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要約

この記事では、イネのAM増強塩ストレス耐性を調査するために、アーバスキュラー菌根(AM)真菌接種物を生成するためのプロトコルについて説明します。

要約

米(Oryza sativa L.)は、世界人口の半数以上にとって重要な食用作物です。しかし、その成長は塩分の多い土壌によって深刻な影響を受け、世界中の作物生産に大きな課題をもたらしています。農業植物の90%以上、陸生植物種の80%以上と共生関係を形成するアーバスキュラー菌根(AM)菌は、イネの耐塩性を高めることが示されています。AM菌類は、宿主根なしではライフサイクルを完了できない義務的な共生生物です。したがって、植物を有効活用してAM菌を作製することは、この分野の研究を進める上で非常に重要です。本研究では、Allium tuberosum Lを用いてRhizophagus irregularisの胞子を含む砂接種物を生成することから始まる一連の頑健な方法を紹介する。これらの方法には、イネの苗に砂の接種を施すこと、菌根イネの成長表現型の分析、塩ストレス下でのトリパンブルー染色を使用した真菌のコロニー形成レベルの定量化が含まれます。これらのアプローチは、AM共生がイネの塩分耐性をどのように強化するかをさらに調査するために、AM真菌接種物を効率的に生成できます。

概要

塩分の多い土壌は、世界中の作物生産にとって重大な障害となっています1,2,3。最近の研究では、2050年までに耕作地の最大50%が塩類化によって劣化することが分かっています4。塩分の影響を受けた土壌は、植物組織にナトリウム(Na+)イオンと塩化物(Cl-)イオンが蓄積するため、主に植物に毒性を引き起こします。これらのイオンは、塩分の多い土壌を支配しており、植物にとって最も有害でもあります5,6,7。例えば、ナトリウムは多くの細胞質酵素活性を阻害する8。塩ストレスはまた、光合成効率に影響を及ぼし、イオン毒性、浸透圧、および細胞壁構造の変化を誘発し、全体として活性酸素種(ROS)の蓄積につながります9,10,11,12,13。

アーバスキュラー菌根(AM)の共生は、Glomeromycota門の真菌と植物の根との間の内部共生関係であり、これは約4億〜4億5000万年前に初期の陸上植物の出現とともに進化しました14,15。維管束植物の80%以上は、AM菌によってコロニーを形成することができます16。この共生関係は、土壌からの植物栄養素の取り込みを促進し、それによって成長とストレス耐性を改善します17,18,19,20。例えば、塩ストレスの間、AM菌はイオンバランスを維持し、水と栄養素の利用可能性、抗酸化活性、光合成効率、および植物の二次代謝産物産生を向上させるのに役立ちます2,21,22,23。さらに、AM共生は、Na+の過剰な取り込みと根から新芽への輸送を防ぎ、K+、Mg2+、Ca2+などの必須カチオンの吸収を促進します。このプロセスは、生理食塩水条件下で植物におけるMg2+/Na+またはK+/Na+比を増加させる23,24,25,26,27,28,29。

イネ(Oryza sativa L.)は、世界人口の半数以上にとって重要な食用作物であり、イネ科(イネ科)に属し、塩ストレスの影響を非常に受けやすい30。研究はまた、イネの塩ストレス耐性を高める上でのAM菌の役割を強調しています31,32,33。例えば、AM菌Claroideoglomus etunicatumは、塩ストレス下でのイネ(Oryza sativa L. cv. Puntal)のCO2固定効率を改善する31。さらに、液胞ナトリウム隔離および新芽から根へのNa+再循環に関連する主要なイネトランスポーター遺伝子の発現は、塩ストレス下でAMコロニー化された植物で増強される32。さらに、Glomus etunicatumを接種した陸稲は、塩水条件下での光合成能力の向上、浸透圧生産の増加、浸透圧能の向上、および穀物収量の増加を示します33。また、本研究の先行研究では、菌根イネ(Oryza sativaL. cv. Nipponbare)が、AM共生により、新芽と生殖生長が良好であること、新芽のK+/Na+比が著しく高いこと、およびAM共生により活性酸素種(ROS)の清掃能力が向上することも示された34。これらの知見はすべて、フェノミックアプローチを通じて、AM共生がイネの塩ストレス耐性にプラスの影響を与えることを示しています。ただし、実験方法はビデオ形式で公開されていません。

