Mechanische Kräfte im sich entwickelnden Zebrafischherz mit Hilfe von Magnetkügelchen manipulieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur mikrochirurgischen Transplantation einer magnetischen Perle in das sich entwickelnde Zebrafischherz, das die Manipulation mechanischer Kräfte in vivo ermöglicht und einen mechanisch stimulusabhängigen Kalziumeinstrom in Endokardzellen auslöst.

Zusammenfassung

Mechanische Kräfte geben kontinuierlich Rückmeldung an morphogenetische Programme der Herzklappe. Beim Zebrafisch beruht die Entwicklung der Herzklappe auf der Herzkontraktion und den physikalischen Reizen, die vom schlagenden Herzen erzeugt werden. Die intrakardiale Hämodynamik, die durch den Blutfluss angetrieben wird, ist eine grundlegende Information, die die Entwicklung des embryonalen Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine effektive Methode, um mechanische Kräfte in vivo zu manipulieren, indem eine magnetische Kugel mit einem Durchmesser von 30 μm bis 60 μm in das Herzlumen transplantiert wird. Das Einbringen der Perle erfolgt mikrochirurgisch in anästhesierte Larven, ohne die Herzfunktion zu stören und ermöglicht eine künstliche Veränderung der Randbedingungen, wodurch die Strömungskräfte im System verändert werden. Infolgedessen verstärkt das Vorhandensein der Kugel die mechanischen Kräfte, denen die Endokardzellen ausgesetzt sind, und kann direkt einen mechanisch reizabhängigen Kalziumeinstrom auslösen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Mechanotransduktionswegen, die die Herzentwicklung steuern, und kann Einblicke in die Rolle mechanischer Kräfte bei der Morphogenese der Herzklappe geben.

Einleitung

Seit seiner Einführung in den späten 1970er Jahren¹ hat sich der Zebrafisch (Danio rerio) zu einem leistungsfähigen Modellsystem für die Untersuchung der Feinheiten der Herzentwicklung und angeborener Herzfehler entwickelt. Im Gegensatz zu den meisten Wirbeltieren, einschließlich Maus- und Kükenembryonen, die auf ein funktionierendes Herz-Kreislauf-System angewiesen sind und frühe Herzfehler nicht überleben können, bieten Zebrafische einen einzigartigen Vorteil, indem sie die Untersuchung schwerer Herzphänotypen ermöglichen. Dies ist auf ihre geringe Größe zurückzuführen, die durch passive Diffusion eine ausreichende Sauerstoffversorgung ermöglicht und ein Überleben auch ohne Herzkontraktion und aktive Durchblutung ermöglicht ^2,3,4. Zu den vielen wichtigen Merkmalen des Zebrafisches gehört auch die optische Transparenz seiner Embryonen, die eine nicht-invasive Überwachung des sich entwickelnden Herzens ermöglicht 5,6,7,8.

Mechanische Kräfte geben kontinuierlich Rückmeldung an die morphogenetischen Programme der Herzklappe 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 , und ein abweichender Blutfluss ist weithin als gemeinsamer Faktor bei verschiedenen Herz-Kreislauf-Erkrankungen anerkannt^23,24. Beim Zebrafisch beruht die Entwicklung der Herzklappe auf der Herzkontraktion und den mechanischen Kräften, die vom schlagenden Herzen erzeugt werden. Mehrere Zebrafisch-Mutanten haben die Bedeutung von herzerzeugten mechanischen Reizen für die Valvulogese gezeigt. Bemerkenswert ist, dass das völlige Fehlen einer Herzkontraktion und folglich eines Blutflusses aufgrund von Mutationen des kardialen Troponins T (tnnt2) in Mutanten des stillen Herzens (sih) in frühen morphogenetischen Stadien zum Fehlen von Gewebekonvergenz und endokardialer Zell-Clusterbildung (EdC) führt²⁵.

