JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описывается метод прививки магнитной бусины в развивающееся сердце рыбки данио с помощью микрохирургии, что позволяет манипулировать механическими силами in vivo и запускать зависимый от механических стимулов приток кальция в клетки эндокарда.

Аннотация

Механические силы непрерывно обеспечивают обратную связь с морфогенетическими программами сердечных клапанов. У рыбок данио развитие сердечных клапанов зависит от сокращения сердца и физических стимулов, генерируемых бьющимся сердцем. Внутрисердечная гемодинамика, управляемая кровотоком, является фундаментальной информацией, формирующей развитие сердца эмбриона. В данной статье мы описываем эффективный метод манипулирования механическими силами in vivo путем прививки магнитной бусины диаметром от 30 до 60 мкм в просвет сердца. Введение шарика осуществляется с помощью микрохирургии в личинках, находящихся под наркозом, без нарушения функции сердца и позволяет искусственно изменять граничные условия, тем самым изменяя силы потока в системе. В результате, присутствие шарика усиливает механические силы, испытываемые клетками эндокарда, и может напрямую вызвать приток кальция, зависящий от механического стимула. Этот подход облегчает исследование путей механотрансдукции, которые управляют развитием сердца, и может дать представление о роли механических сил в морфогенезе сердечных клапанов.

Введение

С момента своего появления в конце 1970-хгодов1 данио рерио (Danio rerio) превратилась в мощную модельную систему для изучения тонкостей развития сердца и врожденных пороков сердца. В отличие от большинства позвоночных, включая эмбрионы мышей и цыплят, которые полагаются на функциональную сердечно-сосудистую систему и не могут выжить при ранних пороках сердца, рыбки данио обеспечивают уникальное преимущество, позволяя исследовать тяжелые фенотипы сердца. Это связано с их небольшими размерами, что способствует достаточному снабжению кислородом за счет пассивной диффузии, позволяя выживать даже при отсутствии сердечного сокращения и активного кровообращения 2,3,4. Кроме того, среди многих существенных особенностей рыбок данио рерио является оптическая прозрачность их эмбрионов, что позволяет проводить неинвазивный мониторинг развивающегося сердца 5,6,7,8.

Механические силы непрерывно обеспечивают обратную связь с морфогенетическими программами сердечных клапанов 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 , а аберрантный кровоток широко признан общим фактором при различных сердечно-сосудистых заболеваниях23,24. У рыбок данио развитие сердечных клапанов зависит от сокращения сердца и механических сил, создаваемых бьющимся сердцем. Множественные мутанты рыбок данио продемонстрировали значение механических стимулов, генерируемых сердцем, в вальвулогенезе. Примечательно, что полное отсутствие сердечного сокращения и, следовательно, кровотока из-за мутаций сердечного тропонина Т (tnnt2) у мутантов молчаливого сердца (SIH) приводит к отсутствию конвергенции тканей и кластеризации эндокардиальных клеток (EdC) на ранних морфогенетических стадиях25.

Внутрисердечная гемодинамика и механические силы, создаваемые кровотоком, являются фундаментальными эпигенетическими компонентами, формирующими развитие сердца эмбриона данио-рерио. Многочисленные исследования показывают, что правильный сердечный морфогенез у рыбок данио требует различных стимулов потока, и отклонения от этих физиологических закономерностей приводят к порокам сердечных клапанов 10,13,14,22,26. Здесь мы описываем эффективный метод, заимствованный из Fukui et al.13, для манипулирования механическими силами in vivo путем прививки магнитной бусины диаметром от 30 до 60 мкм в развивающееся бьющееся сердце рыбки данио. Техника включает в себя микрохирургическое введение шарика в просвет сердца личинок, находящихся под наркозом, без нарушения функции сердца. Присутствие шарика приводит к усилению механических сил, испытываемых EdC, непосредственно вызывая механический стимул-зависимый приток кальция13. Этот подход позволяет исследовать пути механотрансдукции, которые регулируют морфогенез сердца, и предлагает средства для углубления нашего понимания роли механических сил в формировании клапанов.

протокол

Процедуры работы с эмбрионами рыбок данио, описанные в настоящем протоколе, соответствуют Европейской директиве 2010/63/ЕС и руководящим принципам МВД Великобритании в соответствии с PP6020928 лицензии на проект.

