Production d’inoculum fongique mycorhizien arbusculaire (AM) et évaluation phénotypique de la symbiose du riz et de l’AM dans des conditions salines

Résumé

Cet article décrit un protocole de génération d’inoculum de champignons mycorhiziens arbusculaires (MA) afin d’étudier la tolérance au stress salin améliorée par la MA chez le riz.

Résumé

Le riz (Oryza sativa L.) est une culture vivrière vitale pour plus de la moitié de la population mondiale. Cependant, sa croissance est gravement affectée par les sols salins, qui représentent un défi important pour la production agricole dans le monde entier. Il a été démontré que les champignons mycorhiziens arbusculaires (MA), qui forment des relations symbiotiques mutualistes avec plus de 90 % des plantes agricoles et 80 % des espèces végétales terrestres, améliorent la tolérance au sel des plants de riz. Les champignons AM sont des symbiotes obligatoires qui ne peuvent pas terminer leur cycle de vie sans une racine hôte. Par conséquent, l’utilisation efficace des plantes pour produire l’inoculum fongique AM est cruciale pour faire avancer la recherche dans ce domaine. Dans cette étude, nous présentons une série de méthodes robustes qui commencent par la génération d’un inoculum de sable contenant des spores de Rhizophagus irregularis à l’aide d’Allium tuberosum L. Ces méthodes comprennent l’inoculation de semis de riz avec l’inoculum de sable, l’analyse du phénotype de croissance du riz mycorhizien et la quantification des niveaux de colonisation fongique à l’aide de la coloration au bleu de trypan sous stress salin. Ces approches peuvent générer efficacement un inoculum fongique de MA pour une étude plus approfondie de la façon dont la symbiose MA améliore la tolérance à la salinité du riz.

Introduction

Les sols salins constituent un obstacle important à la production agricole dans le monde entier ^1,2,3. Des études récentes indiquent que jusqu’à 50 % des terres cultivées seront dégradées d’ici 2050 en raison de la salinisation⁴. Les sols contaminés par le sel sont principalement toxiques pour les plantes en raison de l’accumulation d’ions sodium (Na⁺) et chlorure (Cl⁻) dans les tissus végétaux. Ces ions, qui dominent les sols salins, sont aussi les plus nocifs pour les plantes ^5,6,7. Par exemple, le sodium inhibe de nombreuses activités enzymatiques cytosoliques⁸. Le stress salin affecte également l’efficacité photosynthétique et induit des changements dans la toxicité ionique, la pression osmotique et la structure de la paroi cellulaire, conduisant collectivement à l’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)9,10,11,12,13.

La symbiose mycorhizienne arbusculaire (MA) est une association endosymbiotique entre des champignons de l’embranchement des Glomeromycètes et des racines de plantes, qui a évolué il y a environ 400 à 450 millions d’années avec l’émergence des premières plantes terrestres^14,15. Plus de 80 % des plantes vasculaires peuvent être colonisées par des champignons MA¹⁶. Cette relation mutualiste améliore l’absorption des nutriments par les plantes dans le sol, améliorant ainsi la croissance et la tolérance au stress 17,18,19,20. Par exemple, lors d’un stress salin, les champignons AM peuvent maintenir l’équilibre ionique et aider à améliorer la disponibilité de l’eau et des nutriments, l’activité antioxydante, l’efficacité photosynthétique et la production de métabolites secondaires pour les plantes 2,21,22,23. De plus, la symbiose AM empêche l’absorption excessive de Na+ et le transport des racines aux pousses, favorisant ainsi l’absorption des cations essentiels tels que K⁺, Mg²⁺ et Ca²⁺. Ce processus augmente le rapport Mg²⁺/Na⁺ ou K⁺/Na⁺ dans les plantes dans des conditions salines 23,24,25,26,27,28,29.

Le riz (Oryza sativa L.), une culture vivrière cruciale pour plus de la moitié de la population mondiale, appartient à la famille des graminées (Poaceae) et est très sensible au stress salin³⁰. Des études ont également mis en évidence le rôle des champignons AM dans l’amélioration de la tolérance au stress salin chez le riz 31,32,33. Par exemple, le champignon AM Claroideoglomus etunicatum améliore l’efficacité de fixation du CO₂ du riz (Oryza sativa L. cv. Puntal) sous stress salin³¹. De plus, l’expression des gènes clés du transporteur du riz associés à la séquestration vacuolaire du sodium et à la recirculation du Na+ des pousses aux racines est améliorée chez les plantes colonisées par l’AM sous stress salin³². De plus, les plants de riz des hautes terres inoculés avec Glomus etunicatum présentent une capacité photosynthétique améliorée, une production élevée d’osmolytes, un potentiel osmotique amélioré et un meilleur rendement en grains dans des conditions salines³³. Nos recherches antérieures ont également démontré que le riz mycorhizien (Oryza sativaL. cv. Nipponbare) présentait une meilleure croissance des pousses et de la reproduction, un rapport K⁺/Na⁺ nettement plus élevé dans la pousse et une meilleure capacité de piégeage des espèces réactives de l’oxygène (ROS) grâce à la symbiose AM³⁴. Ces résultats démontrent tous l’impact positif de la symbiose AM sur la tolérance au stress salin chez le riz par des approches phénomiques. Cependant, les méthodes expérimentales n’ont pas été publiées en format vidéo.

