使用磁珠操纵发育中的斑马鱼心脏中的机械力

摘要

该协议概述了一种通过显微外科手术将磁珠嫁接到发育中的斑马鱼心脏的方法，能够在 体内 操纵机械力并触发心内膜细胞中机械刺激依赖性的钙内流。

摘要

机械力不断向心脏瓣膜形态发生程序提供反馈。在斑马鱼中，心脏瓣膜的发育依赖于心脏收缩和跳动的心脏产生的物理刺激。由血流驱动的心内血流动力学成为塑造胚胎心脏发育的基本信息。在这里，我们描述了一种通过在心脏管腔中嫁接直径为 30 μm 至 60 μm 的磁珠来操纵 体内 机械力的有效方法。珠子的插入是通过显微外科手术在麻醉的幼虫中进行的，不会干扰心脏功能，并且可以人为地改变边界条件，从而改变系统中的流力。因此，磁珠的存在放大了心内膜细胞所承受的机械力，并可以直接触发机械刺激依赖性的钙内流。这种方法有助于研究控制心脏发育的机械转导途径，并可以深入了解机械力在心脏瓣膜形态发生中的作用。

引言

自 1970 年代后期¹ 问世以来，斑马鱼 （Danio rerio） 已成为研究心脏发育和先天性心脏病复杂性的强大模型系统。与大多数脊椎动物（包括小鼠和雏鸡胚胎）不同，它们依赖于功能性心血管系统，无法在早期心脏缺陷中存活，斑马鱼通过能够研究严重的心脏表型提供了独特的优势。这是由于它们的体积小，通过被动扩散促进了充足的氧气供应，即使在没有心脏收缩和活跃血液循环的情况下也能存活 ^2,3,4。此外，斑马鱼的许多重要特征之一是其胚胎的光学透明性，这使得能够对发育中的心脏进行无创监测 5,6,7,8。

机械力不断向心脏瓣膜形态发生程序提供反馈 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ，而异常血流被广泛认为是各种心血管疾病的共同因素^23,24。在斑马鱼中，心脏瓣膜的发育依赖于心脏收缩和跳动心脏产生的机械力。多个斑马鱼突变体已经证明了心脏产生的机械刺激在瓣膜发生中的重要性。值得注意的是，在沉默心脏 （sih） 突变体中，由于心肌肌钙蛋白 T （tnnt2） 突变而导致的心脏收缩完全不存在，因此血流导致在早期形态发生阶段不存在组织收敛和心内膜细胞 （EdC） 聚集²⁵。

血流产生的心内血流动力学和机械力成为塑造斑马鱼胚胎心脏发育的基本表观遗传成分。大量研究表明，斑马鱼的正确心脏形态发生需要不同的流动刺激，偏离这些生理模式会导致心脏瓣膜缺陷 10,13,14,22,26。在这里，我们描述了一种有效的方法，改编自 Fukui 等人 ¹³，通过在发育中的斑马鱼跳动心脏内接枝直径为 30 μm 至 60 μm 的磁珠来操纵体内的机械力。该技术涉及将珠子显微外科插入麻醉幼虫的心脏腔，而不会干扰心脏功能。磁珠的存在导致 EdC 所承受的机械力被放大，直接触发机械刺激依赖性钙内流¹³。这种方法能够研究调节心脏形态发生的机械转导途径，并为加深我们对机械力在瓣膜形成中的作用的理解提供了一种方法。

研究方案

本协议中描述的处理斑马鱼胚胎的程序符合欧洲指令 2010/63/EU 和内政部在项目许可 PP6020928下的指导方针。

1. 获取斑马鱼胚胎进行珠子嫁接

1. 穿过相关的斑马鱼线，并在 28.5 °C 的 Danieau 培养基中培养胚胎。 有关穿越斑马鱼线的更详细说明，请参阅 JoVE 科学教育数据库²⁷。
2. 在Danieau培养基中使用浓度为0.003%PTU的受精后24小时（hpf）用1-苯基-2-硫脲（PTU）处理胚胎以抑制色素形成。
3. 如果使用荧光标记的线，请在开始珠子嫁接之前在荧光立体镜下检查胚胎，并选择 10-20 个表现出明亮荧光的健康胚胎。使用镊子在立体显微镜下轻轻地去绒毛膜化预选的胚胎，确保胚胎不受损伤。

2. 斑马鱼胚胎的镶嵌

1. 制备 20 mL 含有 0.02% 三卡因的 Danieau's 培养基。
2. 在 2 mL 微量离心管中制备 2 mL 等分试样，其中包含 0.02% 三卡因的 1% 低熔点 （LMP） 琼脂糖。将试管置于 38 °C 加热块中，以保持 LMP 琼脂糖处于液态。
   注:1% LMP 琼脂糖可以提前制备，以便在封固和珠子接枝当天使用。
3. 将 3-6 个去绒毛膜的胚胎转移到含有补充有 0.02% 三卡因的 Danieau 培养基的培养皿中。
4. 麻醉胚胎后，将它们转移到具有最少培养基的 35 mm x 15 mm 玻璃底培养皿中。快速加入 300-400 μL 含三卡因的 1% LMP 琼脂糖，形成圆顶。使用镊子定位胚胎，使它们笔直躺着，与玻璃接触，腹侧朝上，如图 1 所示。等待 ~4 分钟，让琼脂糖凝固。
   注:用于镶嵌胚胎的琼脂糖的数量非常重要。目标是大约 350 μL 的圆顶，它应该提供足够的覆盖，同时在胚胎上方留出几毫米的空间。对于初学者来说，一次安装较少数量的胚胎可能是一种更安全的方法。

3. 珠子接枝

1. 琼脂糖凝固后，在顶部沉积大约 0.5 μL 的磁珠。
   注:使用 10 μL 移液器吸头转移磁珠。无需精确测量 0.5 μL，因为微珠在悬浮液中高度浓缩。只需在离心后将吸头插入样品瓶中，就足以收集足够数量的珠子。
2. 在琼脂糖和珠子上加入一滴含有 0.02% 三卡因的 Danieau's 培养基。
3. 选择合适的拉延筋。
   注意:此步骤至关重要。微珠的大小可能略有不同，直径从 30 μm 到 60 μm 不等，因此必须根据样品和心大小通过肉眼选择合适的微珠。
4. 选择合适的珠子后，用镊子将其放在蛋黄顶部（图 2A 和 视频 1）。
5. 使用镊子的一只臂在蛋黄中心创建一个蛋黄病变或"孔"（图 2B 和 视频 2）。
   注意:病变的深度不应太深地渗透到蛋黄中;它应该与主静脉大致齐平。创建的孔的直径将与镊子臂的尖端相对应。确保病变在蛋黄中形成，并瞄准主静脉下方以避免接触主静脉。打孔时通常会流出少量蛋黄。
6. 将珠子放入步骤 3.5 中创建的病变中，然后轻轻向前推动，直到到达静脉极。在那里，心脏收缩将产生吸力，将珠子吸入心脏腔（图 2 和 视频 2）。
   注:微珠插入过程中静脉壁被破坏，卵黄的高密度有助于减少大面积出血。卵黄病变通常在微珠插入后几分钟内愈合。一些胚胎可能在珠子移植后 20-24 小时表现出心包水肿。

4. 斑马鱼胚胎的卸载

1. 将磁珠嫁接到所有封固的胚胎中后，在玻璃底培养皿中加入 1-2 mL 含有 PTU 的 Danieau's 培养基。
2. 使用镊子轻轻掰开 LMP 琼脂糖并小心地取出鱼，确保鱼上没有琼脂糖。
3. 使用巴斯德移液器，将胚胎转移到含有 PTU 的 Danieau 培养基的新培养皿中，并让它们在 28.5 °C 下恢复和发育。

结果

成功的珠子接枝示例如图 3、 视频 3 和 视频 4 所示。磁珠正确定位在斑马鱼心脏的心房内，允许血流畅通无阻，没有观察到出血。此外，心脏壁保持了其结构完整性而没有塌陷（图 3 和 视频 3）。24 小时后，胚胎没有显示心包水肿的迹象，进一步证实了移植手术的成功（视频 4

讨论

协议中的关键步骤和故障排除

斑马鱼胚胎的镶嵌

用于安装胚胎的琼脂糖的数量很重要。形成的圆顶不应过大，因为这会阻碍珠子从表面到胚胎的操作。相反，它不应该太小;琼脂糖上有多个珠子，靠近胚胎及其卵黄，可能会引起混淆。建议体积约为 350 μL，以充分覆盖胚胎，同时在胚胎上方留出几?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.