1. Получение эмбрионов данио-рерио для прививки бусинами

  1. Пересеките соответствующую линию рыбок данио и выращивайте эмбрионы в среде Danieau при температуре 28,5 °C. Для получения более подробных инструкций по пересечению линий данио-рерио обратитесь к базе данных научного образования JoVE27.
  2. Обрабатывайте эмбрионы 1-фенил-2-тиомочевиной (PTU) через 24 ч после оплодотворения (HPF) для ингибирования образования пигмента, используя концентрацию 0,003% PTU в среде Danieau.
  3. Если вы используете флуоресцентно меченую линию, исследуйте эмбрионы под флуоресцентным стереоскопом перед началом прививки бусин и выберите 10-20 здоровых эмбрионов, которые демонстрируют яркую флуоресценцию. Аккуратно дехорионизируйте предварительно отобранные эмбрионы под стереомикроскопом с помощью щипцов, следя за тем, чтобы эмбрионы не были повреждены.

2. Сборка эмбрионов рыбок данио

  1. Приготовьте 20 мл среды Данио, содержащей 0,02% трикаина.
  2. Приготовьте 2 мл аликвот 1% агарозы с низкой температурой плавления (LMP), содержащей 0,02% трикаина, в микроцентрифужных пробирках объемом 2 мл. Поместите трубки в нагревательный блок при температуре 38 °C, чтобы сохранить агарозу LMP в жидком состоянии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агарозу 1% LMP можно заранее подготовить для использования в день монтажа и прививки бусины.
  3. Перенесите 3-6 дехорионированных эмбрионов в чашку Петри, содержащую среду Данио с добавлением 0,02% трикаина.
  4. Когда эмбрионы будут обезболены, перенесите их в чашку со стеклянным дном размером 35 мм x 15 мм с минимальным количеством среды. Быстро добавьте 300-400 мкл 1% LMP агарозы, содержащей трикаин, чтобы создать купол. С помощью щипцов расположите эмбрионы так, чтобы они лежали прямо, в контакте со стеклом, вентральной стороной вверх, как показано на рисунке 1. Подождите ~4 минуты, пока агароза застынет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество агарозы, используемой для посадки эмбрионов, очень важно. Стремитесь к куполу объемом около 350 μл, который должен обеспечивать достаточное покрытие, оставляя при этом несколько миллиметров пространства над эмбрионами. Для новичков более безопасным подходом может быть установка меньшего количества эмбрионов за один раз.

3. Прививка бусинами

  1. Как только агароза застынет, нанесите сверху примерно 0,5 мкл магнитных шариков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечник для дозатора объемом 10 мкл для переноса магнитных шариков. Точное измерение 0,5 мкл не требуется, так как гранулы высоко концентрируются в суспензии. Простого вставки наконечника в флакон после отжима будет достаточно, чтобы собрать достаточное количество бусин.
  2. Добавьте каплю медиума Дано, содержащую 0,02% трикаина, поверх агарозы и бусин.
  3. Выберите подходящую бусину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение. Размер бусин может незначительно варьироваться, от 30 мкм до 60 мкм в диаметре, поэтому выбор подходящей бусины на глаз, исходя из образца и размера сердца, имеет важное значение.
  4. После того, как подходящая бусина выбрана, поместите ее с помощью пинцета поверх желтка (Рисунок 2А и Видео 1).
  5. Создайте желтковое поражение или «отверстие» в центре желтка с помощью одного рычага пинцета (рисунок 2B и видео 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина поражения не должна проникать слишком глубоко в желток; Она должна быть примерно на одном уровне с кардинальной жилой. Диаметр создаваемого отверстия будет соответствовать кончику рычага пинцета. Убедитесь, что поражение сделано в желтке, и избегайте контакта с кардинальными венами, целясь ниже них. Небольшое количество желтка обычно выходит при создании отверстия.
  6. Поместите бусину в очаг поражения, созданный на шаге 3.5, и осторожно надавите на него спереди, пока он не достигнет венозного полюса. Там сердечные сокращения будут создавать всасывание, втягивая шарик в просвет сердца (Рисунок 2 и Видео 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Венозная стенка разрушается во время введения бусины, а высокая плотность желтка помогает свести к минимуму обширное кровотечение. Поражение желтком обычно заживает в течение нескольких минут после введения бусины. У некоторых эмбрионов может наблюдаться отек перикарда через 20-24 ч после пересадки бусин.

4. Снятие с демонтажа эмбрионов рыбок данио

  1. После прививки магнитных бусин во все установленные эмбрионы добавьте 1-2 мл среды Дано, содержащей ПТУ, в чашку со стеклянным дном.
  2. С помощью пинцета аккуратно разломите ЛМП агарозу и аккуратно удалите рыбок, следя за тем, чтобы на них не осталось агарозы.
  3. С помощью пастеровской пипетки перенесите эмбрионы в новую чашку Петри, содержащую среду Данио с ПТУ, и дайте им восстановиться и развиваться при температуре 28,5 °C.

