Produção de inóculo fúngico micorrízico arbuscular (MA) e avaliação fenotípica da simbiose de arroz e micorrizas arbusculares em condições salinas

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para geração de inóculo de fungos micorrízicos arbusculares (AM) para investigar a tolerância ao estresse salino aumentado por AM em arroz.

Resumo

O arroz (Oryza sativa L.) é uma cultura alimentar vital para mais da metade da população global. No entanto, seu crescimento é severamente impactado por solos salinos, que representam um desafio significativo para a produção agrícola em todo o mundo. Os fungos micorrízicos arbusculares (AM), que formam relações simbióticas mutualísticas com mais de 90% das plantas agrícolas e 80% das espécies de plantas terrestres, demonstraram aumentar a tolerância ao sal das plantas de arroz. Os fungos de micorrizas arbusculares são simbiontes obrigatórios que não podem completar seu ciclo de vida sem uma raiz hospedeira. Portanto, a utilização eficaz de plantas para produzir inóculo fúngico de micorrizas arbusculares é crucial para o avanço da pesquisa neste campo. Neste estudo, apresentamos uma série de métodos robustos que começam com a geração de inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis usando Allium tuberosum L. Esses métodos incluem a inoculação de mudas de arroz com o inóculo de areia, a análise do fenótipo de crescimento do arroz micorrízico e a quantificação dos níveis de colonização fúngica usando coloração azul de tripano sob estresse salino. Essas abordagens podem gerar eficientemente inóculo fúngico de micorrizas arbusculares para uma investigação mais aprofundada sobre como a simbiose de micorrizas arbusculares aumenta a tolerância à salinidade do arroz.

Introdução

O solo salino é um obstáculo significativo para a produção agrícola em todo o mundo ^1,2,3. Estudos recentes indicam que até 50% das terras cultivadas serão degradadas até 2050 devido à salinização⁴. Os solos afetados pelo sal causam principalmente toxicidade nas plantas devido ao acúmulo de íons sódio (Na⁺) e cloreto (Cl⁻) nos tecidos vegetais. Esses íons, que dominam os solos salinos, também são os mais prejudiciais às plantas ^5,6,7. Por exemplo, o sódio inibe muitas atividades enzimáticas citosólicas⁸. O estresse salino também afeta a eficiência fotossintética e induz mudanças na toxicidade iônica, pressão osmótica e estrutura da parede celular, levando coletivamente ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} .

A simbiose micorrízica arbuscular (AM) é uma associação endossimbiótica entre fungos do filo Glomeromycota e raízes de plantas, que evoluiu aproximadamente 400-450 milhões de anos atrás com o surgimento das primeiras plantas terrestres^14,15. Mais de 80% das plantas vasculares podem ser colonizadas por fungos de micorrizas arbusculares¹⁶. Essa relação mutualística aumenta a absorção de nutrientes das plantas do solo, melhorando assim o crescimento e a tolerância ao estresse 17,18,19,20. Por exemplo, durante o estresse salino, os fungos de micorrizas arbusculares podem manter o equilíbrio iônico e ajudar a aumentar a disponibilidade de água e nutrientes, atividade antioxidante, eficiência fotossintética e produção de metabólitos secundários para plantas 2,21,22,23. Além disso, a simbiose AM evita a absorção excessiva de Na+ e o transporte das raízes para os brotos, promovendo a absorção de cátions essenciais, como K⁺, Mg²⁺ e Ca²⁺. Este processo aumenta a relação Mg²⁺/Na⁺ ou K⁺/Na⁺ em plantas sob condições salinas 23,24,25,26,27,28,29.

O arroz (Oryza sativa L.), uma cultura alimentar crucial para mais da metade da população global, pertence à família Gramineae (Poaceae) e é altamente suscetível ao estresse salino³⁰. Estudos também destacaram o papel dos fungos de micorrizas arbusculares no aumento da tolerância ao estresse salino no arroz 31,32,33. Por exemplo, o fungo AM Claroideoglomus etunicatum melhora a eficiência de fixação de CO₂ do arroz (Oryza sativa L. cv. Puntal) sob estresse salino³¹. Além disso, a expressão de genes-chave transportadores de arroz associados ao sequestro vacuolar de sódio e à recirculação de Na+ da parte aérea para as raízes é aumentada em plantas colonizadas por AM sob estresse salino³². Além disso, as plantas de arroz de terras altas inoculadas com Glomus etunicatum apresentam maior capacidade fotossintética, elevada produção de osmólitos, melhor potencial osmótico e maior rendimento de grãos em condições salinas³³. Nossa pesquisa anterior também demonstrou que o arroz micorrízico (Oryza sativaL. cv. Nipponbare) exibiu melhor crescimento reprodutivo e reprodutivo, uma relação K⁺/Na⁺ notavelmente maior na parte aérea e melhor capacidade de eliminação de espécies reativas de oxigênio (ROS) devido à simbiose de AM³⁴. Todos esses achados demonstram o impacto positivo da simbiose AM na tolerância ao estresse salino no arroz por meio de abordagens fenômicas. No entanto, os métodos experimentais não foram publicados em formato de vídeo.

