Produzione di inoculo fungino micorrizico arbuscolare (AM) e valutazione fenotipica della simbiosi tra riso e AM in condizioni saline

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di inoculo di funghi micorrizici arbuscolari (AM) per studiare la tolleranza allo stress salino potenziata dall'AM nel riso.

Abstract

Il riso (Oryza sativa L.) è una coltura alimentare vitale per oltre la metà della popolazione mondiale. Tuttavia, la sua crescita è gravemente influenzata dai terreni salini, che rappresentano una sfida significativa per la produzione agricola in tutto il mondo. I funghi micorrizici arbuscolari (AM), che formano relazioni simbiotiche mutualistiche con oltre il 90% delle piante agricole e l'80% delle specie vegetali terrestri, hanno dimostrato di migliorare la tolleranza al sale delle piante di riso. I funghi AM sono simbionti obbligati che non possono completare il loro ciclo vitale senza una radice ospite. Pertanto, l'utilizzo efficace delle piante per produrre inoculo fungino AM è fondamentale per far progredire la ricerca in questo campo. In questo studio, presentiamo una serie di metodi robusti che iniziano con la generazione di inoculo di sabbia contenente spore di Rhizophagus irregularis utilizzando Allium tuberosum L. Questi metodi includono l'inoculazione delle piantine di riso con l'inoculo di sabbia, l'analisi del fenotipo di crescita del riso micorrizico e la quantificazione dei livelli di colonizzazione fungina utilizzando la colorazione blu di tripano sotto stress salino. Questi approcci possono generare in modo efficiente l'inoculo fungino AM per ulteriori indagini su come la simbiosi AM migliora la tolleranza alla salinità del riso.

Introduzione

Il suolo salino è un ostacolo significativo alla produzione agricola in tutto il mondo ^1,2,3. Studi recenti indicano che fino al 50% dei terreni coltivati sarà degradato entro il 2050 a causa della salinizzazione⁴. I terreni colpiti dal sale causano principalmente tossicità nelle piante a causa dell'accumulo di ioni sodio (Na⁺) e cloruro (Cl^-) nei tessuti vegetali. Questi ioni, che dominano i terreni salini, sono anche i più dannosi per le piante ^5,6,7. Ad esempio, il sodio inibisce molte attività enzimatiche citosoliche⁸. Lo stress salino influisce anche sull'efficienza fotosintetica e induce cambiamenti nella tossicità ionica, nella pressione osmotica e nella struttura della parete cellulare, portando collettivamente all'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS)9,10,11,12,13.

La simbiosi micorrizica arbuscolare (AM) è un'associazione endosimbiotica tra funghi del phylum Glomeromycota e radici di piante, che si è evoluta circa 400-450 milioni di anni fa con l'emergere delle prime piante terrestri^14,15. Oltre l'80% delle piante vascolari può essere colonizzato dai funghi AM¹⁶. Questa relazione mutualistica migliora l'assorbimento dei nutrienti da parte delle piante dal suolo, migliorando così la crescita e la tolleranza allo stress 17,18,19,20. Ad esempio, durante lo stress salino, i funghi AM possono mantenere l'equilibrio ionico e aiutare a migliorare la disponibilità di acqua e nutrienti, l'attività antiossidante, l'efficienza fotosintetica e la produzione di metaboliti secondari per le piante 2,21,22,23. Inoltre, la simbiosi AM impedisce l'eccessivo assorbimento e trasporto di Na+ dalle radici ai germogli, promuovendo l'assorbimento di cationi essenziali come K⁺, Mg²⁺ e Ca²⁺. Questo processo aumenta il rapporto Mg²⁺/Na⁺ o K⁺/Na⁺ nelle piante in condizioni saline 23,24,25,26,27,28,29.

Il riso (Oryza sativa L.), una coltura alimentare fondamentale per oltre la metà della popolazione mondiale, appartiene alla famiglia delle Graminacee (Poaceae) ed è altamente suscettibile allo stress salino³⁰. Gli studi hanno anche evidenziato il ruolo dei funghi AM nel migliorare la tolleranza allo stress salino nel riso 31,32,33. Ad esempio, il fungo AM Claroideoglomus etunicatum migliora l'efficienza di fissazione della CO₂ del riso (Oryza sativa L. cv. Puntal) sotto stress salino³¹. Inoltre, l'espressione di geni chiave del trasportatore del riso associati al sequestro vacuolare del sodio e al ricircolo del Na+ dai germogli alle radici è migliorata nelle piante colonizzate da AM sotto stress salino³². Inoltre, le piante di riso di montagna inoculate con Glomus etunicatum mostrano una maggiore capacità fotosintetica, un'elevata produzione di osmolita, un migliore potenziale osmotico e una maggiore resa in granella in condizioni saline³³. La nostra ricerca precedente ha anche dimostrato che il riso micorrizico (Oryza sativaL. cv. Nipponbare) ha mostrato una migliore crescita dei germogli e della riproduzione, un rapporto K⁺/Na⁺ notevolmente più elevato nel germoglio e una migliore capacità di evacuazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) grazie alla simbiosi AM³⁴. Tutti questi risultati dimostrano l'impatto positivo della simbiosi AM sulla tolleranza allo stress salino nel riso attraverso approcci fenomici. Tuttavia, i metodi sperimentali non sono stati pubblicati in formato video.

