Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu makale, pirinçte ile geliştirilmiş tuz stresi toleransını araştırmak için arbusküler mikorizal () mantar aşısı oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.
Pirinç (Oryza sativa L.), dünya nüfusunun yarısından fazlası için hayati bir gıda ürünüdür. Bununla birlikte, büyümesi, dünya çapında mahsul üretimi için önemli bir zorluk teşkil eden tuzlu topraklardan ciddi şekilde etkilenir. Tarım bitkilerinin %90'ından fazlası ve karasal bitki türlerinin %80'i ile karşılıklı simbiyotik ilişkiler oluşturan arbusküler mikorizal () mantarların pirinç bitkilerinin tuz toleransını arttırdığı gösterilmiştir. mantarları, bir konak kökü olmadan yaşam döngülerini tamamlayamayan zorunlu simbiyontlardır. Bu nedenle, mantar aşısı üretmek için bitkilerin etkili bir şekilde kullanılması, bu alandaki araştırmaları ilerletmek için çok önemlidir. Bu çalışmada, Allium tuberosum L kullanılarak Rhizophagus irregularis sporları içeren kum aşısı ile başlayan bir dizi sağlam yöntem sunuyoruz. Bu yöntemler arasında pirinç fidelerinin kum aşısı ile aşılanması, mikorizal pirincin büyüme fenotipinin analiz edilmesi ve tuz stresi altında tripan mavisi boyama kullanılarak mantar kolonizasyon seviyelerinin ölçülmesi yer alır. Bu yaklaşımlar, simbiyozunun pirincin tuzluluk toleransını nasıl artırdığına dair daha fazla araştırma için verimli bir şekilde mantar aşısı oluşturabilir.
Tuzlu toprak, dünya çapında mahsul üretiminin önünde önemli bir engeldir 1,2,3. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, tuzlanma nedeniyle 2050 yılına kadar ekili arazilerin %50'sinin bozulacağını göstermektedir4. Tuzdan etkilenen topraklar öncelikle bitki dokularında sodyum (Na+) ve klorür (Cl-) iyonlarının birikmesi nedeniyle bitkilerde toksisiteye neden olur. Tuzlu topraklara hakim olan bu iyonlar aynı zamanda bitkiler için en zararlı olanlardır 5,6,7. Örneğin, sodyum birçok sitozolik enzim aktivitesini inhibe eder8. Tuz stresi ayrıca fotosentetik verimliliği etkiler ve iyonik toksisite, ozmotik basınç ve hücre duvarı yapısında değişikliklere neden olarak toplu olarak reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikimine yol açar9,10,11,12,13.
Arbusküler mikorizal () simbiyozu, Glomeromycota filumunun mantarları ile yaklaşık 400-450 milyon yıl önce erken kara bitkilerinin ortaya çıkmasıyla evrimleşen bitki kökleri arasındaki endosimbiyotik bir ilişkidir14,15. Vasküler bitkilerin% 80'inden fazlası mantarları16 tarafından kolonize edilebilir. Bu karşılıklı ilişki, topraktan bitki besin alımını arttırır, böylece büyüme ve stres toleransını iyileştirir 17,18,19,20. Örneğin, tuz stresi sırasında, mantarları iyon dengesini koruyabilir ve bitkiler için su ve besin mevcudiyetini, antioksidan aktiviteyi, fotosentetik verimliliği ve ikincil metabolit üretimini artırmaya yardımcı olabilir 2,21,22,23. Ek olarak, simbiyozu aşırı Na+ alımını ve köklerden sürgünlere taşınmasını önleyerek K+, Mg2 + ve Ca2 + gibi temel katyonların emilimini teşvik eder. Bu işlem 23,24,25,26,27,28,29 tuzlu koşullar altındaki bitkilerde Mg 2+/Na+ veya K+/Na+ oranını arttırır.
Küresel nüfusun yarısından fazlası için çok önemli bir gıda ürünü olan pirinç (Oryza sativa L.), Gramineae (Poaceae) familyasına aittir ve tuz stresine karşı oldukça hassastır30. Çalışmalar ayrıca mantarlarının pirinçte tuz stresi toleransını artırmadaki rolünü vurgulamıştır 31,32,33. Örneğin, mantarı Claroideoglomus etunicatum, tuz stresi31 altında pirincin (Oryza sativa L. cv. Puntal) CO2 fiksasyon verimliliğini artırır. Ayrıca, vakuolar sodyum sekestrasyonu ve Na+ ile ilişkili anahtar pirinç taşıyıcı genlerin ekspresyonu, tuz stresi altında kolonize bitkilerde sürgünlerden köklere devridaim artar32. Ek olarak, Glomus etunicatum ile aşılanmış yayla pirinç bitkileri, tuzlu koşullar altında gelişmiş fotosentetik kapasite, yüksek ozmolit üretimi, gelişmiş ozmotik potansiyel ve daha yüksek tane verimi sergiler33. Önceki araştırmamız ayrıca mikorizal pirincin (Oryza sativaL. cv. Nipponbare) daha iyi sürgün ve üreme büyümesi, sürgünde belirgin şekilde daha yüksek bir K+/Na+ oranı ve simbiyozu34 nedeniyle gelişmiş reaktif oksijen türleri (ROS) süpürme kapasitesi sergilediğini göstermiştir. Bu bulguların tümü, simbiyozunun fenomik yaklaşımlarla pirinçte tuz stresi toleransı üzerindeki olumlu etkisini göstermektedir. Ancak, deneysel yöntemler video formatında yayınlanmamıştır.
