ייצור חיסון פטרייתי של מיקוריזה ארבוסקולרית (AM) והערכה פנוטיפית של סימביוזה של אורז ו-AM בתנאי מלח

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חיסון פטריות מיקוריזה ארבוסקולר (AM) כדי לחקור סבילות מוגברת למלח באורז.

Abstract

אורז (Oryza sativa L.) הוא גידול מזון חיוני ליותר ממחצית מאוכלוסיית העולם. עם זאת, צמיחתו מושפעת קשות מקרקעות מלוחות, המהוות אתגר משמעותי לייצור יבולים ברחבי העולם. הוכח כי פטריות מיקוריזה ארבוסקולריות (AM), היוצרות קשרים סימביוטיים הדדיים עם למעלה מ-90% מהצמחים החקלאיים ו-80% ממיני הצמחים היבשתיים, משפרות את הסבילות למלח של צמחי אורז. פטריות AM הן סימביונטים מחויבים שאינם יכולים להשלים את מחזור חייהם ללא שורש מארח. לכן, ניצול יעיל של צמחים לייצור חיסון פטרייתי AM הוא חיוני לקידום המחקר בתחום זה. במחקר זה, אנו מציגים סדרה של שיטות חזקות המתחילות ביצירת חיסון חול המכיל נבגים של Rhizophagus irregularis באמצעות Allium tuberosum L. שיטות אלה כוללות חיסון שתילי אורז בחיסון החול, ניתוח פנוטיפ הגידול של אורז מיקוריזה וכימות רמות ההתיישבות הפטרייתית באמצעות צביעה כחולה של טריפן תחת לחץ מלח. גישות אלו יכולות לייצר ביעילות חיסון פטרייתי AM לחקירה נוספת כיצד סימביוזה AM משפרת את סבילות המליחות של אורז.

Introduction

קרקע מלוחה מהווה מכשול משמעותי לייצור יבולים ברחבי העולם ^1,2,3. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שעד 50% מהאדמות המעובדות יושפלו עד 2050 עקב המלחה⁴. קרקעות המושפעות ממלח גורמות בעיקר לרעילות בצמחים עקב הצטברות יוני נתרן (Na⁺) וכלוריד (Cl⁻) ברקמות הצמח. יונים אלה, השולטים בקרקעות מלוחות, הם גם המזיקים ביותר לצמחים ^5,6,7. לדוגמה, נתרן מעכב פעילויות אנזימים ציטוזוליות רבות⁸. מתח מלח משפיע גם על יעילות הפוטוסינתזה וגורם לשינויים ברעילות יונית, לחץ אוסמוטי ומבנה דופן התא, מה שמוביל ביחד להצטברות של מיני חמצן תגובתיים (ROS)9,10,11,12,13.

סימביוזה של מיקוריזה ארבוסקולרית (AM) היא קשר אנדוסימביוטי בין פטריות ממשפחת Glomeromycota ושורשי צמחים, שהתפתחו לפני כ-400-450 מיליון שנה עם הופעתם של צמחי יבשה מוקדמים^14,15. למעלה מ-80% מצמחי כלי הדם יכולים להתיישב על ידי פטריות AM¹⁶. מערכת יחסים הדדית זו משפרת את ספיגת חומרי המזון של הצמחים מהאדמה, ובכך משפרת את הצמיחה ואת עמידות העקה 17,18,19,20. לדוגמה, במהלך עקת מלח, פטריות AM יכולות לשמור על איזון יונים ולעזור לשפר את זמינות המים והחומרים המזינים, פעילות נוגדת חמצון, יעילות פוטוסינתטית וייצור מטבוליט משני לצמחים 2,21,22,23. בנוסף, סימביוזה AM מונעת ספיגה מוגזמת של Na+ והובלה מהשורשים לנצרים, ומקדמת ספיגה של קטיונים חיוניים כגון K⁺, Mg²⁺ ו-Ca²⁺. תהליך זה מגדיל את יחס Mg²⁺/Na⁺ או K⁺/Na⁺ בצמחים בתנאי מלח 23,24,25,26,27,28,29.