AM菌類は、ライフサイクルを完了するために宿主根を必要とする必須の共生生物であり、植物を使用してAM菌種を産生することは、研究の進行にとって非常に重要です35。バーミキュライトや砂などの基質でAM菌を増殖させ、胞子を採取して接種36を行う基質ベースの生産システムは、大規模なAM菌の接種物生産に費用対効果の高いソリューションを提供します。胞子生産の効率は、植物の適合性と成長に依存し、真菌のコロニー形成と繁殖に影響を与えます37,38。ただし、この方法は時間がかかることが多く、従来のアプローチでは最大120日かかり、胞子の生成は少なくなります。最近の改良により、LED照明条件下でトウモロコシをホストプラントとして使用すると、生産期間が90日に短縮されました39。しかし、10週間以内にAllium tuberosum L.を使用してRhizophagus irregularisの胞子を含む砂接種物を生成するための堅牢な方法が提示されています。この砂接種物は、菌根イネの成長表現型を分析し、塩ストレス下でのトリパンブルー染色を使用して真菌のコロニー形成レベルを定量化するために使用できます。これらのアプローチは、AM共生がイネの塩分耐性をどのように強化するかをさらに調査するために、AM真菌接種物を効率的に生成します。

プロトコル

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、材料表に記載されています。

1. Allium tuberosum Lを用いたRhizophagus irregularisの胞子を含む砂接種物の生成。

  1. 水道水で砂を洗い、オートクレーブします。
  2. 鍋に砂の2/3を加えます(上部の直径14.7cm、下部の直径11.5cm、高さ13cm)。AM菌 Rhizophagus irregularisの胞子を1,000個追加します。薄い砂の層で覆います。にんにくチャイブ(Allium tuberosum L.)の30種を加え、種を砂で覆います。
  3. にんにくチャイブをチャンバー内で、23.5°C(相対湿度55%)で16時間/8時間の昼夜サイクルで育てます。最初の1週間(接種後1週間、wpi)は、にんにくをアルミナ紙で覆って光を遮断し、週に3回水をやります。
  4. 2 wpiから始めて、にんにくを週に2回、25μMのKH2PO4を含む80mLの半強度のHoagland溶液で施肥します。週に一度、80mLの水で施肥します。
  5. 10週間後、ニンニクチャイブの根を収穫してトリパンブルー染色し、真菌のコロニー形成のレベルを評価します。コロニー形成レベルが70%を超える場合は、砂が乾くまで(約5週間)にニンニクチャイブに水をやめます。すべての砂の接種物をビニール袋に入れ、4°Cの冷蔵庫で保管します。

2. 真菌のコロニー形成レベルを確認するためのトリパンブルー染色

  1. 根片を10%KOH中、>90°Cで30分間インキュベートします。KOHを取り外します。
  2. 根片を二重蒸留水(ddH2O)で3回すすいでください。
  3. 根片を0.3 M HClで15分から2時間インキュベートします。HClを取り外します。
  4. 0.1%トリパンブルー1mLを加え、サンプルを>90°Cで8分間インキュベートします。
  5. 根片を50%酸性グリセロールで洗います。10個の根片をスライドに移し、50%酸性グリセロールを一滴加えます。
  6. カバースリップを密封し、マニキュアでスライドさせます。
  7. 顕微鏡で各根の10の視野を調べて、真菌構造の存在を記録します。真菌のコロニー形成レベルをパーセンテージで計算します。
    注:50%酸性グリセロール:グリセロールと0.3 M HClを1:1の比率で混合して調製します。0.1%トリパンブルー:100mgのトリパンブルーを2:1:1乳酸、グリセロール、およびddH2Oの混合物に溶解します。

