磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

要約

このプロトコールは、顕微手術を通じて発生中のゼブラフィッシュの心臓に磁気ビーズを移植する方法を概説し、 生体内で の機械的な力の操作を可能にし、心内膜細胞への機械的刺激依存的なカルシウム流入を誘発します。

要約

機械的な力は、心臓弁の形態形成プログラムにフィードバックを継続的に提供します。ゼブラフィッシュでは、心臓弁の発達は、心臓の収縮と心臓の鼓動によって生成される物理的刺激に依存しています。血流によって駆動される心臓内血行動態は、胚の心臓の発達を形作る基本的な情報として浮かび上がってきます。ここでは、直径30μmから60μmの磁気ビーズを心内腔にグラフトすることにより、 生体内で 機械的な力を操作する効果的な方法について述べます。ビーズの挿入は、心臓の機能を乱すことなく麻酔をかけた幼虫のマイクロサージェリーによって行われ、境界条件の人為的な変更を可能にし、それによってシステム内の流れの力を変更します。その結果、ビーズの存在は心内膜細胞が経験する機械的な力を増幅し、機械的刺激依存性のカルシウム流入を直接引き起こす可能性があります。このアプローチは、心臓の発達を支配する機械伝達経路の調査を容易にし、心臓弁の形態形成における機械的な力の役割についての洞察を提供することができます。

概要

1970^年代後半に導入されて以来、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、心臓の発達と先天性心疾患の複雑さを研究するための強力なモデルシステムとして浮上してきました。マウスやニワトリの胚を含むほとんどの脊椎動物は、機能的な心血管系に依存しており、初期の心臓の欠陥を乗り越えることができませんが、ゼブラフィッシュは、重度の心臓表現型の調査を可能にするという独自の利点を提供します。これは、そのサイズが小さいため、受動的な拡散によって十分な酸素供給が促進され、心臓の収縮や活発な血液循環がなくても生存できるためです^2,3,4。さらに、ゼブラフィッシュの多くの重要な特徴の中には、その胚の光学的透明性があり、これにより発達中の心臓5,6,7,8の非侵襲的なモニタリングが可能になります。

機械的な力は、心臓弁の形態形成プログラム9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22にフィードバックを連続的に提供します、そして異常な血流は、さまざまな心血管障害^23,24の共通の要因として広く認識されています。ゼブラフィッシュでは、心臓弁の発達は心臓の収縮と心臓の鼓動によって生成される機械的な力に依存しています。複数のゼブラフィッシュの変異体が、心臓が生成する機械的刺激が弁膜形成に重要であることを実証しています。驚くべきことに、無症状の心臓(sih)変異体における心臓の収縮と、その結果としての心筋トロポニンT(tnnt2)の突然変異による血流の完全な欠如は、初期の形態形成段階での組織収束と心内膜細胞(EdC)のクラスタリングの欠如をもたらす²⁵。

心臓内の血行動態と血流によって生成される機械的な力は、ゼブラフィッシュの胚心の発達を形作る基本的なエピジェネティックな要素として現れます。ゼブラフィッシュの適切な心臓形態形成には明確な流れ刺激が必要であり、これらの生理学的パターンからの逸脱が心臓弁の欠損につながることが多くの研究で示唆されています10,13,14,22,26。ここでは、Fukui et ^al.13から採用された、発達中のゼブラフィッシュの鼓動心臓内に直径30 μmから60 μmの磁気ビーズをグラフトすることにより、生体内で機械的な力を操作する効果的な方法について説明します。この技術では、麻酔をかけた幼虫の心臓内腔にビーズをマイクロサージェリー挿入し、心臓機能を乱すことなく挿入します。ビーズの存在は、EdCが経験する機械的な力の増幅につながり、機械的刺激依存性のカルシウム流入を直接引き起こす¹³。このアプローチにより、心臓の形態形成を制御する機械伝達経路の調査が可能になり、弁形成における機械的な力の役割についての理解を深める手段が提供されます。

プロトコル

この議定書に記載されているゼブラフィッシュの胚の取り扱い手順は、欧州指令2010/63/EUおよびプロジェクトライセンスPP6020928に基づく内務省のガイドラインに準拠しています。

1. ビーズグラフトのためのゼブラフィッシュ胚の入手

1. 関連するゼブラフィッシュの系統を渡り、28.5°CのDanieau培地で胚を成長させます。 ゼブラフィッシュのラインを渡る方法の詳細については、JoVE Science Education Database²⁷を参照してください。
2. 受精後24時間(hpf)から1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)で胚を処理し、ダニオー培地で0.003%PTUの濃度を使用して色素形成を阻害します。
3. 蛍光標識ラインを使用する場合は、ビーズグラフトを開始する前に蛍光ステレオスコープで胚を検査し、明るい蛍光を示す10〜20個の健康な胚を選択します。鉗子を使用して実体顕微鏡下で事前に選択した胚を穏やかにデコレーションし、胚が損傷しないようにします。

2. ゼブラフィッシュ胚のマウント

1. 0.02%トリカインを含むダニオー培地20mLを調製します。
2. 0.02%トリカインを含む1%低融点(LMP)アガロースの2 mLアリコートを2 mLの微量遠心チューブに調製します。チューブを38°Cのヒートブロックに入れ、LMPアガロースを液体状態に保ちます。
   注:1% LMPアガロースは、マウントおよびビーズグラフトの日に使用するために事前に準備することができます。
3. 3〜6個の脱角胚を、0.02%トリカインを添加したダニオー培地を含むシャーレに移します。
4. 胚に麻酔をかけたら、最小限の培地で35 mm x 15 mmのガラス底皿に移します。トリカインを含む1% LMPアガロースを300-400 μLすばやく添加してドームを作ります。鉗子を使用して、 図1に示すように、胚がガラスに接触し、腹側を上に向けてまっすぐに横たわるように胚を配置します。アガロースが固まるまで~4分待ちます。
   注:胚のマウントに使用されるアガロースの量は非常に重要です。約350μLのドームを目指し、胚の上に数ミリメートルのスペースを残しながら十分なカバレッジを提供する必要があります。初心者にとっては、一度にマウントする胚の数を減らす方が安全なアプローチかもしれません。

3.ビーズグラフト

1. アガロースが固まったら、その上に約0.5μLの磁気ビーズを堆積させます。
   注:10 μLのピペットチップを使用して、磁気ビーズを移します。0.5 μLの正確な測定は、ビーズが懸濁液中に高濃度で濃縮されているため、必要ありません。スピンダウン後にチップをバイアルに挿入するだけで、十分な量のビーズを収集できます。
2. 0.02%のトリカインを含むダニオー培地をアガロースとビーズの上に一滴加えます。
3. 適切なビードを選択します。
   注: この手順は重要です。ビーズのサイズは、直径が30μmから60μmまでわずかに異なるため、サンプルと心臓のサイズに基づいて、目で適切なビーズを選択することが不可欠です。
4. 適切なビーズを選択したら、ピンセットを使用して卵黄の上に置きます(図2A および ビデオ1)。
5. ピンセットの片方のアームを使用して、卵黄の病変または卵黄の中央に「穴」を作成します(図2B および ビデオ2)。
   注:病変の深さは卵黄に深く浸透しすぎてはいけません。それは枢機卿静脈とほぼ同じ高さでなければなりません。作成された穴の直径は、ピンセットアームの先端に対応します。病変が卵黄に作られていることを確認し、枢機卿の静脈の下を狙って枢機卿の静脈に接触しないようにします。穴が空くと、通常、少量の卵黄が出てきます。
6. ステップ3.5で作成した病変にビーズを配置し、静脈極に達するまでゆっくりと前方に押します。そこで、心臓の収縮が吸引を引き起こし、ビーズを心臓の内腔に引き込みます(図2 および ビデオ2)。
   注:ビーズの挿入中に静脈壁が破られ、卵黄の密度が高いため、広範な出血を最小限に抑えることができます。卵黄病変は通常、ビーズ挿入後数分以内に治癒します。一部の胚は、ビーズ移植の20〜24時間後に心膜浮腫を示すことがあります。

4. ゼブラフィッシュの胚のアンマウント

1. すべてのマウントされた胚に磁気ビーズを移植した後、PTUを含むDanieauの培地をガラス底皿に1〜2mL加えます。
2. ピンセットを使用して、LMPアガロースをそっと壊し、魚を慎重に取り除き、アガロースが残らないようにします。
3. パスツールピペットを使用して、PTUを含むダニオー培地を含む新しいシャーレに胚を移し、28.5°Cで回復および発育させます。

結果

成功したビーズグラフト作成の例を 、図3、 ビデオ3、 およびビデオ4に示します。磁気ビーズはゼブラフィッシュの心臓の心房内に正しく配置されていたため、血流が妨げられず、出血も観察されませんでした。さらに、心臓壁は崩壊することなく構造的完全性を維持しました(図3 および ?...

ディスカッション

プロトコルとトラブルシューティングの重要なステップ

ゼブラフィッシュ胚のマウント

胚をマウントするために使用されるアガロースの量は重要です。形成されるドームは、表面から胚へのビーズの操作を妨げる可能性があるため、過度に大きくしてはいけません。逆に、小さすぎてはいけ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.