Produktion von arbuskulärem Mykorrhiza-Pilzinokulum (AM) und phänotypische Bewertung der Symbiose von Reis und AM unter salzhaltigen Bedingungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Generierung von arbuskulären Mykorrhizapilzen (AM) Inokulum, um die AM-verstärkte Salzstresstoleranz in Reis zu untersuchen.

Zusammenfassung

Reis (Oryza sativa L.) ist für mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung ein lebenswichtiges Nahrungsmittel. Ihr Wachstum wird jedoch stark durch salzhaltige Böden beeinträchtigt, die eine große Herausforderung für den Pflanzenbau weltweit darstellen. Es hat sich gezeigt, dass arbuskuläre Mykorrhizapilze (AM), die mit über 90 % der landwirtschaftlichen Pflanzen und 80 % der terrestrischen Pflanzenarten wechselseitige symbiotische Beziehungen eingehen, die Salztoleranz von Reispflanzen erhöhen. AM-Pilze sind obligate Symbionten, die ihren Lebenszyklus ohne eine Wirtswurzel nicht abschließen können. Daher ist die effektive Nutzung von Pflanzen zur Herstellung von AM-Pilzinokulum von entscheidender Bedeutung, um die Forschung auf diesem Gebiet voranzutreiben. In dieser Studie stellen wir eine Reihe robuster Methoden vor, die mit der Erzeugung von Sandinokulum beginnen, das Sporen von Rhizophagus irregularis enthält, unter Verwendung von Allium tuberosum L. Zu diesen Methoden gehören die Inokulation von Reissämlingen mit dem Sandinokulum, die Analyse des Wachstumsphänotyps von Mykorrhizareis und die Quantifizierung des Pilzbesiedlungsgrades mittels Trypanblau-Färbung unter Salzstress. Diese Ansätze können effizient AM-Pilzinokulum erzeugen, um weiter zu untersuchen, wie die AM-Symbiose die Salzgehaltstoleranz von Reis erhöht.

Einleitung

Salzhaltige Böden sind weltweit ein erhebliches Hindernis für die Pflanzenproduktion ^1,2,3. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass bis 2050 bis zu 50 % der Anbauflächen durch Versalzung degradiert sein^{werden 4}. Salzhaltige Böden verursachen bei Pflanzen vor allem Toxizität aufgrund der Akkumulation von Natrium- (Na⁺) und Chlorid- (Cl^-) Ionen in pflanzlichen Geweben. Diese Ionen, die in salzhaltigen Böden dominieren, sind auch für Pflanzen am schädlichsten ^5,6,7. Zum Beispiel hemmt Natrium viele zytosolische Enzymaktivitäten⁸. Salzstress beeinflusst auch die photosynthetische Effizienz und induziert Veränderungen der Ionentoxizität, des osmotischen Drucks und der Zellwandstruktur, was zusammen zur Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies (^ROS) führt9,10,11,12,13.

Die Symbiose der arbuskulären Mykorrhiza (AM) ist eine endosymbiotische Assoziation zwischen Pilzen des Stammes Glomeromycota und Pflanzenwurzeln, die sich vor etwa 400-450 Millionen Jahren mit dem Aufkommen früher Landpflanzen entwickelt^{hat 14,15}. Über 80% der Gefäßpflanzen können von AM-Pilzen besiedelt sein¹⁶. Diese mutualistische Beziehung erhöht die Nährstoffaufnahme der Pflanzen aus dem Boden und verbessert dadurch das Wachstum und die Stresstoleranz 17,18,19,20. Zum Beispiel können AM-Pilze bei Salzstress das Ionengleichgewicht aufrechterhalten und dazu beitragen, die Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit, die antioxidative Aktivität, die photosynthetische Effizienz und die Produktion von Sekundärmetaboliten für Pflanzen zu verbessern 2,21,22,23. Darüber hinaus verhindert die AM-Symbiose eine übermäßige Aufnahme und den Transport von Na+ von den Wurzeln zu den Trieben und fördert die Absorption von essentiellen Kationen wie K⁺, Mg²⁺ und Ca²⁺. Dieser Prozess erhöht das Mg²⁺/Na⁺- oder K⁺/Na⁺-Verhältnis in Pflanzen unter salzhaltigen Bedingungen 23,24,25,26,27,28,29.