Les champignons AM sont des symbiotes obligatoires qui ont besoin d’une racine hôte pour compléter leur cycle de vie, ce qui rend l’utilisation des plantes pour produire un inoculum fongique AM cruciale pour les progrès de la recherche³⁵. Un système de production basé sur un substrat, où les champignons MA sont cultivés dans des substrats comme la vermiculite ou le sable et les spores sont collectées pour l’inoculum³⁶, offre une solution rentable pour la production d’inoculum fongique MA à grande échelle. L’efficacité de la production de spores dépend de la compatibilité et de la croissance des plantes, ce qui affecte la colonisation et la propagation fongiques^37,38. Cependant, cette méthode prend souvent du temps, les approches traditionnelles prenant jusqu’à 120 jours et produisant une faible production de spores. Des améliorations récentes ont permis de réduire la période de production à 90 jours en utilisant le maïs comme plante hôte dans des conditions de lumière LED³⁹. Cependant, une méthode robuste est présentée pour générer un inoculum de sable contenant des spores de Rhizophagus irregularis à l’aide d’Allium tuberosum L. dans un délai de 10 semaines. Cet inoculum de sable peut être utilisé pour analyser le phénotype de croissance du riz mycorhizien et quantifier les niveaux de colonisation fongique à l’aide de la coloration au bleu de trypan sous stress salin. Ces approches génèrent efficacement un inoculum fongique de MA pour une étude plus approfondie de la façon dont la symbiose MA améliore la tolérance à la salinité du riz.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Génération d’un inoculum de sable contenant des spores de Rhizophagus irregularis à l’aide d’Allium tuberosum L.

1. Lavez le sable à l’eau du robinet et autoclavez-le.
2. Ajoutez les 2/3 du sable dans un pot (diamètre supérieur 14,7 cm, diamètre inférieur 11,5 cm, hauteur 13 cm). Ajouter 1 000 spores de champignons AM Rhizophagus irregularis. Recouvrez d’une fine couche de sable. Ajoutez 30 graines de ciboulette à l’ail (Allium tuberosum L.) et recouvrez les graines de sable.
3. Faites pousser la ciboulette dans la chambre avec un cycle jour/nuit de 16 h/8 h à 23,5 °C (55 % d’humidité relative). Au cours de la première semaine (1 semaine après l’inoculation), couvrez la ciboulette d’ail avec du papier d’alumine pour bloquer la lumière et arrosez-les trois fois par semaine.
4. À partir de 2 wpi, fertilisez la ciboulette à l’ail deux fois par semaine avec 80 mL de solution Hoagland demi-forte contenant 25 μM KH₂PO₄. Fertilisez une fois par semaine avec 80 ml d’eau.
5. Après 10 semaines, récoltez les racines de la ciboulette à l’ail pour la coloration au bleu trypan afin d’évaluer le niveau de colonisation fongique. Si le niveau de colonisation dépasse 70 %, arrêtez d’arroser la ciboulette jusqu’à ce que le sable soit sec (environ 5 semaines). Mettez tout l’inoculum de sable dans un sac en plastique et conservez-le au réfrigérateur à 4 °C.

2. Coloration au bleu de trypan pour vérifier le niveau de colonisation fongique

1. Incuber les morceaux de racines pendant 30 min à >90 °C dans 10 % KOH. Retirez le KOH.
2. Rincez les morceaux de racine avec de l’eau doublement distillée (ddH₂O) trois fois.
3. Incuber les morceaux de racines avec 0,3 M HCl pendant 15 min à 2 h. Retirez le HCl.
4. Ajouter 1 mL de bleu de trypan à 0,1 % et incuber les échantillons pendant 8 min à >90 °C.
5. Lavez les morceaux de racine avec du glycérol acide à 50 %. Transférez 10 morceaux de racine sur des lames et ajoutez une goutte de glycérol acide à 50 %.
6. Scellez les lamelles et glissez-les avec du vernis à ongles.
7. Examinez 10 champs de vision de chaque racine au microscope pour enregistrer la présence de structures fongiques. Calculez le niveau de colonisation fongique en pourcentage.
   REMARQUE : Glycérol acide à 50 % : Préparer en mélangeant du glycérol et 0,3 M HCl dans un rapport de 1:1. 0,1 % de bleu de trypan : Dissoudre 100 mg de bleu de trypan dans un mélange d’acide lactique 2:1:1, de glycérol et de ddH₂O.