אורז (Oryza sativa L.), גידול מזון חיוני ליותר ממחצית מאוכלוסיית העולם, שייך למשפחת Gramineae (Poaceae) והוא רגיש מאוד לעקת מלח³⁰. מחקרים הדגישו גם את תפקידן של פטריות AM בשיפור הסבילות ללחץ מלח באורז 31,32,33. לדוגמה, פטריית AM Claroideoglomus etunicatum משפרת את יעילות הקיבוע של CO₂ של אורז (Oryza sativa L. cv. Puntal) תחת לחץ מלח³¹. יתר על כן, הביטוי של גנים מרכזיים של טרנספורטר אורז הקשורים לקיבוע נתרן ואקואולרי ומחזור Na+ מהקלעים לשורשים משופר בצמחים שעברו מושבות AM תחת עקת מלח³². בנוסף, מפעלי אורז הרמה המחוסנים ב-Glomus etunicatum מציגים יכולת פוטוסינתטית משופרת, ייצור אוסמוליט מוגבר, פוטנציאל אוסמוטי משופר ותפוקת תבואה גדולה יותר בתנאים מלוחים³³. המחקר הקודם שלנו הראה גם שאורז מיקוריזה (Oryza sativaL. cv. Nipponbare) הפגין צמיחה טובה יותר של יורה ורבייה, יחס K⁺/Na⁺ גבוה משמעותית ביורה, ויכולת ניקוי משופרת של מיני חמצן תגובתיים (ROS) עקב סימביוזה^{AM 34}. כל הממצאים הללו מדגימים את ההשפעה החיובית של סימביוזה AM על סבילות למלח באורז באמצעות גישות פנומיות. עם זאת, שיטות הניסוי לא פורסמו בפורמט וידאו.

פטריות AM הן סימביונטים מחויבים הדורשים שורש מארח כדי להשלים את מחזור החיים שלהם, מה שהופך את השימוש בצמחים לייצור חיסון פטרייתי AM חיוני להתקדמות המחקר³⁵. מערכת ייצור מבוססת מצע, שבה מגדלים פטריות AM במצעים כמו ורמיקוליט או חול ונבגים נאספים לחיסון³⁶, מציעה פתרון חסכוני לייצור חיסון פטרייתי AM בקנה מידה גדול. היעילות של ייצור הנבגים תלויה בתאימות הצמח ובצמיחה, המשפיעים על קולוניזציה והתפשטות פטריות^37,38. עם זאת, שיטה זו לרוב גוזלת זמן, כאשר גישות מסורתיות לוקחות עד 120 יום ומניבות ייצור נבגים נמוך. שיפורים אחרונים צמצמו את תקופת הייצור ל-90 יום תוך שימוש בתירס כצמח המארח בתנאי תאורת LED³⁹. עם זאת, מוצגת שיטה חזקה ליצירת חיסון חול המכיל נבגים של Rhizophagus irregularis באמצעות Allium tuberosum L. תוך 10 שבועות. ניתן להשתמש בחיסון חול זה כדי לנתח את פנוטיפ הצמיחה של אורז מיקוריזה ולכמת את רמות ההתיישבות הפטרייתית באמצעות צביעה כחולה טריפן תחת לחץ מלח. גישות אלו מייצרות ביעילות חיסון פטרייתי AM לחקירה נוספת כיצד סימביוזה AM משפרת את סובלנות המליחות של אורז.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. יצירת חיסון חול המכיל נבגים של Rhizophagus irregularis באמצעות Allium tuberosum L.

