Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Резюме

В этом протоколе описывается метод прививки магнитной бусины в развивающееся сердце рыбки данио с помощью микрохирургии, что позволяет манипулировать механическими силами in vivo и запускать зависимый от механических стимулов приток кальция в клетки эндокарда.

Аннотация

Механические силы непрерывно обеспечивают обратную связь с морфогенетическими программами сердечных клапанов. У рыбок данио развитие сердечных клапанов зависит от сокращения сердца и физических стимулов, генерируемых бьющимся сердцем. Внутрисердечная гемодинамика, управляемая кровотоком, является фундаментальной информацией, формирующей развитие сердца эмбриона. В данной статье мы описываем эффективный метод манипулирования механическими силами in vivo путем прививки магнитной бусины диаметром от 30 до 60 мкм в просвет сердца. Введение шарика осуществляется с помощью микрохирургии в личинках, находящихся под наркозом, без нарушения функции сердца и позволяет искусственно изменять граничные условия, тем самым изменяя силы потока в системе. В результате, присутствие шарика усиливает механические силы, испытываемые клетками эндокарда, и может напрямую вызвать приток кальция, зависящий от механического стимула. Этот подход облегчает исследование путей механотрансдукции, которые управляют развитием сердца, и может дать представление о роли механических сил в морфогенезе сердечных клапанов.

Введение

С момента своего появления в конце 1970-хгодов1 данио рерио (Danio rerio) превратилась в мощную модельную систему для изучения тонкостей развития сердца и врожденных пороков сердца. В отличие от большинства позвоночных, включая эмбрионы мышей и цыплят, которые полагаются на функциональную сердечно-сосудистую систему и не могут выжить при ранних пороках сердца, рыбки данио обеспечивают уникальное преимущество, позволяя исследовать тяжелые фенотипы сердца. Это связано с их небольшими размерами, что способствует достаточному снабжению кислородом за счет пассивной диффузии, позволяя выживать даже при отсут....

протокол

Процедуры работы с эмбрионами рыбок данио, описанные в настоящем протоколе, соответствуют Европейской директиве 2010/63/ЕС и руководящим принципам МВД Великобритании в соответствии с PP6020928 лицензии на проект.

1. Получение эмбрионов данио-рерио для прививки бусинами

  1. Пересеките соответствующую линию рыбок данио и выращивайте эмбрионы в среде Danieau при температуре 28,5 °C. Для получения более подробных инструкций по пересечению линий данио-рерио обратитесь к базе данных научного образования JoVE27.
  2. Обрабатывайте эмбрионы 1-фенил-2-тиомочевиной....

Результаты

Примеры успешной прививки бусин показаны на рисунках 3, видео 3 и видео 4. Магнитная бусина была правильно расположена в предсердии сердца рыбки данио, что позволило обеспечить беспрепятственный кровоток и не наблюдалось кровоизлиян?.......

Обсуждение

Критические шаги в протоколе и устранение неполадок

Посадка эмбрионов рыбок данио рерио

Количество агарозы, используемой для выращивания эмбрионов, имеет важное значение. Сформированный купол не должен быть чрез.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Vermot за обсуждения и комментарии по протоколу. Мы благодарны всем сотрудникам рыбного хозяйства Имперского колледжа Лондона. Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020: GA N°682939, Additional Ventures (номер 1019496), MRC (MR/X019837/1) и BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P была поддержана стипендией факультета биоинженерии (Имперский колледж Лондона). HF был поддержан JSPS KAKENHI (23H04726 и 24K02207), программой JST FOREST (23719210), Мемориальным фондом Уэхара, Фондом исследований клет....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)VWR International734-2905
Heat blockEppendorfEP5382000031Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forcepsSigma-AldrichF6521-1EADumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mLEppendorf30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeadsCube Biotech32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)Sigma-AldrichP7629
UltraPure low melting point agaroseInvitrogen16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaClSigma-AldrichS3014
1.6 g KClSigma-AldrichP9541
5.8 g CaCl2·2H2OSigma-AldrichC3306
9.78 g MgCl2·6H2O Sigma-Aldrich442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)Sigma-AldrichA5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.

Ссылки

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish ....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

Мы используем файлы cookie для улучшения качества работы на нашем веб-сайте.

Продолжая пользоваться нашим веб-сайтом или нажимая кнопку «Продолжить», вы соглашаетесь принять наши файлы cookie.

Подробнее