자성 구슬을 사용하여 발달 중인 제브라피시 심장의 기계적 힘 조작

요약

이 프로토콜은 미세 수술을 통해 발달 중인 제브라피시 심장에 자기 구슬을 이식하는 방법을 설명하여 생체 내에서 기계적 힘을 조작하고 심내막 세포에서 기계적 자극 의존성 칼슘 유입을 트리거할 수 있습니다.

초록

기계적 힘은 심장 판막 형태 형성 프로그램에 지속적으로 피드백을 제공합니다. 제브라피시에서 심장 판막의 발달은 심장 수축과 박동하는 심장에 의해 생성되는 물리적 자극에 의존합니다. 혈류에 의해 구동되는 심장 내 혈류역학은 배아 심장의 발달을 형성하는 기본 정보로 부상하고 있습니다. 여기에서는 심장 내강에 30μm에서 60μm 직경의 자기 비드를 이식하여 생체 내에서 기계적 힘을 조작하는 효과적인 방법을 설명합니다. 비드의 삽입은 심장 기능을 방해하지 않고 마취된 유충에서 미세 수술을 통해 수행되며 경계 조건의 인위적인 변경을 가능하게 하여 시스템의 유동력을 수정할 수 있습니다. 결과적으로, 비드의 존재는 심내막 세포가 경험하는 기계적 힘을 증폭시키고 기계적 자극 의존성 칼슘 유입을 직접 유발할 수 있습니다. 이 접근법은 심장 발달을 관장하는 기계적 전달 경로의 연구를 용이하게 하고 심장 판막 형태 형성에서 기계적 힘의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서문

1970^{년대 후반에} 소개된 이래1 제브라피시(Danio rerio)는 심장 발달과 선천성 심장 질환의 복잡성을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다. 기능적인 심혈관계에 의존하고 초기 심장 결함을 견디지 못하는 생쥐 및 병아리 배아를 포함한 대부분의 척추동물과 달리 제브라피쉬는 심각한 심장 표현형을 조사할 수 있는 고유한 이점을 제공합니다. 이것은 수동적 확산을 통해 충분한 산소 공급을 촉진하여 심장 수축 및 적극적인 혈액 순환이 없는 경우에도 생존을 가능하게 하는 작은 크기 때문입니다 ^2,3,4. 또한, 제브라피쉬의 많은 중요한 특징 중 하나는 배아의 광학적 투명성으로, 발달 중인 심장 ^5,6,7,8을 비침습적으로 모니터링할 수 있습니다.

기계적 힘은 심장 판막 형태 형성 프로그램 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22에 지속적으로 피드백을 제공합니다., 비정상적인 혈류는 다양한 심혈관 질환에서 공통 요인으로 널리 인정되고 있습니다^23,24. 제브라피시에서 심장 판막의 발달은 심장 수축과 박동하는 심장에 의해 생성되는 기계적 힘에 의존합니다. 여러 제브라피시 돌연변이가 판막 형성에서 심장 생성 기계적 자극의 중요성을 입증했습니다. 놀랍게도, 침묵의 심장(sih) 돌연변이에서 심장 트로포닌 T(tnnt2)의 돌연변이로 인한 심장 수축 및 결과적인 혈류의 완전한 부재는 초기 형태발생 단계에서 조직 수렴 및 심내막 세포(EdC) 클러스터링의 부재를 초래한다²⁵.

심장 내 혈류역학 및 혈류에 의해 생성되는 기계적 힘은 제브라피시 배아 심장의 발달을 형성하는 근본적인 후성유전학적 구성 요소로 부상합니다. 수많은 연구에 따르면 제브라피시에서 적절한 심장 형태 형성은 뚜렷한 흐름 자극을 필요로 하며, 이러한 생리적 패턴에서 벗어나면 심장 판막 결손이 발생한다 10,13,14,22,26. 여기에서는 Fukui et ^al.13에서 채택한 효과적인 방법을 설명하며, 발달 중인 제브라피시 박동 심장 내에 30μm에서 60μm 직경의 자기 구슬을 이식하여 생체 내에서 기계적 힘을 조작하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 심장 기능을 방해하지 않고 마취된 유충의 심장 내강에 구슬을 미세 수술로 삽입하는 것을 포함합니다. 비드의 존재는 EdC에 의해 경험되는 기계적 힘의 증폭으로 이어져 기계적 자극 의존적 칼슘 유입을 직접 유발한다¹³. 이 접근법은 심장 형태 형성을 조절하는 기계전달 경로를 조사할 수 있게 하고 판막 형성에서 기계적 힘의 역할에 대한 이해를 심화할 수 있는 수단을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 제브라피시 배아로 작업하는 절차는 프로젝트 라이선스 PP6020928에 따른 유럽 지침 2010/63/EU 및 내무부 지침을 준수합니다.

1. 구슬 이식을 위한 제브라피시 배아 확보

1. 관련 제브라피시 라인을 건너 28.5°C의 Danieau 배지에서 배아를 성장시킵니다. 제브라피시 라인을 건너는 방법에 대한 자세한 지침은 JoVE 과학 교육 데이터베이스²⁷을 참조하십시오.
2. Danieau의 배지에 0.003% PTU 농도를 사용하여 색소 형성을 억제하기 위해 수정 후 24시간(hpf)부터 배아를 1-phenyl-2-thiourea(PTU)로 처리합니다.
3. 형광 라벨링 라인을 사용하는 경우 비드 이식을 시작하기 전에 형광 입체경으로 배아를 검사하고 밝은 형광을 나타내는 10-20개의 건강한 배아를 선택합니다. 겸자를 사용하여 실체현미경 아래에서 미리 선택된 배아를 부드럽게 분리하여 배아가 손상되지 않도록 합니다.

