Manipulation des forces mécaniques dans le cœur du poisson-zèbre en développement à l’aide de billes magnétiques

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour greffer une bille magnétique dans le cœur du poisson-zèbre en développement par microchirurgie, permettant la manipulation des forces mécaniques in vivo et déclenchant un afflux de calcium dépendant d’un stimulus mécanique dans les cellules endocardiques.

Résumé

Les forces mécaniques fournissent en permanence une rétroaction aux programmes morphogénétiques des valves cardiaques. Chez le poisson-zèbre, le développement des valves cardiaques dépend de la contraction cardiaque et des stimuli physiques générés par le cœur battant. L’hémodynamique intracardiaque, pilotée par le flux sanguin, apparaît comme une information fondamentale façonnant le développement du cœur embryonnaire. Ici, nous décrivons une méthode efficace pour manipuler les forces mécaniques in vivo en greffant une perle magnétique de 30 à 60 m de diamètre dans la lumière cardiaque. L’insertion de la bille est réalisée par microchirurgie chez des larves anesthésiées sans perturber la fonction cardiaque et permet une modification artificielle des conditions limites, modifiant ainsi les forces d’écoulement dans le système. Par conséquent, la présence de la bille amplifie les forces mécaniques subies par les cellules endocardiques et peut déclencher directement un afflux de calcium dépendant d’un stimulus mécanique. Cette approche facilite l’étude des voies de mécanotransduction qui régissent le développement cardiaque et peut fournir des informations sur le rôle des forces mécaniques dans la morphogenèse des valves cardiaques.

Introduction

Depuis son introduction à la^{fin des années} 19701, le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un puissant système modèle pour étudier les subtilités du développement cardiaque et des cardiopathies congénitales. Contrairement à la plupart des vertébrés, y compris les embryons de souris et de poussins, qui dépendent d’un système cardiovasculaire fonctionnel et ne peuvent pas survivre à des malformations cardiaques précoces, le poisson-zèbre offre un avantage unique en permettant l’étude de phénotypes cardiaques graves. Cela est dû à leur petite taille, qui facilite un apport suffisant en oxygène par diffus....

Protocole

Les procédures de travail avec les embryons de poisson-zèbre décrites dans ce protocole sont conformes à la directive européenne 2010/63/UE et aux directives du ministère de l’Intérieur dans le cadre de la licence de projet PP6020928.

1. Obtention d’embryons de poisson-zèbre pour la greffe de perles

1. Franchissez la ligne de poisson-zèbre appropriée et faites pousser les embryons dans le milieu de Danieau à 28,5 °C. Pour des instructions plus détaillées sur le croisement des lignes de poisson-zèbre, reportez-vous à la base de données JoVE Science Education²⁷....

Discussion

Étapes critiques du protocole et dépannage

Montage d’embryons de poisson-zèbre

La quantité d’agarose utilisée pour monter les embryons est importante. Le dôme formé ne doit pas être excessivement grand, car cela peut entraver la manipulation de la perle de la surface vers les embryons. À l’inverse, il ne doit pas être trop petit ; Le fait d’avoir plusieurs billes au sommet.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.