자성 구슬을 사용하여 발달 중인 제브라피시 심장의 기계적 힘 조작

요약

이 프로토콜은 미세 수술을 통해 발달 중인 제브라피시 심장에 자기 구슬을 이식하는 방법을 설명하여 생체 내에서 기계적 힘을 조작하고 심내막 세포에서 기계적 자극 의존성 칼슘 유입을 트리거할 수 있습니다.

초록

기계적 힘은 심장 판막 형태 형성 프로그램에 지속적으로 피드백을 제공합니다. 제브라피시에서 심장 판막의 발달은 심장 수축과 박동하는 심장에 의해 생성되는 물리적 자극에 의존합니다. 혈류에 의해 구동되는 심장 내 혈류역학은 배아 심장의 발달을 형성하는 기본 정보로 부상하고 있습니다. 여기에서는 심장 내강에 30μm에서 60μm 직경의 자기 비드를 이식하여 생체 내에서 기계적 힘을 조작하는 효과적인 방법을 설명합니다. 비드의 삽입은 심장 기능을 방해하지 않고 마취된 유충에서 미세 수술을 통해 수행되며 경계 조건의 인위적인 변경을 가능하게 하여 시스템의 유동력을 수정할 수 있습니다. 결과적으로, 비드의 존재는 심내막 세포가 경험하는 기계적 힘을 증폭시키고 기계적 자극 의존성 칼슘 유입을 직접 유발할 수 있습니다. 이 접근법은 심장 발달을 관장하는 기계적 전달 경로의 연구를 용이하게 하고 심장 판막 형태 형성에서 기계적 힘의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서문

1970^{년대 후반에} 소개된 이래1 제브라피시(Danio rerio)는 심장 발달과 선천성 심장 질환의 복잡성을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다. 기능적인 심혈관계에 의존하고 초기 심장 결함을 견디지 못하는 생쥐 및 병아리 배아를 포함한 대부분의 척추동물과 달리 제브라피쉬는 심각한 심장 표현형을 조사할 수 있는 고유한 이점을 제공합니다. 이것은 수동적 확산을 통해 충분한 산소 공급을 촉진하여 심장 수축 및 적극적인 혈액 순환이 없는 경우에도 생존을 가능하게 하는 작은 크기 때문입니다 ^2,3,4. 또한, 제브라피쉬의 많은 중요한 특징 중 하나는 배아의 광학적 투명성으로, 발달 중인 심장 ^5,6,7,8을 비침습적으로 모니터링할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 제브라피시 배아로 작업하는 절차는 프로젝트 라이선스 PP6020928에 따른 유럽 지침 2010/63/EU 및 내무부 지침을 준수합니다.

1. 구슬 이식을 위한 제브라피시 배아 확보

1. 관련 제브라피시 라인을 건너 28.5°C의 Danieau 배지에서 배아를 성장시킵니다. 제브라피시 라인을 건너는 방법에 대한 자세한 지침은 JoVE 과학 교육 데이터베이스²⁷을 참조하십시오.
2. Danieau의 배지에 0.003% PTU 농도를 사용하여 색소 형성을 억제하기 위해 수정 후 24시간(hpf)부터 배아를 1-phenyl-2-thiourea(PTU)로 처리합니다.
3. 형광 라벨링 라인을 사용하는 경우 비드 이식을 시작하기 전에 형광 입체경으로 배아를 검사하고 밝은 형광을 나타내는 10-20개의 건강한 배아를 선택합니다. 겸자를 사용하여 실체현미경 아래에서 미리 선택된 배아를 부드럽게 분리하여 배아가 손상되지 않도록 합니다.

2. 제브라피시 배아 장착

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토론

프로토콜 및 문제 해결의 중요한 단계

제브라피시 배아 장착

배아를 장착하는 데 사용되는 아가로스의 양은 중요합니다. 형성된 돔은 과도하게 커서는 안 되는데, 이는 표면에서 배아까지 비드의 조작을 방해할 수 있기 때문입니다. 반대로 너무 작아서는 안 됩니다. 아가로스 위에 여러 개의 구슬?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.