Reis (Oryza sativa L.), eine wichtige Nahrungspflanze für mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung, gehört zur Familie der Gramineae (Poaceae) und ist sehr anfällig für Salzstress³⁰. Studien haben auch die Rolle von AM-Pilzen bei der Verbesserung der Salzstresstoleranz bei Reis hervorgehoben 31,32,33. So verbessert beispielsweise der AM-Pilz Claroideoglomus etunicatum die CO₂ -Fixierungseffizienz von Reis (Oryza sativa L. cv. Puntal) unter Salzstress³¹. Darüber hinaus ist die Expression wichtiger Reistransporter-Gene, die mit der vakuolären Natriumsequestrierung und der Na+-Rezirkulation von den Trieben zu den Wurzeln assoziiert sind, in AM-besiedelten Pflanzen unter Salzstress erhöht³². Darüber hinaus zeigen Hochlandreispflanzen, die mit Glomus etunicatum geimpft wurden, eine verbesserte Photosynthesekapazität, eine erhöhte Osmolytproduktion, ein verbessertes osmotisches Potenzial und einen höheren Kornertrag unter salzhaltigen Bedingungen³³. Unsere früheren Forschungen zeigten auch, dass Mykorrhizareis (Oryza sativaL. cv. Nipponbare) ein besseres Spross- und Fortpflanzungswachstum, ein deutlich höheres K⁺/Na⁺-Verhältnis im Spross und eine verbesserte Aasfängerkapazität für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) aufgrund der AM-Symbiose³⁴ aufwies. All diese Ergebnisse zeigen den positiven Einfluss der AM-Symbiose auf die Salzstresstoleranz bei Reis durch phänomische Ansätze. Die experimentellen Methoden wurden jedoch nicht im Videoformat veröffentlicht.

AM-Pilze sind obligate Symbionten, die eine Wirtswurzel benötigen, um ihren Lebenszyklus zu vervollständigen, so dass die Verwendung von Pflanzen zur Herstellung von AM-Pilzinokulum für den Forschungsfortschritt von entscheidender Bedeutung ist³⁵. Ein substratbasiertes Produktionssystem, bei dem AM-Pilze in Substraten wie Vermiculit oder Sand gezüchtet und Sporen für Inokulum³⁶ gesammelt werden, bietet eine kostengünstige Lösung für die großflächige Produktion von AM-Pilzinokulumen. Die Effizienz der Sporenproduktion hängt von der Verträglichkeit und dem Wachstum der Pflanzen ab, die sich auf die Pilzbesiedlung und -vermehrung auswirken^37,38. Diese Methode ist jedoch oft zeitaufwändig, da herkömmliche Ansätze bis zu 120 Tage dauern und zu einer geringen Sporenproduktion führen. Jüngste Verbesserungen haben die Produktionsdauer auf 90 Tage verkürzt, wobei Mais als Wirtspflanze unter LED-Lichtbedingungen verwendet wurde³⁹. Es wird jedoch ein robustes Verfahren zur Erzeugung eines Sandinokulums vorgestellt, das Sporen von Rhizophagus irregularis enthält, unter Verwendung von Allium tuberosum L. innerhalb von 10 Wochen. Dieses Sandinokulum kann verwendet werden, um den Wachstumsphänotyp von Mykorrhizareis zu analysieren und den Grad der Pilzbesiedlung durch Trypanblau-Färbung unter Salzstress zu quantifizieren. Diese Ansätze generieren effizient AM-Pilzinokulum, um weiter zu untersuchen, wie die AM-Symbiose die Salzgehaltstoleranz von Reis erhöht.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Erzeugung eines Sandinokulums, das Sporen von Rhizophagus irregularis enthält, unter Verwendung von Allium tuberosum L.