3. Inoculation de plants de riz avec de l’inoculum de sable et un traitement du stress salin

1. Retirez la coque (enveloppe) des graines de riz.
2. Stérilisez les graines avec de l’éthanol à 70 % (EtOH) pendant 4 min et 30 s.
3. Placez les graines de riz dans un tube à centrifuger. Ajouter de l’eau de Javel à 3 % (préparée avec du dH₂O stérile) et agiter pendant 30 min.
4. Retirez l’eau de Javel et lavez les graines avec du dH_{stérile 2}O 3-4 fois à l’intérieur de la hotte à flux laminaire.
5. Cultivez les graines dans un milieu demi-fort Murashige-Skoog (1/2 MS) contenant 0,8 % de gélose à 30 °C dans l’obscurité pendant 5 jours.
6. Cultivez les plants de riz avec un cycle jour/nuit de 12 heures à 30/28 °C et 70 % d’humidité de l’air pendant 2 jours.
7. Transférez les plants de riz dans des tubes en plastique contenant du sable stérilisé. Ajouter soit l’absence d’inoculum (mock), soit 5 mL d’inoculum de sable contenant des spores de Rhizophagus irregularis (Ri).
8. Arrosez les plants de riz avec dH₂O 7 jours sur 7 pendant la première semaine après l’inoculation. Fertilisez les plantes tous les deux jours avec une solution Hoagland demi-forte contenant 25 μM de KH₂PO₄.
9. 5 semaines après l’inoculation (wpi), traiter un lot avec 150 mM de NaCl (état salin) et laisser l’autre lot sans NaCl (état non salin).
   1. Pour les conditions non salines, arrosez les plantes avec une solution Hoagland demi-forte contenant 25 μM de KH₂PO₄ le mardi et avec de l’eau le reste de la semaine.
   2. Pour l’état salin, arrosez les plantes avec une solution de Hoagland demi-forte contenant 25 μM de KH₂PO₄ le mardi, avec 150 mM de NaCl le lundi, le mercredi et le vendredi, et avec de l’eau pour le reste de la semaine.
10. À 8 wpi, récoltez les plantes pour mesurer leur poids frais. Placez les plantes dans un four à 70 °C pendant 2 jours pour mesurer le poids sec. Analyser le niveau de colonisation fongique par coloration au bleu de trypan.

Résultats

Le flux de travail étape par étape est illustré à la figure 1. À 10 semaines après l’inoculation (wpi), des structures fongiques telles que les vésicules et les spores, qui sont caractéristiques du stade tardif et de la symbiose AM, ont été clairement observées à l’intérieur des racines de la ciboulette (Figure 2A). Les niveaux d’hyphes intraradicaux, d’arbuscule, de vésicul...

Discussion

Il existe quelques conseils concernant la préparation et l’utilisation de l’inoculum de sable. Tout d’abord, d’après notre expérience, le niveau de colonisation de la ciboulette à l’ail devrait être supérieur à 70 % (Figure 2C). Sinon, l’inoculation suivante sur d’autres plantes, comme la tomate et le riz, ne réussira pas à atteindre plus de 50 % 7 semaines après l’inoculation (wpi) (figure 2E). Deuxi?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)6Mo7O24.4H2O	FERAK	12054-85-2	half-strength Hoagland solution
Bleach	Gaulix	Gaulix-2108	rice sterilization
Ca(NO3)2.4H2O	Sigma	13477-34-4	half-strength Hoagland solution
CuSO4.5H2O	Sigma	7758-99-8	half-strength Hoagland solution
EtOH	Honeywell	67-63-0	rice sterilization
Fe-citrate	Sigma	3522-50-7	half-strength Hoagland solution
Garlic chives seeds	KNOWN-YOU SEED Co., LTD.	V-015	Allium tuberosum L. seeds
Glycerol	J.T.Baker	56-81-5	Trypan blue staining
HCl	Sigma	7647-01-0	Trypan blue staining
KCl	Merck	7447-40-7	half-strength Hoagland solution
KH2PO4	Merck	7646-93-7	half-strength Hoagland solution
KNO3	Avantor	7757-79-1	half-strength Hoagland solution
KOH	Honeywell	1310-58-3	Trypan blue staining
Lactic acid	Sigma	50-81-7	Trypan blue staining
MgSO4.7H2O	Sigma	10034-99-8	half-strength Hoagland solution
MnSO4.H2O	Honeywell	10034-96-5	half-strength Hoagland solution
MS salts	PhytoTech	M404	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Na2B4O7.10H2O	Sigma	1330-43-4	half-strength Hoagland solution
NaCl	Bioshop	7647-14-5	salt stress treatment
NaOH	J.T.Baker	1310-73-2	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Rhizophagus irregularis spore	Premier Tech	L-ASP-A	AM fungal spore (MycoriseASP, Premier Tech, Rivière-du-Loup, Québec, Canada )
Sucrose	Bioshop	57-50-1	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Trypan blue	Sigma	72-57-1	Trypan blue staining
ZnSO4.7H2O	Avantor	7446-20-0	half-strength Hoagland solution