I funghi AM sono simbionti obbligati che richiedono una radice ospite per completare il loro ciclo vitale, rendendo l'uso delle piante per produrre inoculo fungino AM cruciale per il progresso della ricerca³⁵. Un sistema di produzione basato su substrato, in cui i funghi AM vengono coltivati in substrati come la vermiculite o la sabbia e le spore vengono raccolte per l'inoculo³⁶, offre una soluzione economica per la produzione di inoculo fungino AM su larga scala. L'efficienza della produzione di spore dipende dalla compatibilità e dalla crescita delle piante, che influenzano la colonizzazione e la propagazione fungina^37,38. Tuttavia, questo metodo è spesso dispendioso in termini di tempo, con approcci tradizionali che richiedono fino a 120 giorni e producono una bassa produzione di spore. Recenti miglioramenti hanno ridotto il periodo di produzione a 90 giorni utilizzando il mais come pianta ospite in condizioni di luce LED³⁹. Tuttavia, viene presentato un metodo robusto per generare inoculo di sabbia contenente spore di Rhizophagus irregularis utilizzando Allium tuberosum L. entro 10 settimane. Questo inoculo di sabbia può essere utilizzato per analizzare il fenotipo di crescita del riso micorrizico e quantificare i livelli di colonizzazione fungina utilizzando la colorazione blu di tripano sotto stress salino. Questi approcci generano in modo efficiente l'inoculo fungino AM per ulteriori indagini su come la simbiosi AM migliora la tolleranza alla salinità del riso.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Generazione di inoculo di sabbia contenente spore di Rhizophagus irregularis utilizzando Allium tuberosum L.

1. Lavare la sabbia con acqua di rubinetto e sterilizzarla in autoclave.
2. Aggiungere 2/3 della sabbia in un vaso (diametro superiore 14,7 cm, diametro inferiore 11,5 cm, altezza 13 cm). Aggiungere 1.000 spore di funghi AM Rhizophagus irregularis. Coprite con un sottile strato di sabbia. Aggiungere 30 semi di erba cipollina all'aglio (Allium tuberosum L.) e coprire i semi con sabbia.
3. Coltivare l'erba cipollina in camera con un ciclo giorno/notte di 16 ore/8 ore a 23,5 °C (55% di umidità relativa). Durante la prima settimana (1 settimana dopo l'inoculazione, wpi), copri l'erba cipollina con carta di allumina per bloccare la luce e annaffiala tre volte a settimana.
4. A partire da 2 wpi, concimare l'erba cipollina due volte alla settimana con 80 ml di soluzione Hoagland a mezza dose contenente 25 μM di KH₂PO₄. Concimare una volta alla settimana con 80 ml di acqua.
5. Dopo 10 settimane, raccogliere le radici dell'erba cipollina per la colorazione blu del tripano per valutare il livello di colonizzazione fungina. Se il livello di colonizzazione supera il 70%, smetti di annaffiare l'erba cipollina fino a quando la sabbia non è asciutta (circa 5 settimane). Mettere tutto l'inoculo di sabbia in un sacchetto di plastica e conservarlo in frigorifero a 4 °C.

2. Colorazione blu di tripano per controllare il livello di colonizzazione fungina

1. Incubare i pezzi di radice per 30 minuti a >90 °C al 10% KOH. Rimuovi il KOH.
2. Sciacquare tre volte i pezzi di radice con acqua distillata doppia (ddH₂O).
3. Incubare i pezzi di radice con 0,3 M di HCl per 15 minuti a 2 ore. Rimuovere l'HCl.
4. Aggiungere 1 mL di blu di tripano allo 0,1% e incubare i campioni per 8 minuti a >90 °C.
5. Lavare i pezzi di radice con glicerolo acido al 50%. Trasferire 10 pezzi di radice sui vetrini e aggiungere una goccia di glicerolo acido al 50%.
6. Sigillare i vetrini coprioggetti e far scorrere con lo smalto per unghie.
7. Esamina 10 campi visivi di ciascuna radice al microscopio per registrare la presenza di strutture fungine. Calcola il livello di colonizzazione fungina in percentuale.
   NOTA: Glicerolo acido al 50%: Preparare mescolando glicerolo e 0,3 M HCl in un rapporto 1:1. 0,1% di blu di tripano: sciogliere 100 mg di blu di tripano in una miscela di acido lattico 2:1:1, glicerolo e ddH₂O.