Os fungos de micorrizas arbusculares são simbiontes obrigatórios que requerem uma raiz hospedeira para completar seu ciclo de vida, tornando o uso de plantas para produzir inóculo fúngico de micorrizas arbusculares crucial para o progresso da pesquisa³⁵. Um sistema de produção baseado em substrato, onde os fungos de micorrizas arbusculares são cultivados em substratos como vermiculita ou areia e os esporos são coletados para o inóculo³⁶, oferece uma solução econômica para a produção de inóculo fúngico de micorrizas arbusculares em larga escala. A eficiência da produção de esporos depende da compatibilidade e do crescimento das plantas, que afetam a colonização e propagação de fungos^37,38. No entanto, esse método costuma ser demorado, com abordagens tradicionais levando até 120 dias e produzindo baixa produção de esporos. Melhorias recentes reduziram o período de produção para 90 dias usando milho como planta hospedeira sob condições de luz LED³⁹. No entanto, um método robusto é apresentado para gerar inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis usando Allium tuberosum L. dentro de 10 semanas. Este inóculo de areia pode ser usado para analisar o fenótipo de crescimento do arroz micorrízico e quantificar os níveis de colonização fúngica usando coloração com azul de tripano sob estresse salino. Essas abordagens geram eficientemente inóculo fúngico de micorrizas arbusculares para uma investigação mais aprofundada sobre como a simbiose de micorrizas arbusculares aumenta a tolerância à salinidade do arroz.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Geração de inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis usando Allium tuberosum L.

1. Lave a areia com água da torneira e autoclave-a.
2. Adicione 2/3 da areia a uma panela (diâmetro superior 14,7 cm, diâmetro inferior 11,5 cm, altura 13 cm). Adicione 1.000 esporos do fungo de micorrizas arbusculares Rhizophagus irregularis. Cubra com uma fina camada de areia. Adicione 30 sementes de cebolinha de alho (Allium tuberosum L.) e cubra as sementes com areia.
3. Cultive a cebolinha na câmara com um ciclo dia/noite de 16 h/8 h a 23,5 °C (55% de umidade relativa). Durante a primeira semana (1 semana após a inoculação, wpi), cubra a cebolinha com papel de alumina para bloquear a luz e regue-a três vezes por semana.
4. A partir de 2 wpi, fertilize a cebolinha duas vezes por semana com 80 mL de solução Hoagland de meia força contendo 25 μM KH₂PO₄. Fertilize uma vez por semana com 80 mL de água.
5. Após 10 semanas, colha as raízes da cebolinha para coloração azul tripano para avaliar o nível de colonização fúngica. Se o nível de colonização exceder 70%, pare de regar a cebolinha até que a areia esteja seca (cerca de 5 semanas). Coloque todo o inóculo de areia em um saco plástico e guarde-o na geladeira a 4 °C.

2. Coloração azul de tripano para verificar o nível de colonização fúngica

1. Incube pedaços de raiz por 30 min a >90 °C em 10% de KOH. Remova o KOH.
2. Enxágue os pedaços da raiz com água bidestilada (ddH₂O) três vezes.
3. Incube os pedaços de raiz com HCl 0,3 M por 15 min a 2 h. Remova o HCl.
4. Adicione 1 mL de azul de tripano a 0,1% e incube as amostras por 8 min a >90 °C.
5. Lave os pedaços da raiz com glicerol ácido a 50%. Transfira 10 pedaços de raiz para lâminas e adicione uma gota de glicerol ácido a 50%.
6. Sele as lamínulas e deslize com esmalte.
7. Examine 10 campos de visão de cada raiz ao microscópio para registrar a presença de estruturas fúngicas. Calcule o nível de colonização fúngica como uma porcentagem.
   NOTA: 50% de glicerol ácido: Prepare misturando glicerol e HCl 0,3 M na proporção de 1:1. 0,1% de azul de tripano: Dissolva 100 mg de azul de tripano em uma mistura de ácido lático 2:1:1, glicerol e ddH₂O.

