מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים

Summary

פרוטוקול זה מתווה שיטה להשתלת חרוז מגנטי בלב דג הזברה המתפתח באמצעות מיקרו-כירורגיה, המאפשר מניפולציה של כוחות מכניים in vivo והפעלת זרם סידן תלוי גירוי מכני בתאים אנדוקרדיאלים.

Abstract

כוחות מכניים מספקים משוב רציף לתוכניות מורפוגנטיות של מסתם הלב. בדגי זברה, התפתחות מסתם הלב מסתמכת על התכווצות הלב וגירויים פיזיים הנוצרים על ידי הלב הפועם. המודינמיקה תוך-לבבית, המונעת על ידי זרימת הדם, מתגלה כמידע בסיסי המעצב את התפתחות הלב העוברי. במאמר זה אנו מתארים שיטה יעילה לתמרן כוחות מכניים in vivo על ידי השתלת חרוז מגנטי בקוטר 30 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר בלומן הלב. החדרת החרוז מתבצעת באמצעות מיקרו-כירורגיה בזחלים מורדמים ללא הפרעה לתפקוד הלב ומאפשרת שינוי מלאכותי של תנאי הגבול ובכך לשנות את כוחות הזרימה במערכת. כתוצאה מכך, נוכחות החרוז מגבירה את הכוחות המכניים שחווים תאים אנדוקרדיאליים ויכולה להפעיל ישירות זרם סידן תלוי גירוי מכני. גישה זו מאפשרת לחקור מסלולי מכנוטרנסדוקציה השולטים בהתפתחות הלב ויכולה לספק תובנות לגבי תפקידם של כוחות מכניים במורפוגנזה של מסתם הלב.

Introduction

מאז הצגתו בסוף שנות השבעים¹, דג הזברה (Danio rerio) התגלה כמערכת מודל רבת עוצמה לחקר המורכבות של התפתחות הלב והפרעות לב מולדות. בניגוד לרוב בעלי החוליות, כולל עוברי עכברים ואפרוחים, המסתמכים על מערכת לב וכלי דם מתפקדת ואינם יכולים לשרוד מומי לב מוקדמים, דגי זברה מספקים יתרון ייחודי בכך שהם מאפשרים חקירה של פנוטיפים חמורים של הלב. זאת בשל גודלם הקטן, המאפשר אספקת חמצן מספקת באמצעות דיפוזיה פסיבית, המאפשרת הישרדות גם בהיעדר התכווצות לב ומחזור דם פעיל ^2,3,4. יתר על כן, בין התכונות המשמעותיות הרבות של דגי זברה היא השקיפות האופטית של עובריהם, המאפשרת ניטור לא פולשני של הלב המתפתח 5,6,7,8.

כוחות מכניים מספקים משוב רציף לתוכניות מורפוגנטיות של מסתם הלב 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 וזרימת דם חריגה מוכרת באופן נרחב כגורם משותף להפרעות לב וכלי דם שונות^23,24., בדגי זברה, התפתחות מסתם הלב מסתמכת על התכווצות הלב וכוחות מכניים הנוצרים על ידי הלב הפועם. מוטנטים רבים של דגי זברה הדגימו את חשיבותם של גירויים מכניים הנוצרים על ידי הלב בואלולוגנזה. למרבה הפלא, היעדר מוחלט של התכווצות הלב, וכתוצאה מכך, זרימת הדם עקב מוטציות של טרופונין T (tnnt2) בלב שקט (sih) מוטציות גורם להיעדר התכנסות רקמות וקיבוץ תאים אנדוקרדיאליים (EdC) במהלך השלבים המורפוגנטיים המוקדמים²⁵.