1. Sand mit Leitungswasser waschen und autoklavieren.
2. 2/3 des Sandes in einen Topf geben (oberer Durchmesser 14,7 cm, unterer Durchmesser 11,5 cm, Höhe 13 cm). Fügen Sie 1.000 Sporen des AM-Pilzes Rhizophagus irregularis hinzu. Mit einer dünnen Schicht Sand bedecken. 30 Samen Knoblauch-Schnittlauch (Allium tuberosum L.) dazugeben und die Kerne mit Sand bedecken.
3. Den Knoblauch-Schnittlauch in der Kammer mit einem 16-h/8-stündigen Tag-/Nachtzyklus bei 23,5 °C (55 % relative Luftfeuchtigkeit) anbauen. Decken Sie den Knoblauch-Schnittlauch in der ersten Woche (1 Woche nach der Inokulation, wpi) mit Aluminiumoxidpapier ab, um das Licht abzuhalten, und gießen Sie ihn dreimal pro Woche.
4. Ab 2 ppi den Knoblauch-Schnittlauch zweimal pro Woche mit 80 mL halbstarker Hoagland-Lösung mit 25 μM KH₂PO₄ düngen. Düngen Sie einmal pro Woche mit 80 ml Wasser.
5. Ernten Sie nach 10 Wochen die Wurzeln von Knoblauchschnittlauch für die Trypanblaufärbung, um den Grad der Pilzbesiedlung zu beurteilen. Wenn der Besiedlungsgrad 70% übersteigt, hören Sie auf, den Knoblauch-Schnittlauch zu gießen, bis der Sand trocken ist (ca. 5 Wochen). Geben Sie das gesamte Sandinokulum in eine Plastiktüte und lagern Sie es im Kühlschrank bei 4 °C.

2. Trypanblau-Färbung zur Überprüfung des Grades der Pilzbesiedlung

1. Wurzelstücke 30 min bei >90 °C in 10% KOH inkubieren. Entfernen Sie das KOH.
2. Spülen Sie die Wurzelstücke dreimal mit doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) ab.
3. Inkubieren Sie die Wurzelstücke mit 0,3 M HCl für 15 min bis 2 h. Entfernen Sie die HCl.
4. 1 ml 0,1 % Trypanblau zugeben und die Proben 8 Minuten lang bei >90 °C inkubieren.
5. Waschen Sie die Wurzelstücke mit 50% saurem Glycerin. Übertragen Sie 10 Wurzelstücke auf Objektträger und fügen Sie einen Tropfen 50% saures Glycerin hinzu.
6. Versiegeln Sie die Deckgläser und schieben Sie sie mit Nagellack ein.
7. Untersuchen Sie 10 Sichtfelder jeder Wurzel unter einem Mikroskop, um das Vorhandensein von Pilzstrukturen zu erfassen. Berechnen Sie den Grad der Pilzbesiedlung in Prozent.
   HINWEIS: 50% saures Glycerin: Bereiten Sie vor, indem Sie Glycerin und 0,3 M HCl im Verhältnis 1:1 mischen. 0,1 % Trypanblau: Lösen Sie 100 mg Trypanblau in einer Mischung aus 2:1:1 Milchsäure, Glycerin und ddH₂O.

3. Beimpfung der Reissetzlinge mit Sandinokulum und Salzstressbehandlung

1. Entfernen Sie die Schale (Hülse) von den Reissamen.
2. Sterilisieren Sie die Samen mit 70% Ethanol (EtOH) für 4 min und 30 s.
3. Gib die Reissamen in ein Zentrifugenröhrchen. 3% Bleichmittel (zubereitet mit sterilem dH₂O) zugeben und 30 min schütteln.
4. Entfernen Sie das Bleichmittel und waschen Sie die Samen mit sterilem dH₂O 3-4 Mal in der Laminar-Flow-Haube.
5. Züchten Sie die Samen in einem Medium mit halbfester Stärke Murashige-Skoog (1/2 MS) mit 0,8 % Agar bei 30 °C im Dunkeln für 5 Tage.
6. Ziehen Sie die Reissetzlinge 2 Tage lang mit einem 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklus bei 30/28 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit an.
7. Füllen Sie die Reissetzlinge in Plastikröhrchen mit sterilisiertem Sand um. Fügen Sie entweder kein Inokulum (Schein) oder 5 ml Sandinokulum hinzu, das Sporen von Rhizophagus irregularis (Ri) enthält.
8. Gießen Sie die Reispflanzen in der ersten Woche nach der Inokulation an 7 Tagen in der Woche mit dH₂O. Düngen Sie die Pflanzen jeden zweiten Tag mit einer halbstarken Hoagland-Lösung, die 25 μM KH₂PO₄ enthält.
9. 5 Wochen nach der Inokulation (wpi) behandeln Sie eine Charge mit 150 mM NaCl (salzhaltiger Zustand) und belassen Sie die andere Charge ohne NaCl (nicht salzhaltiger Zustand).
   1. Für den nicht salzhaltigen Zustand gießen Sie die Pflanzen am Dienstag mit halbstarker Hoagland-Lösung mit 25 μM KH₂PO₄ und den Rest der Woche mit Wasser.
   2. Für den salzhaltigen Zustand gießen Sie die Pflanzen am Dienstag mit halbfester Hoagland-Lösung mit 25 μM KH₂PO₄, montags, mittwochs und freitags mit 150 mM NaCl und für den Rest der Woche mit Wasser.
10. Ernte die Pflanzen bei 8 wpi, um ihr Frischgewicht zu messen. Stellen Sie die Pflanzen für 2 Tage in einen 70 °C Ofen, um das Trockengewicht zu messen. Analysieren Sie den Grad der Pilzbesiedlung durch Trypanblau-Färbung.