3. Inoculação de mudas de arroz com inóculo de areia e tratamento por estresse salino

1. Remova a casca (casca) das sementes de arroz.
2. Esterilize as sementes com etanol 70% (EtOH) por 4 min e 30 s.
3. Coloque as sementes de arroz em um tubo de centrífuga. Adicione 3% de água sanitária (preparado com dH_{estéril 2}O) e agite por 30 min.
4. Remova o alvejante e lave as sementes com dH₂O estéril 3-4 vezes dentro da capela de fluxo laminar.
5. Cultive as sementes em meio Murashige-Skoog (1/2 MS) contendo 0,8% de ágar a 30 °C no escuro por 5 dias.
6. Cultive as mudas de arroz com um ciclo dia/noite de 12 horas a 30/28 °C e 70% de umidade do ar por 2 dias.
7. Transfira as mudas de arroz para tubos de plástico contendo areia esterilizada. Adicionar nenhum inóculo (simulado) ou 5 ml de inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis (Ri).
8. Regue as plantas de arroz com dH₂O 7 dias por semana durante a primeira semana após a inoculação. Fertilize as plantas a cada dois dias com uma solução de Hoagland de meia força contendo 25 μM de KH₂PO₄.
9. Às 5 semanas após a inoculação (wpi), trate um lote com 150 mM de NaCl (condição salina) e deixe o outro lote sem NaCl (condição não salina).
   1. Para a condição não salina, regue as plantas com solução de Hoagland de meia força contendo 25 μM de KH₂PO₄ na terça-feira e com água pelo resto da semana.
   2. Para a condição salina, regue as plantas com solução de Hoagland de meia força contendo 25 μM de KH₂PO₄ na terça-feira, com 150 mM de NaCl na segunda, quarta e sexta-feira e com água pelo resto da semana.
10. A 8 wpi, colha as plantas para medir seu peso fresco. Coloque as plantas em um forno a 70 °C por 2 dias para medir o peso seco. Analise o nível de colonização fúngica pela coloração com azul de tripano.

Resultados

O fluxo de trabalho passo a passo é mostrado na Figura 1. Às 10 semanas pós-inoculação (wpi), estruturas fúngicas como vesículas e esporos, que são características do estágio tardio e da simbiose de micorrizas arbusculares, foram claramente observadas dentro das raízes da cebolinha (Figura 2A). Os níveis de hifas intrarradicais, arbúsculos, vesículas, hifas extrarradicais e esporos ...

Discussão

Existem algumas dicas sobre a preparação e uso do inóculo de areia. Primeiro, de acordo com nossa experiência, o nível de colonização da cebolinha deve ser superior a 70% (Figura 2C). Caso contrário, a inoculação seguinte em outras plantas, como tomate e arroz, não atingirá com sucesso mais de 50% em 7 semanas após a inoculação (wpi) (Figura 2E). Em segundo lugar, o inóculo de areia deve ser completamente seco ao...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)6Mo7O24.4H2O	FERAK	12054-85-2	half-strength Hoagland solution
Bleach	Gaulix	Gaulix-2108	rice sterilization
Ca(NO3)2.4H2O	Sigma	13477-34-4	half-strength Hoagland solution
CuSO4.5H2O	Sigma	7758-99-8	half-strength Hoagland solution
EtOH	Honeywell	67-63-0	rice sterilization
Fe-citrate	Sigma	3522-50-7	half-strength Hoagland solution
Garlic chives seeds	KNOWN-YOU SEED Co., LTD.	V-015	Allium tuberosum L. seeds
Glycerol	J.T.Baker	56-81-5	Trypan blue staining
HCl	Sigma	7647-01-0	Trypan blue staining
KCl	Merck	7447-40-7	half-strength Hoagland solution
KH2PO4	Merck	7646-93-7	half-strength Hoagland solution
KNO3	Avantor	7757-79-1	half-strength Hoagland solution
KOH	Honeywell	1310-58-3	Trypan blue staining
Lactic acid	Sigma	50-81-7	Trypan blue staining
MgSO4.7H2O	Sigma	10034-99-8	half-strength Hoagland solution
MnSO4.H2O	Honeywell	10034-96-5	half-strength Hoagland solution
MS salts	PhytoTech	M404	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Na2B4O7.10H2O	Sigma	1330-43-4	half-strength Hoagland solution
NaCl	Bioshop	7647-14-5	salt stress treatment
NaOH	J.T.Baker	1310-73-2	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Rhizophagus irregularis spore	Premier Tech	L-ASP-A	AM fungal spore (MycoriseASP, Premier Tech, Rivière-du-Loup, Québec, Canada )
Sucrose	Bioshop	57-50-1	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Trypan blue	Sigma	72-57-1	Trypan blue staining
ZnSO4.7H2O	Avantor	7446-20-0	half-strength Hoagland solution