1. שוטפים חול במי ברז ומבצעים חיטוי.
2. מוסיפים 2/3 מהחול לסיר (קוטר עליון 14.7 ס"מ, קוטר תחתון 11.5 ס"מ, גובה 13 ס"מ). הוסף 1,000 נבגים של פטריות AM Rhizophagus irregularis. מכסים בשכבה דקה של חול. מוסיפים 30 זרעי עירית שום (Allium tuberosum L.) ומכסים את הזרעים בחול.
3. מגדלים את עירית השום בתא במחזור יום/לילה של 16 שעות/8 שעות בטמפרטורה של 23.5 מעלות צלזיוס (55% לחות יחסית). במהלך השבוע הראשון (שבוע לאחר החיסון, wpi), מכסים את עירית השום בנייר אלומינה כדי לחסום את האור ולהשקות אותם שלוש פעמים בשבוע.
4. החל מ-2 wpi, דשן את עירית השום פעמיים בשבוע עם תמיסת הוגלנד בחצי חוזק של 80 מ"ל המכילה 25 מיקרומטר KH₂PO₄. דשן פעם בשבוע עם 80 מ"ל מים.
5. לאחר 10 שבועות, קצרו את שורשי עירית השום לצביעה כחולה של טריפן כדי להעריך את רמת ההתיישבות הפטרייתית. אם רמת ההתיישבות עולה על 70%, הפסיקו להשקות את עירית השום עד שהחול יבש (כ -5 שבועות). הכניסו את כל חיסון החול לשקית ניילון ואחסנו אותו במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס.

2. מכתים כחולים טריפן לבדיקת רמת ההתיישבות הפטרייתית

1. יש לדגור על חתיכות שורש למשך 30 דקות בטמפרטורה של >90 מעלות צלזיוס ב-10% KOH. הסר את ה-KOH.
2. שוטפים את חתיכות השורש במים מזוקקים כפול (ddH₂O) שלוש פעמים.
3. דגרו על חתיכות השורש עם 0.3 M HCl למשך 15 דקות עד שעתיים. הסר את ה-HCl.
4. מוסיפים 1 מ"ל של 0.1% טריפן כחול ודוגרים על הדגימות למשך 8 דקות בטמפרטורה של >90 מעלות צלזיוס.
5. שוטפים את חתיכות השורש עם 50% גליצרול חומצי. מעבירים 10 חתיכות שורש לשקופיות ומוסיפים טיפה של 50% גליצרול חומצי.
6. אטמו את הכיסויים והחליקו עם לק.
7. בחן 10 שדות ראייה של כל שורש תחת מיקרוסקופ כדי לתעד את נוכחותם של מבנים פטרייתיים. חשב את רמת ההתיישבות הפטרייתית באחוזים.
   הערה: 50% גליצרול חומצי: יש להכין על ידי ערבוב של גליצרול ו-0.3 M HCl ביחס של 1:1. 0.1% טריפן כחול: ממיסים 100 מ"ג טריפן כחול בתערובת של 2:1:1 חומצה לקטית, גליצרול ו-ddH₂O.

3. חיסון שתילי אורז עם חיסון חול וטיפול במתח מלח

1. הסר את הקליפה (הקליפה) מזרעי האורז.
2. עקרו את הזרעים עם 70% אתנול (EtOH) למשך 4 דקות ו -30 שניות.
3. מניחים את זרעי האורז בצינור צנטריפוגה. מוסיפים אקונומיקה 3% (מוכן עם dH₂O סטרילי) ומנערים למשך 30 דקות.
4. הסר את האקונומיקה ושטוף את הזרעים עם dH_{סטרילי 2}O 3-4 פעמים בתוך מכסה המנוע הלמינר.
5. מגדלים את הזרעים במדיום Murashige-Skoog (1/2 MS) בעל חצי חוזק המכיל 0.8% אגר ב-30 מעלות צלזיוס בחושך למשך 5 ימים.
6. מגדלים את שתילי האורז במחזור יום/לילה של 12 שעות בטמפרטורה של 30/28 מעלות צלזיוס ו-70% לחות אוויר למשך יומיים.
7. העבירו את שתילי האורז לצינורות פלסטיק המכילים חול מעוקר. הוסף ללא חיסון (מדומה) או 5 מ"ל של חיסון חול המכיל נבגים של Rhizophagus irregularis (Ri).
8. השקה את צמחי האורז ב-dH₂O 7 ימים בשבוע בשבוע הראשון לאחר החיסון. דשן את הצמחים כל יומיים בתמיסת הוגלנד בחצי חוזק המכילה 25 מיקרומטר של KH₂PO₄.
9. לאחר 5 שבועות לאחר החיסון (wpi), יש לטפל באצווה אחת ב-150 מ"מ של NaCl (מצב מלוח) ולהשאיר את האצווה השנייה ללא NaCl (מצב שאינו מלוח).
   1. למצב שאינו מלוח, יש להשקות את הצמחים בתמיסת הוגלנד בחצי חוזק המכילה 25 מיקרומטר של KH₂PO₄ ביום שלישי ובמים למשך שאר השבוע.
   2. לתנאי המלח, השקה את הצמחים בתמיסת הוגלנד בחצי חוזק המכילה 25 מיקרומטר של KH₂PO₄ ביום שלישי, עם 150 מ"מ של NaCl בימים שני, רביעי ושישי, ועם מים בשאר השבוע.
10. ב-8 wpi, קצרו את הצמחים כדי למדוד את משקלם הטרי. מכניסים את הצמחים לתנור של 70 מעלות למשך יומיים כדי למדוד את המשקל היבש. נתח את רמת ההתיישבות הפטרייתית על ידי צביעה כחולה טריפאן.