3. イネ苗への砂接種と塩ストレス処理

  1. 米の種から外皮(殻)を取り除きます。
  2. 種子を70%エタノール(EtOH)で4分間30秒間滅菌します。
  3. 米の種を遠心分離管に入れます。3%漂白剤(滅菌dH2Oで調製)を加え、30分間振とうします。
  4. 漂白剤を取り除き、種子を無菌dH2O 3〜4回、層流フード内で洗浄します。
  5. 0.8%寒天を含む半量のMurashige-Skoog培地(1/2 MS)で、30°Cの暗所で5日間種子を育てます。
  6. 30/28°C、湿度70%の場所で12時間の昼夜サイクルで2日間、稲の苗を育てます。
  7. 米の苗を滅菌した砂の入ったプラスチックチューブに移します。接種なし(模擬)または Rhizophagus irregularis (Ri)の胞子を含む5mLの砂接種液を追加します。
  8. 接種後の最初の週は、週7日、dH2Oで稲に水をやります。25μMのKH2PO4を含む半強度のHoagland溶液で2日おきに植物を施肥します。
  9. 接種後5週間(wpi)で、1つのバッチを150 mMのNaClで処理し(生理食塩水)、もう1つのバッチをNaClなしで放置します(非生理食塩水)。
    1. 非生理食塩水の状態では、火曜日に25μMのKH2PO4を含む半強度のHoagland溶液で植物に水をやり、残りの週は水で水をやります。
    2. 生理食塩水の状態では、火曜日に25 μMのKH2PO4を含む半強度のHoagland溶液で植物に水をやり、月曜日、水曜日、金曜日に150 mMのNaClで水をやり、残りの週は水で水をやります。
  10. 8 wpiで、植物を収穫して新鮮な重量を測定します。植物を70°Cのオーブンに2日間置き、乾燥重量を測定します。トリパンブルー染色により真菌のコロニー形成レベルを分析します。

結果

ステップ バイ ステップのワークフローを 図 1 に示します。接種後10週(wpi)には、ニンニクの根の内部に、後期とAM共生の特徴である小胞や胞子などの真菌構造がはっきりと観察されました(図2A)。根治内菌糸、アーバスキュール、小胞、根治外菌糸、胞子のレベルはそれぞれ80%、47%、63%、4%、1%であ?...

ディスカッション

砂の接種物の準備と使用に関するいくつかのヒントがあります。まず、私たちの経験から、ニンニクチャイブのコロニー形成レベルは70%より高くなければなりません(図2C)。そうしないと、トマトや米などの他の植物への次の接種は、接種後7週間(wpi)で50%以上に達することはありません(図2E)。次に、砂の接種物は、保管す?...

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

Yun-Hsin Chen氏がイネのAM増強塩ストレス耐性を調査するシステムを確立し、Kai-Chieh Chang氏が砂の接種材料を生成するシステムを確立したことを認めます。この研究は、台湾の国家科学技術評議会(NSTC 113-2326-B-002 -008 -MY3)からの助成金によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
(NH4)6Mo7O24.4H2OFERAK12054-85-2half-strength Hoagland solution
BleachGaulixGaulix-2108rice sterilization 
Ca(NO3)2.4H2OSigma13477-34-4half-strength Hoagland solution
CuSO4.5H2OSigma7758-99-8half-strength Hoagland solution
EtOHHoneywell67-63-0rice sterilization 
Fe-citrateSigma3522-50-7half-strength Hoagland solution
Garlic chives seedsKNOWN-YOU SEED Co., LTD.V-015Allium tuberosum L. seeds
GlycerolJ.T.Baker56-81-5Trypan blue staining
HClSigma7647-01-0Trypan blue staining
KClMerck 7447-40-7half-strength Hoagland solution
KH2PO4Merck7646-93-7half-strength Hoagland solution
KNO3Avantor7757-79-1half-strength Hoagland solution
KOHHoneywell1310-58-3Trypan blue staining
Lactic acidSigma50-81-7Trypan blue staining
MgSO4.7H2OSigma10034-99-8half-strength Hoagland solution
MnSO4.H2OHoneywell10034-96-5half-strength Hoagland solution
MS saltsPhytoTechM404half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Na2B4O7.10H2OSigma1330-43-4half-strength Hoagland solution
NaClBioshop7647-14-5salt stress treatment
NaOHJ.T.Baker1310-73-2half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Rhizophagus irregularis sporePremier TechL-ASP-AAM fungal spore (MycoriseASP, Premier Tech, Rivière-du-Loup, Québec, Canada )
SucroseBioshop57-50-1half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Trypan blueSigma72-57-1Trypan blue staining
ZnSO4.7H2OAvantor7446-20-0half-strength Hoagland solution

参考文献

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