Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этом протоколе описывается метод прививки магнитной бусины в развивающееся сердце рыбки данио с помощью микрохирургии, что позволяет манипулировать механическими силами in vivo и запускать зависимый от механических стимулов приток кальция в клетки эндокарда.
Механические силы непрерывно обеспечивают обратную связь с морфогенетическими программами сердечных клапанов. У рыбок данио развитие сердечных клапанов зависит от сокращения сердца и физических стимулов, генерируемых бьющимся сердцем. Внутрисердечная гемодинамика, управляемая кровотоком, является фундаментальной информацией, формирующей развитие сердца эмбриона. В данной статье мы описываем эффективный метод манипулирования механическими силами in vivo путем прививки магнитной бусины диаметром от 30 до 60 мкм в просвет сердца. Введение шарика осуществляется с помощью микрохирургии в личинках, находящихся под наркозом, без нарушения функции сердца и позволяет искусственно изменять граничные условия, тем самым изменяя силы потока в системе. В результате, присутствие шарика усиливает механические силы, испытываемые клетками эндокарда, и может напрямую вызвать приток кальция, зависящий от механического стимула. Этот подход облегчает исследование путей механотрансдукции, которые управляют развитием сердца, и может дать представление о роли механических сил в морфогенезе сердечных клапанов.
С момента своего появления в конце 1970-хгодов1 данио рерио (Danio rerio) превратилась в мощную модельную систему для изучения тонкостей развития сердца и врожденных пороков сердца. В отличие от большинства позвоночных, включая эмбрионы мышей и цыплят, которые полагаются на функциональную сердечно-сосудистую систему и не могут выжить при ранних пороках сердца, рыбки данио обеспечивают уникальное преимущество, позволяя исследовать тяжелые фенотипы сердца. Это связано с их небольшими размерами, что способствует достаточному снабжению кислородом за счет пассивной диффузии, позволяя выживать даже при отсут....
Процедуры работы с эмбрионами рыбок данио, описанные в настоящем протоколе, соответствуют Европейской директиве 2010/63/ЕС и руководящим принципам МВД Великобритании в соответствии с PP6020928 лицензии на проект.
1. Получение эмбрионов данио-рерио для прививки бусинами
Примеры успешной прививки бусин показаны на рисунках 3, видео 3 и видео 4. Магнитная бусина была правильно расположена в предсердии сердца рыбки данио, что позволило обеспечить беспрепятственный кровоток и не наблюдалось кровоизлиян?.......
Критические шаги в протоколе и устранение неполадок
Посадка эмбрионов рыбок данио рерио
Количество агарозы, используемой для выращивания эмбрионов, имеет важное значение. Сформированный купол не должен быть чрез.......
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Мы благодарим сотрудников лаборатории Vermot за обсуждения и комментарии по протоколу. Мы благодарны всем сотрудникам рыбного хозяйства Имперского колледжа Лондона. Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020: GA N°682939, Additional Ventures (номер 1019496), MRC (MR/X019837/1) и BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P была поддержана стипендией факультета биоинженерии (Имперский колледж Лондона). HF был поддержан JSPS KAKENHI (23H04726 и 24K02207), программой JST FOREST (23719210), Мемориальным фондом Уэхара, Фондом исследований клет....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection | |||
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
Heat block | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
Jewelers forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy |
Microcentrifuge tubes 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
Pasteur pipette | |||
Petri dish | |||
Stereomicroscope | |||
Reagents | |||
4 mg/mL tricaine stock solution | |||
Danieau's medium (60x stock solution) | |||
PureCube Glutathione MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
Danieau's medium (60x stock solution) | |||
34.8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
1.6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
5.8 g CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
9.78 g MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave. | |||
4 mg/mL tricaine stock solution | |||
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
97.9 mL double-distilled H2O | |||
2.1 mL 1 M Tris (pH 9) | |||
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
ISSN 2578-2746
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены
Мы используем файлы cookie для улучшения качества работы на нашем веб-сайте.
Продолжая пользоваться нашим веб-сайтом или нажимая кнопку «Продолжить», вы соглашаетесь принять наши файлы cookie.