תוצאות

זרימת העבודה שלב אחר שלב מוצגת באיור 1. ב-10 שבועות לאחר החיסון (wpi), מבנים פטרייתיים כמו שלפוחיות ונבגים, האופייניים לשלב המאוחר ולסימביוזה של AM, נצפו בבירור בתוך שורשי עירית השום (איור 2A). רמות הקורים התוך-רדיקליים, ארבוסקו...

Discussion

ישנם מספר טיפים לגבי הכנה ושימוש בחיסון חול. ראשית, מניסיוננו, רמת ההתיישבות של עירית שום צריכה להיות גבוהה מ-70% (איור 2C). אחרת, החיסון הבא על צמחים אחרים, כמו למשל עגבנייה ואורז, לא יגיע בהצלחה ליותר מ-50% לאחר 7 שבועות לאחר החיסון (wpi) (איור 2E). ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)6Mo7O24.4H2O	FERAK	12054-85-2	half-strength Hoagland solution
Bleach	Gaulix	Gaulix-2108	rice sterilization
Ca(NO3)2.4H2O	Sigma	13477-34-4	half-strength Hoagland solution
CuSO4.5H2O	Sigma	7758-99-8	half-strength Hoagland solution
EtOH	Honeywell	67-63-0	rice sterilization
Fe-citrate	Sigma	3522-50-7	half-strength Hoagland solution
Garlic chives seeds	KNOWN-YOU SEED Co., LTD.	V-015	Allium tuberosum L. seeds
Glycerol	J.T.Baker	56-81-5	Trypan blue staining
HCl	Sigma	7647-01-0	Trypan blue staining
KCl	Merck	7447-40-7	half-strength Hoagland solution
KH2PO4	Merck	7646-93-7	half-strength Hoagland solution
KNO3	Avantor	7757-79-1	half-strength Hoagland solution
KOH	Honeywell	1310-58-3	Trypan blue staining
Lactic acid	Sigma	50-81-7	Trypan blue staining
MgSO4.7H2O	Sigma	10034-99-8	half-strength Hoagland solution
MnSO4.H2O	Honeywell	10034-96-5	half-strength Hoagland solution
MS salts	PhytoTech	M404	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Na2B4O7.10H2O	Sigma	1330-43-4	half-strength Hoagland solution
NaCl	Bioshop	7647-14-5	salt stress treatment
NaOH	J.T.Baker	1310-73-2	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Rhizophagus irregularis spore	Premier Tech	L-ASP-A	AM fungal spore (MycoriseASP, Premier Tech, Rivière-du-Loup, Québec, Canada )
Sucrose	Bioshop	57-50-1	half-strength Murashige–Skoog (1/2 MS) medium
Trypan blue	Sigma	72-57-1	Trypan blue staining
ZnSO4.7H2O	Avantor	7446-20-0	half-strength Hoagland solution