המודינמיקה תוך-לבבית וכוחות מכניים הנוצרים על ידי זרימת הדם מופיעים כמרכיבים אפיגנטיים בסיסיים המעצבים את התפתחות הלב העוברי של דג הזברה. מחקרים רבים מצביעים על כך שמורפוגנזה לבבית תקינה בדגי זברה דורשת גירויי זרימה ברורים, וסטיות מהדפוסים הפיזיולוגיים הללו מובילות למומים במסתמי הלב 10,13,14,22,26. במאמר זה אנו מתארים שיטה יעילה, שאומצה מ-Fukui et ^al.13, לתמרן כוחות מכניים in vivo על ידי השתלת חרוז מגנטי בקוטר 30 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר בתוך הלב הפועם של דג הזברה המתפתח. הטכניקה כוללת החדרה מיקרוכירורגית של חרוז לתוך לומן הלב של זחלים מורדמים מבלי להפריע לתפקוד הלב. נוכחותו של החרוז מובילה להגברת הכוחות המכניים שחווים EdCs, ומפעילה ישירות זרם סידן תלוי גירוי מכני¹³. גישה זו מאפשרת לחקור מסלולים מכנוטרנסדוקטיביים המווסתים מורפוגנזה של הלב ומציעה אמצעי להעמקת הבנתנו את תפקידם של כוחות מכניים ביצירת מסתמים.

Protocol

נהלי העבודה עם עוברי דגי זברה המתוארים בפרוטוקול זה תואמים את הדירקטיבה האירופית 2010/63/EU ואת הנחיות משרד הפנים תחת PP6020928 רישיון הפרויקט.

1. השגת עוברים של דגי זברה להשתלת חרוזים

1. חוצים את קו דגי הזברה הרלוונטיים ומגדלים את העוברים בתווך של דניאו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. לקבלת הוראות מפורטות יותר על חציית קווי דגי זברה, עיין במסד הנתונים לחינוך מדעי של JoVE²⁷.
2. טפל בעוברים עם 1-phenyl-2-thiourea (PTU) מ 24 שעות לאחר ההפריה (HPF) כדי לעכב היווצרות פיגמנט, באמצעות ריכוז של 0.003% PTU בתווך של Danieau.
3. אם אתם משתמשים בקו מסומן פלואורסצנטית, בדקו את העוברים תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי לפני תחילת השתלת החרוזים, ובחרו 10-20 עוברים בריאים המציגים פלואורסצנטיות בהירה. יש לנטרל בעדינות את העוברים שנבחרו מראש מתחת לסטריאומיקרוסקופ באמצעות מלקחיים, כדי להבטיח שהעוברים לא יינזקו.

2. הרכבה של עוברי דגי זברה

1. הכינו 20 מ"ל של מדיום Danieau המכיל 0.02% טריקאין.
2. הכינו 2 מ"ל aliquots של 1% נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose המכיל 0.02% tricaine ב 2 מ"ל צינורות microcentrifuge. הניחו את הצינורות בבלוק חום של 38 מעלות צלזיוס כדי לשמור על אגרוז LMP במצב נוזלי.
   הערה: ניתן להכין מראש את אגרוז LMP 1% לשימוש ביום ההרכבה וחריפת החרוזים.
3. העבירו 3-6 עוברים דכוריוניים לצלחת פטרי המכילה את המדיום של דניו בתוספת 0.02% טריקאין.
4. כאשר העוברים מורדמים, מעבירים אותם לצלחת זכוכית בגודל 35 מ"מ x 15 מ"מ עם תווך מינימלי. הוסף במהירות 300-400 μL של 1% LMP agarose המכיל טריקאין כדי ליצור כיפה. באמצעות מלקחיים, מקמו את העוברים כך שהם ישכבו ישרים, במגע עם הזכוכית, כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה, כפי שמוצג באיור 1. המתן ~ 4 דקות עד שהאגרוז יתמצק.
   הערה: כמות האגרוז המשמשת להרכבת עוברים חשובה מאוד. יש לכוון לכיפה של כ-350 מיקרוליטר, אשר אמורה לספק כיסוי מספיק תוך השארת מרווח של כמה מילימטרים מעל העוברים. למתחילים, הרכבת מספר קטן יותר של עוברים בכל פעם עשויה להיות גישה בטוחה יותר.

