Mechanische Kräfte im sich entwickelnden Zebrafischherz mit Hilfe von Magnetkügelchen manipulieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur mikrochirurgischen Transplantation einer magnetischen Perle in das sich entwickelnde Zebrafischherz, das die Manipulation mechanischer Kräfte in vivo ermöglicht und einen mechanisch stimulusabhängigen Kalziumeinstrom in Endokardzellen auslöst.

Zusammenfassung

Mechanische Kräfte geben kontinuierlich Rückmeldung an morphogenetische Programme der Herzklappe. Beim Zebrafisch beruht die Entwicklung der Herzklappe auf der Herzkontraktion und den physikalischen Reizen, die vom schlagenden Herzen erzeugt werden. Die intrakardiale Hämodynamik, die durch den Blutfluss angetrieben wird, ist eine grundlegende Information, die die Entwicklung des embryonalen Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine effektive Methode, um mechanische Kräfte in vivo zu manipulieren, indem eine magnetische Kugel mit einem Durchmesser von 30 μm bis 60 μm in das Herzlumen transplantiert wird. Das Einbringen der Perle erfolgt mikrochirurgisch in anästhesierte Larven, ohne die Herzfunktion zu stören und ermöglicht eine künstliche Veränderung der Randbedingungen, wodurch die Strömungskräfte im System verändert werden. Infolgedessen verstärkt das Vorhandensein der Kugel die mechanischen Kräfte, denen die Endokardzellen ausgesetzt sind, und kann direkt einen mechanisch reizabhängigen Kalziumeinstrom auslösen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Mechanotransduktionswegen, die die Herzentwicklung steuern, und kann Einblicke in die Rolle mechanischer Kräfte bei der Morphogenese der Herzklappe geben.

Einleitung

Seit seiner Einführung in den späten 1970er Jahren¹ hat sich der Zebrafisch (Danio rerio) zu einem leistungsfähigen Modellsystem für die Untersuchung der Feinheiten der Herzentwicklung und angeborener Herzfehler entwickelt. Im Gegensatz zu den meisten Wirbeltieren, einschließlich Maus- und Kükenembryonen, die auf ein funktionierendes Herz-Kreislauf-System angewiesen sind und frühe Herzfehler nicht überleben können, bieten Zebrafische einen einzigartigen Vorteil, indem sie die Untersuchung schwerer Herzphänotypen ermöglichen. Dies ist auf ihre geringe Größe zurückzuführen, die durch passive Diffusion ei....

Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren für die Arbeit mit Zebrafischembryonen entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63/EU und den Richtlinien des Innenministeriums im Rahmen der Projektlizenz PP6020928.

1. Gewinnung von Zebrafischembryonen für die Perlentransplantation

1. Überqueren Sie die entsprechende Zebrafischlinie und züchten Sie die Embryonen in Danieaus Medium bei 28,5 °C. Nähere Hinweise zum Überqueren von Zebrafischlinien finden Sie in der JoVE Science Education Database²⁷.
2. Behandeln Sie die Embryonen ab 24 Stunden nach der....

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll und Fehlerbehebung

Einbettung von Zebrafischembryonen

Die Menge an Agarose, die für die Montage der Embryonen verwendet wird, ist wichtig. Die gebildete Kuppel sollte nicht zu groß sein, da dies die Manipulation der Perle von der Oberfläche zu den Embryonen behindern kann. Umgekehrt sollte es nicht zu klein sein; Mehrere Kügelchen auf der Agarose, die nah.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.