Ergebnisse

Der Schritt-für-Schritt-Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. 10 Wochen nach der Inokulation (wpi) wurden Pilzstrukturen wie Vesikel und Sporen, die für das Spätstadium und die AM-Symbiose charakteristisch sind, in den Wurzeln von Knoblauchschnittlauch deutlich beobachtet (Abbildung 2A). Der Gehalt an intraradikalen Hyphen, Arbuskeln, Bläschen, extraradikalen Hyphen und Sporen betrug 80 %,...

Diskussion

Es gibt ein paar Tipps zur Vorbereitung und Verwendung von Sandinokulum. Erstens sollte nach unserer Erfahrung der Besiedlungsgrad von Knoblauch-Schnittlauch höher als 70 % sein (Abbildung 2C). Andernfalls wird die folgende Inokulation an anderen Pflanzen, wie Tomaten und Reis, 7 Wochen nach der Inokulation (wpi) nicht erfolgreich über 50 % erreichen (Abbildung 2E). Zweitens sollte das Sandinokulum vor der Lagerung gründlich ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)6Mo7O24.4H2O	FERAK	12054-85-2	half-strength Hoagland solution
Bleach	Gaulix	Gaulix-2108	rice sterilization
Ca(NO3)2.4H2O	Sigma	13477-34-4	half-strength Hoagland solution
CuSO4.5H2O	Sigma	7758-99-8	half-strength Hoagland solution
EtOH	Honeywell	67-63-0	rice sterilization
Fe-citrate	Sigma	3522-50-7	half-strength Hoagland solution
Garlic chives seeds	KNOWN-YOU SEED Co., LTD.	V-015	Allium tuberosum L. seeds
Glycerol	J.T.Baker	56-81-5	Trypan blue staining
HCl	Sigma	7647-01-0	Trypan blue staining
KCl	Merck	7447-40-7	half-strength Hoagland solution
KH2PO4	Merck	7646-93-7	half-strength Hoagland solution
KNO3	Avantor	7757-79-1	half-strength Hoagland solution
KOH	Honeywell	1310-58-3	Trypan blue staining
Lactic acid	Sigma	50-81-7	Trypan blue staining
MgSO4.7H2O	Sigma	10034-99-8	half-strength Hoagland solution
MnSO4.H2O	Honeywell	10034-96-5	half-strength Hoagland solution
MS salts	PhytoTech	M404	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Na2B4O7.10H2O	Sigma	1330-43-4	half-strength Hoagland solution
NaCl	Bioshop	7647-14-5	salt stress treatment
NaOH	J.T.Baker	1310-73-2	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Rhizophagus irregularis spore	Premier Tech	L-ASP-A	AM fungal spore (MycoriseASP, Premier Tech, Rivière-du-Loup, Québec, Canada )
Sucrose	Bioshop	57-50-1	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Trypan blue	Sigma	72-57-1	Trypan blue staining
ZnSO4.7H2O	Avantor	7446-20-0	half-strength Hoagland solution