物的相容性和生长，这会影响真菌的定植和繁殖^37,38。然而，这种方法通常很耗时，传统方法需要长达 120 天，并且孢子产量很低。最近的改进已将生产周期缩短到 90 天，在 LED 光照条件下使用玉米作为寄主植物³⁹。然而，提出了一种在 10 周内使用 Allium tuberosum L. 生成含有 Rhizophagus irregularis 孢子的沙子接种物的稳健方法。这种沙子接种物可用于分析菌根稻的生长表型，并在盐胁迫下使用台盼蓝染色量化真菌定植水平。这些方法有效地产生 AM 真菌接种物，用于进一步研究 AM 共生如何增强水稻的耐盐性。

研究方案

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. 使用 Allium tuberosum L 生成含有 Rhizophagus irregularis 孢子的沙子接种物。

1. 用自来水清洗沙子并高压灭菌。
2. 将 2/3 的沙子加入花盆中（顶部直径 14.7 厘米，底部直径 11.5 厘米，高度 13 厘米）。添加 1,000 个 AM 真菌 Rhizophagus irregularis 孢子。盖上一层薄薄的沙子。加入 30 颗韭菜 （Allium tuberosum L.） 种子，用沙子盖住种子。
3. 在 23.5 °C（55% 相对湿度）下以 16 小时/8 小时昼夜循环在腔室中种植大蒜韭菜。在第一周（接种后 1 周，wpi），用氧化铝纸盖住韭菜以阻挡光线，并每周浇水 3 次。
4. 从 2 wpi 开始，每周两次用含有 25 μM KH₂PO₄ 的 80 mL 半强度 Hoagland 溶液给韭菜施肥。每周用 80 mL 水施肥一次。
5. 10 周后，收获韭菜的根部进行台盼蓝染色，以评估真菌定植的水平。如果定植水平超过 70%，请停止给韭菜浇水，直到沙子变干（约 5 周）。将所有沙子接种物放入塑料袋中，并将其存放在 4 °C 的冰箱中。

2. 台盼蓝染色以检查真菌定植水平

1. 将根块在 >90 °C 的 10% KOH 中孵育 30 分钟。去除 KOH。
2. 用双蒸水 （ddH₂O） 冲洗根块 3 次。
3. 将根块与 0.3 M HCl 孵育 15 分钟至 2 小时。去除 HCl。
4. 加入 1 mL 0.1% 台盼蓝，并将样品在 >90 °C 下孵育 8 分钟。
5. 用 50% 酸性甘油清洗根块。将 10 个根块转移到载玻片上，并加入一滴 50% 酸性甘油。
6. 密封盖玻片并用指甲油滑动。
7. 在显微镜下检查每个根的 10 个视野，以记录真菌结构的存在。以百分比计算真菌定植水平。
   注意：50% 酸性甘油：通过将甘油和 0.3 M HCl 以 1：1 的比例混合来制备。0.1% 台盼蓝：将 100 mg 台盼蓝溶于 2：1：1 乳酸、甘油和 ddH₂O 的混合物中。