Die intrakardiale Hämodynamik und die mechanischen Kräfte, die durch den Blutfluss erzeugt werden, erweisen sich als grundlegende epigenetische Komponenten, die die Entwicklung des embryonalen Herzens des Zebrafisches prägen. Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass die richtige kardiale Morphogenese beim Zebrafisch ausgeprägte Strömungsreize erfordert, und Abweichungen von diesen physiologischen Mustern führen zu Herzklappenfehlern 10,13,14,22,26. Hier beschreiben wir eine effektive Methode, adaptiert von Fukui et ^al.13, um mechanische Kräfte in vivo zu manipulieren, indem eine magnetische Perle mit einem Durchmesser von 30 μm bis 60 μm in das sich entwickelnde schlagende Herz des Zebrafisches transplantiert wird. Bei der Technik wird mikrochirurgisch eine Perle in das Herzlumen von anästhesierten Larven eingeführt, ohne die Herzfunktion zu beeinträchtigen. Das Vorhandensein der Kügelchen führt zu einer Verstärkung der mechanischen Kräfte, die EdCs erfahren, und löst direkt einen mechanisch reizabhängigen Kalziumeinstrom aus¹³. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Mechanotransduktionswegen, die die Morphogenese des Herzens regulieren, und bietet die Möglichkeit, unser Verständnis der Rolle mechanischer Kräfte bei der Klappenbildung zu vertiefen.

Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren für die Arbeit mit Zebrafischembryonen entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63/EU und den Richtlinien des Innenministeriums im Rahmen der Projektlizenz PP6020928.

1. Gewinnung von Zebrafischembryonen für die Perlentransplantation

1. Überqueren Sie die entsprechende Zebrafischlinie und züchten Sie die Embryonen in Danieaus Medium bei 28,5 °C. Nähere Hinweise zum Überqueren von Zebrafischlinien finden Sie in der JoVE Science Education Database²⁷.
2. Behandeln Sie die Embryonen ab 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU), um die Pigmentbildung zu hemmen, mit einer Konzentration von 0,003 % PTU in Danieaus Medium.
3. Wenn Sie eine fluoreszenzmarkierte Linie verwenden, untersuchen Sie die Embryonen unter einem Fluoreszenzstereoskop, bevor Sie mit der Perltransplantation beginnen, und wählen Sie 10-20 gesunde Embryonen aus, die eine helle Fluoreszenz aufweisen. Dechorionieren Sie die vorselektierten Embryonen vorsichtig unter dem Stereomikroskop mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht beschädigt werden.

2. Einbettung von Zebrafischembryonen

1. Bereiten Sie 20 ml Danieau-Medium mit 0,02 % Tricain vor.
2. Bereiten Sie 2 ml-Aliquots von 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) mit 0,02 % Tricain in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Legen Sie die Rohre in einen 38 °C heißen Block, um die LMP-Agarose in einem flüssigen Zustand zu halten.
   HINWEIS: Die 1% LMP Agarose kann im Voraus für die Verwendung am Tag der Montage und Raupentransplantation vorbereitet werden.
3. Übertragen Sie 3-6 dechorionierte Embryonen in eine Petrischale, die Danieau-Medium enthält, das mit 0,02 % Tricain ergänzt ist.
4. Wenn die Embryonen betäubt sind, übertragen Sie sie in eine 35 mm x 15 mm große Glasbodenschale mit minimalem Medium. Fügen Sie schnell 300-400 μl 1 % LMP Agarose, die Tricain enthält, hinzu, um eine Kuppel zu erzeugen. Positionieren Sie die Embryonen mit einer Pinzette so, dass sie gerade liegen, in Kontakt mit dem Glas, mit der Bauchseite nach oben, wie in Abbildung 1 gezeigt. Warten Sie ~4 Minuten, bis sich die Agarose verfestigt hat.
   HINWEIS: Die Menge an Agarose, die für die Aufzucht von Embryonen verwendet wird, ist sehr wichtig. Streben Sie eine Kuppel von etwa 350 μl an, die eine ausreichende Abdeckung bieten und gleichzeitig einige Millimeter Platz über den Embryonen lassen sollte. Für Anfänger kann es sicherer sein, eine kleinere Anzahl von Embryonen auf einmal zu montieren.

