Manipolazione delle forze meccaniche nel cuore del pesce zebra in via di sviluppo utilizzando perle magnetiche

Riepilogo

Questo protocollo delinea un metodo per innestare una perlina magnetica nel cuore di zebrafish in via di sviluppo attraverso la microchirurgia, consentendo la manipolazione delle forze meccaniche in vivo e innescando l'afflusso di calcio dipendente dallo stimolo meccanico nelle cellule endocardiche.

Abstract

Le forze meccaniche forniscono continuamente un feedback ai programmi morfogenetici delle valvole cardiache. Nel pesce zebra, lo sviluppo della valvola cardiaca si basa sulla contrazione del cuore e sugli stimoli fisici generati dal cuore pulsante. L'emodinamica intracardiaca, guidata dal flusso sanguigno, emerge come informazione fondamentale che modella lo sviluppo del cuore embrionale. Qui, descriviamo un metodo efficace per manipolare le forze meccaniche in vivo innestando una perlina magnetica di diametro compreso tra 30 μm e 60 μm nel lume cardiaco. L'inserimento della perlina viene condotto mediante microchirurgia in larve anestetizzate senza perturbare la funzione cardiaca e consente l'alterazione artificiale delle condizioni al contorno, modificando così le forze di flusso nel sistema. Di conseguenza, la presenza della perlina amplifica le forze meccaniche subite dalle cellule endocardiche e può innescare direttamente l'afflusso di calcio dipendente dallo stimolo meccanico. Questo approccio facilita lo studio delle vie di meccanotrasduzione che governano lo sviluppo del cuore e può fornire informazioni sul ruolo delle forze meccaniche nella morfogenesi delle valvole cardiache.

Introduzione

Dalla sua introduzione alla fine degli anni '70¹, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente sistema modello per studiare le complessità dello sviluppo cardiaco e dei disturbi cardiaci congeniti. A differenza della maggior parte dei vertebrati, compresi gli embrioni di topo e pulcino, che si basano su un sistema cardiovascolare funzionale e non possono sopravvivere ai difetti cardiaci precoci, il pesce zebra offre un vantaggio unico consentendo lo studio di fenotipi cardiaci gravi. Ciò è dovuto alle loro piccole dimensioni, che facilitano un sufficiente apporto di ossigeno attraverso la diff....

Protocollo

Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo aderiscono alla direttiva europea 2010/63/UE e alle linee guida del Ministero dell'Interno nell'ambito della licenza del progetto PP6020928.

1. Ottenere embrioni di pesce zebra per l'innesto di perline

1. Attraversa la linea del pesce zebra pertinente e fai crescere gli embrioni nel terreno di Danieau a 28,5 °C. Per istruzioni più dettagliate sull'attraversamento delle linee del pesce zebra, fare riferimento al database JoVE Science Education²⁷.
2. Trattare gli embrioni ....

Discussione

Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi

Montaggio di embrioni di zebrafish

La quantità di agarosio utilizzata per montare gli embrioni è importante. La cupola formata non deve essere eccessivamente grande, in quanto ciò può ostacolare la manipolazione della perlina dalla superficie agli embrioni. Al contrario, non dovrebbe essere troppo piccolo; Avere più perle sopra.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.