3. 用沙子接种和盐胁迫处理接种水稻幼苗

1. 从水稻种子中取出外壳（外壳）。
2. 用 70% 乙醇 （EtOH） 对种子消毒 4 分钟和 30 秒。
3. 将水稻种子放入离心管中。加入 3% 漂白剂（用无菌 dH₂O 制备）并摇动 30 分钟。
4. 去除漂白剂，在层流罩内用无菌 dH₂O 3-4 次洗涤种子。
5. 将种子在含有 0.8% 琼脂的半强度 Murashige-Skoog （1/2 MS） 培养基中于 30 °C 下在黑暗中生长 5 天。
6. 在 30/28 °C 和 70% 空气湿度下以 12 小时的昼夜循环种植水稻幼苗 2 天。
7. 将水稻幼苗转移到装有消毒沙的塑料管中。添加无接种物 （mock） 或 5 mL 含有不 规则根瘤 菌 （Ri） 孢子的沙子接种物。
8. 接种后第一周每周 7 天用 dH₂O 给水稻植株浇水。每隔一天用含有 25 μM KH₂PO₄ 的半浓度 Hoagland 溶液给植物施肥。
9. 接种后 5 周 （wpi），用 150 mM 的 NaCl（盐水条件）处理一批，让另一批没有 NaCl（非盐水条件）的批次。
   1. 对于非盐分条件，周二用含有 25 μM KH₂PO₄ 的半强度 Hoagland 溶液给植物浇水，并在一周的剩余时间里用水浇水。
   2. 对于盐水条件，周二用含有 25 μM KH₂PO₄ 的半强度 Hoagland 溶液给植物浇水，周一、周三和周五用 150 mM NaCl 浇水，并在本周剩余时间内用水浇水。
10. 在 8 wpi 时，收获植物以测量其新鲜重量。将植物置于 70 °C 的烘箱中 2 天以测量干重。通过台盼蓝染色分析真菌定植水平。

结果

分步工作流程如图 1 所示。在接种后 10 周 （wpi），在大蒜韭菜根部内清楚地观察到囊泡和孢子等真菌结构，这是晚期和 AM 共生的特征（图 2A）。根内菌丝、丛枝、囊泡、根外菌丝和孢子水平分别为 80% 、 47% 、 63% 、 4% 和 1%，表明韭菜根部内部真菌发育的进展。因此，总定植水平达到 80% （

讨论

有一些关于沙子接种物的制备和使用的小贴士。首先，根据我们的经验，大蒜韭菜的定植水平应高于 70%（图 2C）。否则，对其他植物（如番茄和水稻）的以下接种在接种后 7 周 （wpi） 时将无法成功达到 50% 以上（图 2E）。其次，沙子接种物在储存前应彻底风干，并保存在冰箱的干净塑料袋中，以防止其再次变湿（步骤 1.5）。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)6Mo7O24.4H2O	FERAK	12054-85-2	half-strength Hoagland solution
Bleach	Gaulix	Gaulix-2108	rice sterilization
Ca(NO3)2.4H2O	Sigma	13477-34-4	half-strength Hoagland solution
CuSO4.5H2O	Sigma	7758-99-8	half-strength Hoagland solution
EtOH	Honeywell	67-63-0	rice sterilization
Fe-citrate	Sigma	3522-50-7	half-strength Hoagland solution
Garlic chives seeds	KNOWN-YOU SEED Co., LTD.	V-015	Allium tuberosum L. seeds
Glycerol	J.T.Baker	56-81-5	Trypan blue staining
HCl	Sigma	7647-01-0	Trypan blue staining
KCl	Merck	7447-40-7	half-strength Hoagland solution
KH2PO4	Merck	7646-93-7	half-strength Hoagland solution
KNO3	Avantor	7757-79-1	half-strength Hoagland solution
KOH	Honeywell	1310-58-3	Trypan blue staining
Lactic acid	Sigma	50-81-7	Trypan blue staining
MgSO4.7H2O	Sigma	10034-99-8	half-strength Hoagland solution
MnSO4.H2O	Honeywell	10034-96-5	half-strength Hoagland solution
MS salts	PhytoTech	M404	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Na2B4O7.10H2O	Sigma	1330-43-4	half-strength Hoagland solution
NaCl	Bioshop	7647-14-5	salt stress treatment
NaOH	J.T.Baker	1310-73-2	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Rhizophagus irregularis spore	Premier Tech	L-ASP-A	AM fungal spore (MycoriseASP, Premier Tech, Rivière-du-Loup, Québec, Canada )
Sucrose	Bioshop	57-50-1	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Trypan blue	Sigma	72-57-1	Trypan blue staining
ZnSO4.7H2O	Avantor	7446-20-0	half-strength Hoagland solution