3. Bead-Transplantation

1. Sobald die Agarose verfestigt ist, lagern Sie etwa 0,5 μl magnetische Kügelchen darauf ab.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine 10-μl-Pipettenspitze, um die magnetischen Kügelchen zu übertragen. Eine genaue Messung von 0,5 μl ist nicht erforderlich, da die Kügelchen in der Suspension hoch konzentriert sind. Es reicht aus, die Spitze nach dem Herunterdrehen einfach in das Fläschchen einzuführen, um eine ausreichende Menge an Kügelchen zu sammeln.
2. Geben Sie einen Tropfen Danieau's Medium mit 0,02 % Tricain auf die Agarose und die Kügelchen.
3. Wählen Sie die entsprechende Sicke aus.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig. Die Größe der Kügelchen kann leicht variieren und reicht von 30 μm bis 60 μm Durchmesser, daher ist die Auswahl der geeigneten Perle mit dem Auge, basierend auf der Probe und der Herzgröße, unerlässlich.
4. Sobald die geeignete Perle ausgewählt ist, legen Sie sie mit einer Pinzette auf das Eigelb (Abbildung 2A und Video 1).
5. Erzeugen Sie mit einem Arm der Pinzette eine Dotterläsion oder ein "Loch" in der Mitte des Dotters (Abbildung 2B und Video 2).
   HINWEIS: Die Tiefe der Läsion sollte nicht zu tief in das Eigelb eindringen; Sie sollte sich in etwa auf Höhe der Kardinalvene befinden. Der Durchmesser des erzeugten Lochs entspricht der Spitze des Pinzettenarms. Stellen Sie sicher, dass die Läsion im Eigelb gebildet wird, und vermeiden Sie den Kontakt mit den Kardinalvenen, indem Sie unter sie zielen. Eine kleine Menge Eigelb tritt normalerweise aus, wenn das Loch entsteht.
6. Setzen Sie die Perle in die in Schritt 3.5 entstandene Läsion ein und schieben Sie sie vorsichtig nach vorne, bis sie den Venenpol erreicht. Dort erzeugen die Herzkontraktionen einen Sog, der die Perle in das Herzlumen zieht (Abbildung 2 und Video 2).
   HINWEIS: Die Venenwand wird während des Einführens der Perle durchbrochen, und die hohe Dichte des Eigelbs hilft, ausgedehnte Blutungen zu minimieren. Die Dotterläsion heilt in der Regel innerhalb weniger Minuten nach dem Einsetzen der Beads ab. Einige Embryonen können 20-24 Stunden nach der Perlentransplantation ein Perikardödem aufweisen.

4. Entnahme von Zebrafischembryonen

1. Nachdem Sie magnetische Kügelchen in alle montierten Embryonen transplantiert haben, geben Sie 1-2 ml Danieau's Medium, das PTU enthält, in die Glasbodenschale.
2. Brechen Sie die LMP-Agarose vorsichtig mit einer Pinzette und entfernen Sie den Fisch vorsichtig, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Agarose auf ihm zurückbleibt.
3. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette in eine neue Petrischale, die Danieaus Medium mit PTU enthält, und lassen Sie sie sich bei 28,5 °C erholen und entwickeln.

Ergebnisse

Beispiele für eine erfolgreiche Bead-Transplantation sind in Abbildung 3, Video 3 und Video 4 dargestellt. Die magnetische Perle war korrekt im Vorhof des Zebrafischherzens positioniert, was einen ungehinderten Blutfluss und keine beobachtete Blutung ermöglichte. Darüber hinaus behielten die Herzwände ihre strukturelle Integrität bei, ohne einzustürzen (Abbildung 3 und Video 3

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll und Fehlerbehebung

Einbettung von Zebrafischembryonen

Die Menge an Agarose, die für die Montage der Embryonen verwendet wird, ist wichtig. Die gebildete Kuppel sollte nicht zu groß sein, da dies die Manipulation der Perle von der Oberfläche zu den Embryonen behindern kann. Umgekehrt sollte es nicht zu klein sein; Mehrere Kügelchen auf der Agarose, die nah...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.