2. 제브라피시 배아 장착

1. 0.02% 트리카인이 함유된 Danieau의 배지 20mL를 준비합니다.
2. 2mL 미세 원심분리 튜브에 0.02% 트리카인을 함유한 1% 저융점(LMP) 아가로스 2mL 부분 표본을 준비합니다. 튜브를 38°C 열 블록에 넣어 LMP 아가로스를 액체 상태로 유지합니다.
   참고: 1% LMP 아가로스는 장착 및 비드 이식 당일에 사용할 수 있도록 미리 준비할 수 있습니다.
3. 3-6개의 탈코리온화된 배아를 0.02% 트리카인이 보충된 Danieau의 배지가 함유된 페트리 접시에 옮깁니다.
4. 배아가 마취되면 최소한의 매체로 35mm x 15mm 유리 바닥 접시에 옮깁니다. 트리카인이 함유된 300-400μL의 1% LMP 아가로스를 빠르게 추가하여 돔을 만듭니다. 겸자를 사용하여 그림 1과 같이 배아가 유리에 닿도록 똑바로 놓고 복부 쪽이 위를 향하도록 배치합니다. 아가로스가 응고될 때까지 ~4분 동안 기다립니다.
   참고: 배아를 장착하는 데 사용되는 아가로스의 양은 매우 중요합니다. 약 350μL의 돔을 목표로 하며, 이는 배아 위에 몇 mm의 공간을 남겨두면서 충분한 적용 범위를 제공해야 합니다. 초보자의 경우 한 번에 더 적은 수의 배아를 장착하는 것이 더 안전한 방법일 수 있습니다.

3. 비드 접목

1. 아가로스가 응고되면 약 0.5μL의 자성 비드를 위에 증착합니다.
   참고: 10 μL 피펫 팁을 사용하여 마그네틱 비드를 이송합니다. 0.5 μL의 정밀한 측정은 필요하지 않은데, 이는 비드가 현탁액에 고도로 집중되어 있기 때문입니다. 스핀 다운 후 팁을 바이알에 삽입하기만 하면 적절한 양의 비드를 수집하기에 충분합니다.
2. 아가로스와 비즈 위에 0.02% 트리케인이 함유된 Danieau의 배지 한 방울을 추가합니다.
3. 적절한 비드를 선택합니다.
   참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 비드의 크기는 직경이 30μm에서 60μm까지 약간 다를 수 있으므로 샘플과 심장 크기에 따라 눈으로 적절한 비드를 선택하는 것이 필수적입니다.
4. 적합한 비드를 선택했으면 핀셋을 사용하여 노른자 위에 놓습니다(그림 2A 및 비디오 1).
5. 핀셋의 한쪽 팔을 사용하여 난황 중앙에 난황 병변 또는 '구멍'을 만듭니다(그림 2B 및 비디오 2).
   참고: 병변의 깊이가 난황에 너무 깊게 침투해서는 안 됩니다. 기본 정맥과 대략 수평이어야 합니다. 생성된 구멍의 지름은 핀셋 암의 끝과 일치합니다. 병변이 난황에 만들어졌는지 확인하고 추기경 정맥 아래를 조준하여 추기경맥과 접촉하지 않도록 합니다. 일반적으로 구멍이 생성될 때 소량의 노른자가 나옵니다.
6. 3.5단계에서 생성된 병변에 비드를 놓고 정맥 극에 도달할 때까지 전방으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 거기에서 심장 수축이 흡입을 생성하여 비드를 심장 내강으로 끌어들입니다(그림 2 및 비디오 2).
   참고: 비드 삽입 시 정맥벽이 뚫리며 난황의 밀도가 높아 광범위한 출혈을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 난황 병변은 일반적으로 비드 삽입 후 몇 분 이내에 치유됩니다. 일부 배아는 비드 이식 후 20-24시간 후에 심낭 부종을 보일 수 있습니다.

4. 제브라피시 배아의 탈착

1. 장착된 모든 배아에 마그네틱 비드를 이식한 후 유리 바닥 접시에 PTU가 포함된 Danieau의 배지 1-2mL를 추가합니다.
2. 핀셋을 사용하여 LMP 아가로스를 부드럽게 부수고 물고기를 조심스럽게 제거하여 아가로스가 남지 않도록 합니다.
3. 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 PTU가 있는 Danieau의 배지가 포함된 새로운 페트리 접시에 옮기고 28.5°C에서 회복 및 발달하도록 합니다.

결과

성공적인 비드 그라프팅의 예는 그림 3, 비디오 3 및 비디오 4에 나와 있습니다. 마그네틱 비드는 제브라피시 심장의 심방 내에 올바르게 위치하여 혈류가 방해받지 않고 출혈이 관찰되지 않도록 했습니다. 또한 심장 벽은 붕괴되지 않고 구조적 무결성을 유지했습니다(그림 3 및 비디오 3). ...

토론

프로토콜 및 문제 해결의 중요한 단계

제브라피시 배아 장착

배아를 장착하는 데 사용되는 아가로스의 양은 중요합니다. 형성된 돔은 과도하게 커서는 안 되는데, 이는 표면에서 배아까지 비드의 조작을 방해할 수 있기 때문입니다. 반대로 너무 작아서는 안 됩니다. 아가로스 위에 여러 개의 구슬?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.