3. Inoculazione di piantine di riso con inoculo di sabbia e trattamento dello stress salino

1. Togliete il guscio (lolla) dai semi di riso.
2. Sterilizzare i semi con etanolo al 70% (EtOH) per 4 minuti e 30 s.
3. Mettere i semi di riso in una provetta da centrifuga. Aggiungere il 3% di candeggina (preparata con dH₂O sterile) e agitare per 30 minuti.
4. Rimuovere la candeggina e lavare i semi con dH sterile₂O 3-4 volte all'interno della cappa a flusso laminare.
5. Coltivare i semi in un terreno di Murashige-Skoog (1/2 MS) a metà forza contenente lo 0,8% di agar a 30 °C al buio per 5 giorni.
6. Coltiva le piantine di riso con un ciclo giorno/notte di 12 ore a 30/28 °C e 70% di umidità dell'aria per 2 giorni.
7. Trasferisci le piantine di riso in tubi di plastica contenenti sabbia sterilizzata. Non aggiungere alcun inoculo (finto) o 5 ml di inoculo di sabbia contenente spore di Rhizophagus irregularis (Ri).
8. Innaffia le piante di riso con dH₂O 7 giorni alla settimana per la prima settimana dopo l'inoculazione. Concimare le piante ogni due giorni con una soluzione Hoagland a metà dosaggio contenente 25 μM di KH₂PO₄.
9. A 5 settimane dall'inoculazione (wpi), trattare un lotto con 150 mM di NaCl (condizione salina) e lasciare l'altro lotto senza NaCl (condizione non salina).
   1. Per la condizione non salina, innaffiare le piante con una soluzione di Hoagland a metà forza contenente 25 μM di KH₂PO₄ il martedì e con acqua per il resto della settimana.
   2. Per la condizione salina, innaffiare le piante con una soluzione di Hoagland a metà dosaggio contenente 25 μM di KH₂PO₄ il martedì, con 150 mM di NaCl il lunedì, mercoledì e venerdì e con acqua per il resto della settimana.
10. A 8 wpi, raccogli le piante per misurare il loro peso fresco. Mettere le piante in forno a 70 °C per 2 giorni per misurare il peso secco. Analizzare il livello di colonizzazione fungina mediante colorazione con blu di tripano.

Risultati

Il flusso di lavoro dettagliato è illustrato nella Figura 1. A 10 settimane dopo l'inoculazione (wpi), strutture fungine come vescicole e spore, che sono caratteristiche della fase avanzata e della simbiosi AM, sono state chiaramente osservate all'interno delle radici dell'erba cipollina (Figura 2A). I livelli di ife intraradicaliche, arbuscoli, vescicole, ife extraradicali e spore erano rispett...

Discussione

Ci sono alcuni suggerimenti per quanto riguarda la preparazione e l'uso dell'inoculo di sabbia. Innanzitutto, in base alla nostra esperienza, il livello di colonizzazione dell'erba cipollina dovrebbe essere superiore al 70% (Figura 2C). In caso contrario, la successiva inoculazione su altre piante, come il pomodoro e il riso, non raggiungerà con successo oltre il 50% a 7 settimane dopo l'inoculazione (wpi) (Figura 2E). In secon...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)6Mo7O24.4H2O	FERAK	12054-85-2	half-strength Hoagland solution
Bleach	Gaulix	Gaulix-2108	rice sterilization
Ca(NO3)2.4H2O	Sigma	13477-34-4	half-strength Hoagland solution
CuSO4.5H2O	Sigma	7758-99-8	half-strength Hoagland solution
EtOH	Honeywell	67-63-0	rice sterilization
Fe-citrate	Sigma	3522-50-7	half-strength Hoagland solution
Garlic chives seeds	KNOWN-YOU SEED Co., LTD.	V-015	Allium tuberosum L. seeds
Glycerol	J.T.Baker	56-81-5	Trypan blue staining
HCl	Sigma	7647-01-0	Trypan blue staining
KCl	Merck	7447-40-7	half-strength Hoagland solution
KH2PO4	Merck	7646-93-7	half-strength Hoagland solution
KNO3	Avantor	7757-79-1	half-strength Hoagland solution
KOH	Honeywell	1310-58-3	Trypan blue staining
Lactic acid	Sigma	50-81-7	Trypan blue staining
MgSO4.7H2O	Sigma	10034-99-8	half-strength Hoagland solution
MnSO4.H2O	Honeywell	10034-96-5	half-strength Hoagland solution
MS salts	PhytoTech	M404	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Na2B4O7.10H2O	Sigma	1330-43-4	half-strength Hoagland solution
NaCl	Bioshop	7647-14-5	salt stress treatment
NaOH	J.T.Baker	1310-73-2	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Rhizophagus irregularis spore	Premier Tech	L-ASP-A	AM fungal spore (MycoriseASP, Premier Tech, Rivière-du-Loup, Québec, Canada )
Sucrose	Bioshop	57-50-1	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Trypan blue	Sigma	72-57-1	Trypan blue staining
ZnSO4.7H2O	Avantor	7446-20-0	half-strength Hoagland solution