mantarları, yaşam döngülerini tamamlamak için bir konakçı kök gerektiren zorunlu simbiyontlardır ve bu da bitkilerin mantar aşısı üretmek için kullanılmasını araştırma ilerlemesi için çok önemli hale getirir35. mantarlarının vermikülit veya kum gibi substratlarda yetiştirildiği ve sporların aşı36 için toplandığı substrat bazlı bir üretim sistemi, büyük ölçekli mantar aşısı üretimi için uygun maliyetli bir çözüm sunar. Spor üretiminin verimliliği, mantar kolonizasyonunu ve yayılmasını etkileyen bitki uyumluluğuna ve büyümesine bağlıdır37,38. Bununla birlikte, bu yöntem genellikle zaman alıcıdır, geleneksel yaklaşımlar 120 güne kadar sürer ve düşük spor üretimi sağlar. Son gelişmeler, LED ışık koşulları altında ev sahibi bitki olarak mısır kullanılarak üretim süresini 90 güne indirmiştir39. Bununla birlikte, 10 hafta içinde Allium tuberosum L. kullanılarak Rhizophagus irregularis sporları içeren kum inokulum oluşturmak için sağlam bir yöntem sunulmuştur. Bu kum aşısı, mikorizal pirincin büyüme fenotipini analiz etmek ve tuz stresi altında tripan mavisi boyaması kullanarak mantar kolonizasyon seviyelerini ölçmek için kullanılabilir. Bu yaklaşımlar, simbiyozunun pirincin tuzluluk toleransını nasıl artırdığına dair daha fazla araştırma için verimli bir şekilde mantar aşısı oluşturur.
Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Allium tuberosum L kullanılarak Rhizophagus irregularis sporları içeren kum aşısının üretilmesi.
2. Mantar kolonizasyon seviyesini kontrol etmek için tripan mavisi boyama
3. Pirinç fidelerinin kum aşısı ile aşılanması ve tuz stresi tedavisi
Adım adım iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Aşılamadan 10 hafta sonra (wpi), sarımsak frenk soğanı köklerinin içinde geç evre ve simbiyozunun karakteristiği olan veziküller ve sporlar gibi mantar yapıları açıkça gözlenmiştir (Şekil 2A). İntraradikal hif, arbuskül, vezikül, ekstraradikal hifler ve spor seviyeleri sırasıyla %80, %47, %63, %4 ve %1 idi ve bu da sar?...
Kum aşısının hazırlanması ve kullanımı ile ilgili birkaç ipucu vardır. İlk olarak, deneyimlerimize göre, sarımsak frenk soğanının kolonizasyon seviyesi %70'in üzerinde olmalıdır (Şekil 2C). Aksi takdirde, domates ve pirinç gibi diğer bitkiler üzerinde yapılan aşağıdaki aşılama, aşılamadan 7 hafta sonra (wpi) başarılı bir şekilde %50'nin üzerine çıkamayacaktır (Şekil 2E). İkinci olarak, ku...
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Yun-Hsin Chen'in pirinçte ile geliştirilmiş tuz stresi toleransını araştırmak için sistemi kurduğunu ve Kai-Chieh Chang'ın kum aşısı oluşturmak için sistemi kurduğunu kabul ediyoruz. Bu çalışma, Tayvan Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden (NSTC 113-2326-B-002 -008 -MY3) alınan hibelerle desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(NH4)6Mo7O24.4H2O | FERAK | 12054-85-2 | half-strength Hoagland solution |
Bleach | Gaulix | Gaulix-2108 | rice sterilization |
Ca(NO3)2.4H2O | Sigma | 13477-34-4 | half-strength Hoagland solution |
CuSO4.5H2O | Sigma | 7758-99-8 | half-strength Hoagland solution |
EtOH | Honeywell | 67-63-0 | rice sterilization |
Fe-citrate | Sigma | 3522-50-7 | half-strength Hoagland solution |
Garlic chives seeds | KNOWN-YOU SEED Co., LTD. | V-015 | Allium tuberosum L. seeds |
Glycerol | J.T.Baker | 56-81-5 | Trypan blue staining |
HCl | Sigma | 7647-01-0 | Trypan blue staining |
KCl | Merck | 7447-40-7 | half-strength Hoagland solution |
KH2PO4 | Merck | 7646-93-7 | half-strength Hoagland solution |
KNO3 | Avantor | 7757-79-1 | half-strength Hoagland solution |
KOH | Honeywell | 1310-58-3 | Trypan blue staining |
Lactic acid | Sigma | 50-81-7 | Trypan blue staining |
MgSO4.7H2O | Sigma | 10034-99-8 | half-strength Hoagland solution |
MnSO4.H2O | Honeywell | 10034-96-5 | half-strength Hoagland solution |
MS salts | PhytoTech | M404 | half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium |
Na2B4O7.10H2O | Sigma | 1330-43-4 | half-strength Hoagland solution |
NaCl | Bioshop | 7647-14-5 | salt stress treatment |
NaOH | J.T.Baker | 1310-73-2 | half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium |
Rhizophagus irregularis spore | Premier Tech | L-ASP-A | AM fungal spore (MycoriseASP, Premier Tech, Rivière-du-Loup, Québec, Canada ) |
Sucrose | Bioshop | 57-50-1 | half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium |
Trypan blue | Sigma | 72-57-1 | Trypan blue staining |
ZnSO4.7H2O | Avantor | 7446-20-0 | half-strength Hoagland solution |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır