Manipulation des forces mécaniques dans le cœur du poisson-zèbre en développement à l’aide de billes magnétiques

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour greffer une bille magnétique dans le cœur du poisson-zèbre en développement par microchirurgie, permettant la manipulation des forces mécaniques in vivo et déclenchant un afflux de calcium dépendant d’un stimulus mécanique dans les cellules endocardiques.

Résumé

Les forces mécaniques fournissent en permanence une rétroaction aux programmes morphogénétiques des valves cardiaques. Chez le poisson-zèbre, le développement des valves cardiaques dépend de la contraction cardiaque et des stimuli physiques générés par le cœur battant. L’hémodynamique intracardiaque, pilotée par le flux sanguin, apparaît comme une information fondamentale façonnant le développement du cœur embryonnaire. Ici, nous décrivons une méthode efficace pour manipuler les forces mécaniques in vivo en greffant une perle magnétique de 30 à 60 m de diamètre dans la lumière cardiaque. L’insertion de la bille est réalisée par microchirurgie chez des larves anesthésiées sans perturber la fonction cardiaque et permet une modification artificielle des conditions limites, modifiant ainsi les forces d’écoulement dans le système. Par conséquent, la présence de la bille amplifie les forces mécaniques subies par les cellules endocardiques et peut déclencher directement un afflux de calcium dépendant d’un stimulus mécanique. Cette approche facilite l’étude des voies de mécanotransduction qui régissent le développement cardiaque et peut fournir des informations sur le rôle des forces mécaniques dans la morphogenèse des valves cardiaques.

Introduction

Depuis son introduction à la^{fin des années} 19701, le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un puissant système modèle pour étudier les subtilités du développement cardiaque et des cardiopathies congénitales. Contrairement à la plupart des vertébrés, y compris les embryons de souris et de poussins, qui dépendent d’un système cardiovasculaire fonctionnel et ne peuvent pas survivre à des malformations cardiaques précoces, le poisson-zèbre offre un avantage unique en permettant l’étude de phénotypes cardiaques graves. Cela est dû à leur petite taille, qui facilite un apport suffisant en oxygène par diffusion passive, permettant la survie même en l’absence de contraction cardiaque et de circulation sanguine active ^2,3,4. De plus, parmi les nombreuses caractéristiques significatives du poisson-zèbre, il y a la transparence optique de leurs embryons, qui permet une surveillance non invasive du cœur en développement 5,6,7,8.

Les forces mécaniques fournissent en permanence une rétroaction aux programmes morphogénétiques des valves cardiaques 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 , et le flux sanguin aberrant est largement reconnu comme un facteur partagé dans divers troubles cardiovasculaires^23,24. Chez le poisson-zèbre, le développement des valves cardiaques repose sur la contraction du cœur et les forces mécaniques générées par le cœur battant. De nombreux mutants de poisson-zèbre ont démontré l’importance des stimuli mécaniques générés par le cœur dans la valvulogenèse. Remarquablement, l’absence totale de contraction cardiaque et, par conséquent, de flux sanguin due à des mutations de la troponine cardiaque T (tnnt2) chez les mutants du cœur silencieux (sih) entraîne l’absence de convergence tissulaire et de regroupement des cellules endocardiques (EdC) au cours des stades morphogénétiques précoces²⁵.

L’hémodynamique intracardiaque et les forces mécaniques générées par le flux sanguin apparaissent comme des composants épigénétiques fondamentaux façonnant le développement du cœur embryonnaire du poisson-zèbre. De nombreuses études suggèrent que la morphogenèse cardiaque correcte chez le poisson-zèbre nécessite des stimuli de flux distincts, et que les écarts par rapport à ces modèles physiologiques entraînent des anomalies des valves cardiaques 10,13,14,22,26. Ici, nous décrivons une méthode efficace, adaptée de Fukui et ^al.13, pour manipuler les forces mécaniques in vivo en greffant une perle magnétique de 30 à 60 m de diamètre dans le cœur battant du poisson-zèbre en développement. La technique consiste à insérer microchirurgicalement une bille dans la lumière cardiaque de larves anesthésiées sans perturber la fonction cardiaque. La présence de la bille conduit à l’amplification des forces mécaniques subies par les EdC, déclenchant directement l’afflux de calcium¹³ dépendant du stimulus mécanique. Cette approche permet d’étudier les voies de mécanotransduction qui régulent la morphogenèse cardiaque et offre un moyen d’approfondir notre compréhension du rôle des forces mécaniques dans la formation des valves.

Protocole

Les procédures de travail avec les embryons de poisson-zèbre décrites dans ce protocole sont conformes à la directive européenne 2010/63/UE et aux directives du ministère de l’Intérieur dans le cadre de la licence de projet PP6020928.

1. Obtention d’embryons de poisson-zèbre pour la greffe de perles

1. Franchissez la ligne de poisson-zèbre appropriée et faites pousser les embryons dans le milieu de Danieau à 28,5 °C. Pour des instructions plus détaillées sur le croisement des lignes de poisson-zèbre, reportez-vous à la base de données JoVE Science Education²⁷.
2. Traitez les embryons avec de la 1-phényl-2-thiourée (PTU) à partir de 24 heures après la fécondation (hpf) pour inhiber la formation de pigments, en utilisant une concentration de 0,003 % de PTU dans le milieu de Danieau.
3. Si vous utilisez une raie marquée par fluorescence, examinez les embryons sous un stéréoscope de fluorescence avant de commencer la greffe de perles, et sélectionnez 10 à 20 embryons sains qui présentent une fluorescence brillante. Déchorionnez doucement les embryons présélectionnés sous le stéréomicroscope à l’aide d’une pince, en veillant à ce que les embryons ne soient pas endommagés.