3. השתלת חרוזים

1. לאחר האגרוז הוא מוצק, להפקיד כ 0.5 μL של חרוזים מגנטיים על גבי.
   הערה: השתמש בקצה פיפטה של 10 μL כדי להעביר את החרוזים המגנטיים. מדידה מדויקת של 0.5 μL אינה הכרחית, שכן החרוזים מרוכזים מאוד בהשעיה. פשוט להכניס את הקצה לתוך הבקבוקון לאחר מסתובב יהיה מספיק כדי לאסוף כמות מספקת של חרוזים.
2. הוסיפו טיפה של המדיום של דניאו המכיל 0.02% טריקאין על גבי האגרוז והחרוזים.
3. בחר את החרוז המתאים.
   הערה: שלב זה הוא קריטי. גודל החרוזים יכול להשתנות מעט, החל מקוטר של 30 מיקרומטר ועד 60 מיקרומטר, ולכן בחירת החרוז המתאים לפי עין, בהתבסס על הדגימה וגודל הלב, היא חיונית.
4. לאחר בחירת החרוז המתאים, השתמשו בפינצטה כדי להניח אותו על גבי החלמון (איור 2A ווידאו 1).
5. צרו נגע חלמון או "חור" במרכז החלמון באמצעות זרוע אחת של הפינצטה (איור 2B ווידאו 2).
   הערה: עומק הנגע לא צריך לחדור עמוק מדי לתוך החלמון; זה צריך להיות בערך ברמה עם הווריד הקרדינלי. קוטר החור שנוצר יתאים לקצה זרוע הפינצטה. ודא שהנגע נעשה בחלמון והימנע ממגע עם הוורידים הקרדינליים על ידי כיוון מתחתם. כמות קטנה של חלמון בדרך כלל תצא כאשר החור נוצר.
6. הכניסו את החרוז לנגע שנוצר בשלב 3.5 ודחפו אותו בעדינות קדימה עד שהוא מגיע לקוטב הוורידי. שם, התכווצויות הלב ייצרו יניקה, וימשכו את החרוז לתוך לומן הלב (איור 2 ווידאו 2).
   הערה: דופן הווריד נפרצת במהלך החדרת החרוזים, והצפיפות הגבוהה של החלמון מסייעת למזער דימום נרחב. נגע החלמון נרפא בדרך כלל תוך מספר דקות לאחר החדרת החרוז. עוברים מסוימים עשויים להציג בצקת קרום הלב 20-24 שעות לאחר השתלת חרוזים.

4. פירוק עוברים של דגי זברה

1. לאחר השתלת חרוזים מגנטיים בכל העוברים המותקנים יש להוסיף 1-2 מ"ל של המדיום של דניאו המכיל PTU בצלחת תחתית הזכוכית.
2. באמצעות פינצטה, בעדינות לשבור את האגרוז LMP בזהירות להסיר את הדג, להבטיח כי לא נשאר agarose עליהם.
3. בעזרת פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים לצלחת פטרי חדשה המכילה את התווך של דניאו עם PTU ומאפשרים להם להתאושש ולהתפתח ב-28.5 מעלות צלזיוס.

תוצאות

דוגמאות להשתלת חרוזים מוצלחת מוצגות באיור 3, וידאו 3 ווידאו 4. החרוז המגנטי מוקם כראוי בתוך האטריום של לב דג הזברה, ואיפשר זרימת דם ללא הפרעה וללא דימום שנצפה. נוסף על כך, קירות הלב שמרו על שלמותם המבנית מבלי להתמוטט (איור 3 ...

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול ובפתרון בעיות

הרכבה של עוברי דגי זברה

כמות האגרוז המשמשת להרכבת העוברים חשובה. הכיפה שנוצרה לא צריכה להיות גדולה מדי, שכן זה יכול לעכב את המניפולציה של החרוז מפני השטח אל העוברים. לעומת זאת, זה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.