מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים

Summary

פרוטוקול זה מתווה שיטה להשתלת חרוז מגנטי בלב דג הזברה המתפתח באמצעות מיקרו-כירורגיה, המאפשר מניפולציה של כוחות מכניים in vivo והפעלת זרם סידן תלוי גירוי מכני בתאים אנדוקרדיאלים.

Abstract

כוחות מכניים מספקים משוב רציף לתוכניות מורפוגנטיות של מסתם הלב. בדגי זברה, התפתחות מסתם הלב מסתמכת על התכווצות הלב וגירויים פיזיים הנוצרים על ידי הלב הפועם. המודינמיקה תוך-לבבית, המונעת על ידי זרימת הדם, מתגלה כמידע בסיסי המעצב את התפתחות הלב העוברי. במאמר זה אנו מתארים שיטה יעילה לתמרן כוחות מכניים in vivo על ידי השתלת חרוז מגנטי בקוטר 30 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר בלומן הלב. החדרת החרוז מתבצעת באמצעות מיקרו-כירורגיה בזחלים מורדמים ללא הפרעה לתפקוד הלב ומאפשרת שינוי מלאכותי של תנאי הגבול ובכך לשנות את כוחות הזרימה במערכת. כתוצאה מכך, נוכחות החרוז מגבירה את הכוחות המכניים שחווים תאים אנדוקרדיאליים ויכולה להפעיל ישירות זרם סידן תלוי גירוי מכני. גישה זו מאפשרת לחקור מסלולי מכנוטרנסדוקציה השולטים בהתפתחות הלב ויכולה לספק תובנות לגבי תפקידם של כוחות מכניים במורפוגנזה של מסתם הלב.

Introduction

מאז הצגתו בסוף שנות השבעים¹, דג הזברה (Danio rerio) התגלה כמערכת מודל רבת עוצמה לחקר המורכבות של התפתחות הלב והפרעות לב מולדות. בניגוד לרוב בעלי החוליות, כולל עוברי עכברים ואפרוחים, המסתמכים על מערכת לב וכלי דם מתפקדת ואינם יכולים לשרוד מומי לב מוקדמים, דגי זברה מספקים יתרון ייחודי בכך שהם מאפשרים חקירה של פנוטיפים חמורים של הלב. זאת בשל גודלם הקטן, המאפשר אספקת חמצן מספקת באמצעות דיפוזיה פסיבית, המאפשרת הישרדות גם בהיעדר התכווצות לב ומחזור דם פעיל ^2,3,4. יתר על כן, בין התכונות המשמעותיות הרבות של דגי זברה היא....

Protocol

נהלי העבודה עם עוברי דגי זברה המתוארים בפרוטוקול זה תואמים את הדירקטיבה האירופית 2010/63/EU ואת הנחיות משרד הפנים תחת PP6020928 רישיון הפרויקט.

1. השגת עוברים של דגי זברה להשתלת חרוזים

1. חוצים את קו דגי הזברה הרלוונטיים ומגדלים את העוברים בתווך של דניאו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. לקבלת הוראות מפורטות יותר על חציית קווי דגי זברה, עיין במסד הנתונים לחינוך מדעי של JoVE²⁷.
2. טפל בעוברים עם 1-phenyl-2-thiourea (PTU) מ 24 שעות לאחר ההפריה (HPF) כדי לעכב היווצרות פיגמנט, באמצעות ריכוז של 0.003% PTU בתווך של Danieau.
3. אם אתם משתמשים בקו מסומן פ....

תוצאות

דוגמאות להשתלת חרוזים מוצלחת מוצגות באיור 3, וידאו 3 ווידאו 4. החרוז המגנטי מוקם כראוי בתוך האטריום של לב דג הזברה, ואיפשר זרימת דם ללא הפרעה וללא דימום שנצפה. נוסף על כך, קירות הלב שמרו על שלמותם המבנית מבלי להתמוטט (איור 3 .......

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול ובפתרון בעיות

הרכבה של עוברי דגי זברה

כמות האגרוז המשמשת להרכבת העוברים חשובה. הכיפה שנוצרה לא צריכה להיות גדולה מדי, שכן זה יכול לעכב את המניפולציה של החרוז מפני השטח אל העוברים. לעומת זאת, זה.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.