2. Montage des embryons de poisson-zèbre

1. Préparez 20 ml de milieu Danieau’s contenant 0,02 % de tricaïne.
2. Préparez 2 mL d’aliquotes d’agarose à bas point de fusion (LMP) à 1 % contenant 0,02 % de tricaïne dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL. Placez les tubes dans un bloc chauffant à 38 °C pour maintenir l’agarose LMP à l’état liquide.
   REMARQUE : L’agarose LMP à 1% peut être préparé à l’avance pour une utilisation le jour du montage et de la greffe de billes.
3. Transférez 3 à 6 embryons déchorionnés dans une boîte de Pétri contenant le milieu de Danieau complété par 0,02% de tricaïne.
4. Lorsque les embryons sont anesthésiés, transférez-les dans une boîte à fond de verre de 35 mm x 15 mm avec un minimum de milieu. Ajouter rapidement 300 à 400 μL d’agarose LMP à 1 % contenant de la tricaïne pour créer un dôme. À l’aide d’une pince, positionnez les embryons de manière à ce qu’ils soient droits, en contact avec le verre, la face ventrale vers le haut, comme le montre la figure 1. Attendez ~4 min pour que l’agarose se solidifie.
   REMARQUE : La quantité d’agarose utilisée pour le montage des embryons est très importante. Visez un dôme d’environ 350 μL, qui devrait offrir une couverture suffisante tout en laissant quelques millimètres d’espace au-dessus des embryons. Pour les débutants, le montage d’un plus petit nombre d’embryons à la fois peut être une approche plus sûre.

3. Greffe de billes

1. Une fois l’agarose solidifiée, déposez environ 0,5 μL de billes magnétiques sur le dessus.
   REMARQUE : Utilisez une pointe de pipette de 10 μL pour transférer les billes magnétiques. Une mesure précise de 0,5 μL n’est pas nécessaire, car les billes sont fortement concentrées dans la suspension. Il suffit d’insérer l’embout dans le flacon après l’avoir essoré pour recueillir une quantité adéquate de billes.
2. Ajoutez une goutte de médium Danieau’s contenant 0,02 % de tricaïne sur l’agarose et les billes.
3. Sélectionnez le talon approprié.
   REMARQUE : Cette étape est critique. La taille des perles peut varier légèrement, allant de 30 μm à 60 μm de diamètre, il est donc essentiel de sélectionner la perle appropriée à l’œil, en fonction de l’échantillon et de la taille du cœur.
4. Une fois la perle appropriée sélectionnée, utilisez une pince à épiler pour la placer sur le jaune (Figure 2A et Vidéo 1).
5. Créez une lésion ou un « trou » au centre du jaune à l’aide d’un bras de la pince à épiler (figure 2B et vidéo 2).
   REMARQUE : La profondeur de la lésion ne doit pas pénétrer trop profondément dans le jaune ; Il doit être à peu près au niveau de la veine cardinale. Le diamètre du trou créé correspondra à la pointe du bras de la pince à épiler. Assurez-vous que la lésion est faite dans le jaune et évitez de contacter les veines cardinales en visant en dessous d’elles. Une petite quantité de jaune sortira généralement lorsque le trou est créé.
6. Placez la perle dans la lésion créée à l’étape 3.5 et poussez-la doucement vers l’avant jusqu’à ce qu’elle atteigne le pôle veineux. Là, les contractions cardiaques créeront une aspiration, attirant la bille dans la lumière cardiaque (Figure 2 et Vidéo 2).
   REMARQUE : La paroi veineuse est percée lors de l’insertion du talon et la haute densité du jaune aide à minimiser les saignements importants. La lésion du vitellus guérit généralement en quelques minutes après l’insertion de la bille. Certains embryons peuvent présenter un œdème péricardique 20 à 24 heures après la greffe de billes.

4. Démontage des embryons de poisson-zèbre

1. Après avoir greffé des billes magnétiques dans tous les embryons montés, ajoutez 1 à 2 ml de milieu Danieau contenant du PTU dans la boîte à fond de verre.
2. À l’aide d’une pince à épiler, cassez doucement l’agarose LMP et retirez soigneusement le poisson, en veillant à ce qu’il n’y ait pas d’agarose sur eux.
3. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du milieu de Danieau avec du PTU et laissez-les récupérer et se développer à 28,5 °C.

Résultats

Des exemples de greffes de billes réussies sont présentés dans la figure 3, la vidéo 3 et la vidéo 4. La perle magnétique a été correctement positionnée dans l’oreillette du cœur du poisson zèbre, ce qui a permis une circulation sanguine sans obstruction et aucune hémorragie observée. De plus, les parois du cœur ont conservé leur intégrité structurelle sans s’effondrer (Figure 3

Discussion

Étapes critiques du protocole et dépannage

Montage d’embryons de poisson-zèbre

La quantité d’agarose utilisée pour monter les embryons est importante. Le dôme formé ne doit pas être excessivement grand, car cela peut entraver la manipulation de la perle de la surface vers les embryons. À l’inverse, il ne doit pas être trop petit ; Le fait d’avoir plusieurs billes au sommet...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.