Результаты

Примеры успешной прививки бусин показаны на рисунках 3, видео 3 и видео 4. Магнитная бусина была правильно расположена в предсердии сердца рыбки данио, что позволило обеспечить беспрепятственный кровоток и не наблюдалось кровоизлиян?...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе и устранение неполадок

Посадка эмбрионов рыбок данио рерио

Количество агарозы, используемой для выращивания эмбрионов, имеет важное значение. Сформированный купол не должен быть чрез...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Vermot за обсуждения и комментарии по протоколу. Мы благодарны всем сотрудникам рыбного хозяйства Имперского колледжа Лондона. Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020: GA N°682939, Additional Ventures (номер 1019496), MRC (MR/X019837/1) и BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P была поддержана стипендией факультета биоинженерии (Имперский колледж Лондона). HF был поддержан JSPS KAKENHI (23H04726 и 24K02207), программой JST FOREST (23719210), Мемориальным фондом Уэхара, Фондом исследований клеточных наук, Фондом медицинских исследований Такеда и Исследовательским фондом Novartis.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)VWR International734-2905
Heat blockEppendorfEP5382000031Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forcepsSigma-AldrichF6521-1EADumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mLEppendorf30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeadsCube Biotech32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)Sigma-AldrichP7629
UltraPure low melting point agaroseInvitrogen16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaClSigma-AldrichS3014
1.6 g KClSigma-AldrichP9541
5.8 g CaCl2·2H2OSigma-AldrichC3306
9.78 g MgCl2·6H2O Sigma-Aldrich442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)Sigma-AldrichA5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.

Ссылки

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84 (1), 4-16 (2012).
  3. Stainier, D. Y. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2 (1), 39-48 (2001).
  4. Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 13 (2016).
  5. Hoo, J. Y., Kumari, Y., Shaikh, M. F., Hue, S. M., Goh, B. H. Zebrafish: A versatile animal model for fertility research. Biomed Res Int. 2016 (2016), 9732780 (2016).
  6. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  7. Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (1), R3-R9 (2002).
  8. Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
  9. Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J. Mechanically activated piezo channels modulate outflow tract valve development through the Yap1 and Klf2-Notch signaling axis. Elife. 8, e44706 (2019).
  10. Vignes, H., et al. Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev Cell. 57 (5), 598-609.e595 (2022).
  11. Steed, E., et al. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
  12. Chow, R. W., et al. Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol. 20 (1), e3001505 (2022).
  13. Fukui, H., et al. Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science. 374 (6565), 351-354 (2021).
  14. Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Vermot, J. Mechanical control of tissue shape: Cell-extrinsic and -intrinsic mechanisms join forces to regulate morphogenesis. Semin Cell Dev Biol. 130, 45-55 (2022).
  15. Juan, T., et al. Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat Commun. 14 (1), 214 (2023).
  16. Juan, T., et al. Control of cardiac contractions using Cre-lox and degron strategies in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (3), e2309842121 (2024).
  17. Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J., Chow, R. Mechanotransduction in cardiovascular morphogenesis and tissue engineering. Curr Opin Genet Dev. 57, 106-116 (2019).
  18. Kalogirou, S., et al. Intracardiac flow dynamics regulate atrioventricular valve morphogenesis. Cardiovasc Res. 104 (1), 49-60 (2014).
  19. da Silva, A. R., et al. egr3 is a mechanosensitive transcription factor gene required for cardiac valve morphogenesis. Sci Adv. 10 (20), eadl0633 (2024).
  20. Bartman, T., et al. Early myocardial function affects endocardial cushion development in zebrafish. PLoS Biol. 2 (5), E129 (2004).
  21. Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1760-1766 (2016).
  22. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), e1000246 (2009).
  23. Bäck, M., Gasser, T. C., Michel, J. B., Caligiuri, G. Biomechanical factors in the biology of aortic wall and aortic valve diseases. Cardiovasc Res. 99 (2), 232-241 (2013).
  24. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 53-62 (2009).
  25. Boselli, F., Steed, E., Freund, J. B., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. 144 (23), 4322-4327 (2017).
  26. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  27. JoVE Science Education database. Biology II: Mouse, zebrafish, and chick. Zebrafish breeding and embryo handling. JoVE. , (2023).
  28. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены