Manipolazione delle forze meccaniche nel cuore del pesce zebra in via di sviluppo utilizzando perle magnetiche

Riepilogo

Questo protocollo delinea un metodo per innestare una perlina magnetica nel cuore di zebrafish in via di sviluppo attraverso la microchirurgia, consentendo la manipolazione delle forze meccaniche in vivo e innescando l'afflusso di calcio dipendente dallo stimolo meccanico nelle cellule endocardiche.

Abstract

Le forze meccaniche forniscono continuamente un feedback ai programmi morfogenetici delle valvole cardiache. Nel pesce zebra, lo sviluppo della valvola cardiaca si basa sulla contrazione del cuore e sugli stimoli fisici generati dal cuore pulsante. L'emodinamica intracardiaca, guidata dal flusso sanguigno, emerge come informazione fondamentale che modella lo sviluppo del cuore embrionale. Qui, descriviamo un metodo efficace per manipolare le forze meccaniche in vivo innestando una perlina magnetica di diametro compreso tra 30 μm e 60 μm nel lume cardiaco. L'inserimento della perlina viene condotto mediante microchirurgia in larve anestetizzate senza perturbare la funzione cardiaca e consente l'alterazione artificiale delle condizioni al contorno, modificando così le forze di flusso nel sistema. Di conseguenza, la presenza della perlina amplifica le forze meccaniche subite dalle cellule endocardiche e può innescare direttamente l'afflusso di calcio dipendente dallo stimolo meccanico. Questo approccio facilita lo studio delle vie di meccanotrasduzione che governano lo sviluppo del cuore e può fornire informazioni sul ruolo delle forze meccaniche nella morfogenesi delle valvole cardiache.

Introduzione

Dalla sua introduzione alla fine degli anni '70¹, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente sistema modello per studiare le complessità dello sviluppo cardiaco e dei disturbi cardiaci congeniti. A differenza della maggior parte dei vertebrati, compresi gli embrioni di topo e pulcino, che si basano su un sistema cardiovascolare funzionale e non possono sopravvivere ai difetti cardiaci precoci, il pesce zebra offre un vantaggio unico consentendo lo studio di fenotipi cardiaci gravi. Ciò è dovuto alle loro piccole dimensioni, che facilitano un sufficiente apporto di ossigeno attraverso la diffusione passiva, consentendo la sopravvivenza anche in assenza di contrazione cardiaca e circolazione sanguigna attiva ^2,3,4. Inoltre, tra le molte caratteristiche significative del pesce zebra c'è la trasparenza ottica dei loro embrioni, che consente un monitoraggio non invasivo del cuore in via di sviluppo 5,6,7,8.

Le forze meccaniche forniscono continuamente un feedback ai programmi morfogenetici delle valvole cardiache 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 e il flusso sanguigno aberrante è ampiamente riconosciuto come un fattore condiviso in vari disturbi cardiovascolari^23,24. Nel pesce zebra, lo sviluppo della valvola cardiaca si basa sulla contrazione del cuore e sulle forze meccaniche generate dal cuore pulsante. Diversi mutanti di zebrafish hanno dimostrato l'importanza degli stimoli meccanici generati dal cuore nella valvulogenesi. Sorprendentemente, la completa assenza di contrazione cardiaca e, di conseguenza, di flusso sanguigno dovuta a mutazioni della troponina cardiaca T (tnnt2) nei mutanti del cuore silente (sih) determina l'assenza di convergenza tissutale e di raggruppamento delle cellule endocardiche (EdC) durante i primi stadi morfogenetici²⁵.

L'emodinamica intracardiaca e le forze meccaniche generate dal flusso sanguigno emergono come componenti epigenetiche fondamentali che modellano lo sviluppo del cuore embrionale del pesce zebra. Numerosi studi suggeriscono che una corretta morfogenesi cardiaca nel pesce zebra richiede stimoli di flusso distinti e deviazioni da questi modelli fisiologici portano a difetti delle valvole cardiache 10,13,14,22,26. Qui, descriviamo un metodo efficace, adattato da Fukui et ^al.13, per manipolare le forze meccaniche in vivo innestando una perlina magnetica di diametro compreso tra 30 μm e 60 μm all'interno del cuore pulsante del pesce zebra in via di sviluppo. La tecnica prevede l'inserimento microchirurgico di una perlina nel lume cardiaco di larve anestetizzate senza perturbare la funzione cardiaca. La presenza della perlina porta all'amplificazione delle forze meccaniche subite dalle EdC, innescando direttamente l'afflusso di calcio dipendente dallo stimolo meccanico¹³. Questo approccio consente lo studio delle vie di meccanotrasduzione che regolano la morfogenesi cardiaca e offre un mezzo per approfondire la nostra comprensione del ruolo delle forze meccaniche nella formazione delle valvole.

Protocollo

Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo aderiscono alla direttiva europea 2010/63/UE e alle linee guida del Ministero dell'Interno nell'ambito della licenza del progetto PP6020928.

1. Ottenere embrioni di pesce zebra per l'innesto di perline

1. Attraversa la linea del pesce zebra pertinente e fai crescere gli embrioni nel terreno di Danieau a 28,5 °C. Per istruzioni più dettagliate sull'attraversamento delle linee del pesce zebra, fare riferimento al database JoVE Science Education²⁷.
2. Trattare gli embrioni con 1-fenil-2-tiourea (PTU) da 24 ore dopo la fecondazione (hpf) per inibire la formazione di pigmenti, utilizzando una concentrazione dello 0,003% di PTU nel terreno di Danieau.
3. Se si utilizza una linea marcata in fluorescenza, esaminare gli embrioni sotto uno stereoscopio a fluorescenza prima di iniziare l'innesto di perline e selezionare 10-20 embrioni sani che mostrano una fluorescenza brillante. Decoionare delicatamente gli embrioni preselezionati allo stereomicroscopio utilizzando una pinza, assicurandosi che gli embrioni non vengano danneggiati.

2. Montaggio di embrioni di zebrafish

1. Preparare 20 ml di terreno di Danieleau contenente lo 0,02% di tricaina.
2. Preparare 2 mL di aliquote di agarosio all'1% a basso punto di fusione (LMP) contenente lo 0,02% di tricaina in provette da microcentrifuga da 2 mL. Posizionare le provette in un blocco termico a 38 °C per mantenere l'agarosio LMP allo stato liquido.
   NOTA: L'agarosio LMP all'1% può essere preparato in anticipo per l'uso il giorno del montaggio e dell'innesto del cordone.
3. Trasferire 3-6 embrioni dechorionati in una capsula di Petri contenente il terreno di Danieau integrato con lo 0,02% di tricaina.
4. Quando gli embrioni sono anestetizzati, trasferirli in una piastra con fondo di vetro di 35 mm x 15 mm con un mezzo minimo. Aggiungere rapidamente 300-400 μl di agarosio LMP all'1% contenente tricaina per creare una cupola. Usando una pinza, posiziona gli embrioni in modo che giacciono dritti, a contatto con il vetro, con il lato ventrale rivolto verso l'alto, come mostrato nella Figura 1. Attendere ~4 minuti affinché l'agarosio si solidifichi.
   NOTA: La quantità di agarosio utilizzata per il montaggio degli embrioni è molto importante. Punta a una cupola di circa 350 μl, che dovrebbe fornire una copertura sufficiente lasciando alcuni millimetri di spazio sopra gli embrioni. Per i principianti, montare un numero inferiore di embrioni alla volta può essere un approccio più sicuro.

3. Innesto a cordone

1. Una volta che l'agarosio si è solidificato, depositare sopra circa 0,5 μL di perle magnetiche.
   NOTA: Utilizzare un puntale per pipetta da 10 μl per trasferire le microsfere magnetiche. Non è necessaria una misurazione precisa di 0,5 μl, poiché le perle sono altamente concentrate nella sospensione. Il semplice inserimento del puntale nel flaconcino dopo la rotazione sarà sufficiente per raccogliere una quantità adeguata di perline.
2. Aggiungere una goccia di terreno di Danieau contenente lo 0,02% di tricaina sopra l'agarosio e le perline.
3. Selezionare il tallone appropriato.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale. La dimensione delle perle può variare leggermente, da 30 μm a 60 μm di diametro, quindi è essenziale selezionare la perlina appropriata a occhio, in base al campione e alle dimensioni del cuore.
4. Una volta selezionata la perlina adatta, utilizzare una pinzetta per posizionarla sopra il tuorlo (Figura 2A e Video 1).
5. Crea una lesione o "buco" del tuorlo al centro del tuorlo usando un braccio della pinzetta (Figura 2B e Video 2).
   NOTA: La profondità della lesione non deve penetrare troppo in profondità nel tuorlo; Dovrebbe essere approssimativamente a livello della vena cardinale. Il diametro del foro creato corrisponderà alla punta del braccio della pinzetta. Assicurarsi che la lesione sia praticata nel tuorlo ed evitare di entrare in contatto con le vene cardinali puntando al di sotto di esse. Una piccola quantità di tuorlo fuoriesce in genere quando viene creato il buco.
6. Posizionare la perlina nella lesione creata al punto 3.5 e spingerla delicatamente anteriormente fino a raggiungere il polo venoso. Lì, le contrazioni cardiache creeranno l'aspirazione, attirando la perlina nel lume cardiaco (Figura 2 e Video 2).
   NOTA: La parete venosa viene violata durante l'inserimento del perlo e l'alta densità del tuorlo aiuta a ridurre al minimo il sanguinamento esteso. La lesione del tuorlo in genere guarisce entro pochi minuti dall'inserimento della perlina. Alcuni embrioni possono presentare edema pericardico 20-24 ore dopo l'innesto di perline.

4. Smontaggio di embrioni di zebrafish

1. Dopo aver innestato le microsfere magnetiche in tutti gli embrioni montati, aggiungere 1-2 ml di terreno di Danieau contenente PTU nel piatto con fondo di vetro.
2. Usando una pinzetta, rompere delicatamente l'agarosio LMP e rimuovere con cura il pesce, assicurandosi che non rimanga agarosio su di esso.
3. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire gli embrioni in una nuova piastra di Petri contenente il terreno di Danieau con PTU e lasciarli recuperare e svilupparsi a 28,5 °C.

Risultati

Esempi di innesto di perline di successo sono mostrati nella Figura 3, nel Video 3 e nel Video 4. La perlina magnetica è stata posizionata correttamente all'interno dell'atrio del cuore del pesce zebra, consentendo un flusso sanguigno senza ostacoli e nessuna emorragia osservata. Inoltre, le pareti cardiache hanno mantenuto la loro integrità strutturale senza collassare (Figura 3 e Vid...

Discussione

Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi

Montaggio di embrioni di zebrafish

La quantità di agarosio utilizzata per montare gli embrioni è importante. La cupola formata non deve essere eccessivamente grande, in quanto ciò può ostacolare la manipolazione della perlina dalla superficie agli embrioni. Al contrario, non dovrebbe essere troppo piccolo; Avere più perle sopra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.