Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описывается метод прививки магнитной бусины в развивающееся сердце рыбки данио с помощью микрохирургии, что позволяет манипулировать механическими силами in vivo и запускать зависимый от механических стимулов приток кальция в клетки эндокарда.

Аннотация

Механические силы непрерывно обеспечивают обратную связь с морфогенетическими программами сердечных клапанов. У рыбок данио развитие сердечных клапанов зависит от сокращения сердца и физических стимулов, генерируемых бьющимся сердцем. Внутрисердечная гемодинамика, управляемая кровотоком, является фундаментальной информацией, формирующей развитие сердца эмбриона. В данной статье мы описываем эффективный метод манипулирования механическими силами in vivo путем прививки магнитной бусины диаметром от 30 до 60 мкм в просвет сердца. Введение шарика осуществляется с помощью микрохирургии в личинках, находящихся под наркозом, без нарушения функции сердца и позволяет искусственно изменять граничные условия, тем самым изменяя силы потока в системе. В результате, присутствие шарика усиливает механические силы, испытываемые клетками эндокарда, и может напрямую вызвать приток кальция, зависящий от механического стимула. Этот подход облегчает исследование путей механотрансдукции, которые управляют развитием сердца, и может дать представление о роли механических сил в морфогенезе сердечных клапанов.

Введение

С момента своего появления в конце 1970-хгодов1 данио рерио (Danio rerio) превратилась в мощную модельную систему для изучения тонкостей развития сердца и врожденных пороков сердца. В отличие от большинства позвоночных, включая эмбрионы мышей и цыплят, которые полагаются на функциональную сердечно-сосудистую систему и не могут выжить при ранних пороках сердца, рыбки данио обеспечивают уникальное преимущество, позволяя исследовать тяжелые фенотипы сердца. Это связано с их небольшими размерами, что способствует достаточному снабжению кислородом за счет пассивной диффузии, позволяя выживать даже при отсут....

протокол

Процедуры работы с эмбрионами рыбок данио, описанные в настоящем протоколе, соответствуют Европейской директиве 2010/63/ЕС и руководящим принципам МВД Великобритании в соответствии с PP6020928 лицензии на проект.

1. Получение эмбрионов данио-рерио для прививки бусинами

  1. Пересеките соответствующую линию рыбок данио и выращивайте эмбрионы в среде Danieau при температуре 28,5 °C. Для получения более подробных инструкций по пересечению линий данио-рерио обратитесь к базе данных научного образования JoVE27.
  2. Обрабатывайте эмбрионы 1-фенил-2-тиомочевиной....

Результаты

Примеры успешной прививки бусин показаны на рисунках 3, видео 3 и видео 4. Магнитная бусина была правильно расположена в предсердии сердца рыбки данио, что позволило обеспечить беспрепятственный кровоток и не наблюдалось кровоизлиян?.......

Обсуждение

Критические шаги в протоколе и устранение неполадок

Посадка эмбрионов рыбок данио рерио

Количество агарозы, используемой для выращивания эмбрионов, имеет важное значение. Сформированный купол не должен быть чрез.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Vermot за обсуждения и комментарии по протоколу. Мы благодарны всем сотрудникам рыбного хозяйства Имперского колледжа Лондона. Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020: GA N°682939, Additional Ventures (номер 1019496), MRC (MR/X019837/1) и BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P была поддержана стипендией факультета биоинженерии (Имперский колледж Лондона). HF был поддержан JSPS KAKENHI (23H04726 и 24K02207), программой JST FOREST (23719210), Мемориальным фондом Уэхара, Фондом исследований клет....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)VWR International734-2905
Heat blockEppendorfEP5382000031Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forcepsSigma-AldrichF6521-1EADumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mLEppendorf30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeadsCube Biotech32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)Sigma-AldrichP7629
UltraPure low melting point agaroseInvitrogen16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaClSigma-AldrichS3014
1.6 g KClSigma-AldrichP9541
5.8 g CaCl2·2H2OSigma-AldrichC3306
9.78 g MgCl2·6H2O Sigma-Aldrich442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)Sigma-AldrichA5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.

Ссылки

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish ....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены