在新生儿兔试剂盒中植入脑电图和心电图遥测设备

摘要

癫痫猝死机制 （SUDEP） 知之甚少，难以从当前模型转化。转基因兔子可能为这些机制提供见解。我们描述了一种在转基因兔试剂盒中长期、连续地进行脑电图和心电图记录的方法，以评估可能导致死亡的严重事件。

摘要

离子通道基因的致病性变异与癫痫猝死率高 （SUDEP） 相关。SUDEP 的机制知之甚少，但除癫痫发作外，还可能涉及自主神经功能障碍和心律失常。一些离子通道基因在大脑和心脏中都表达，这可能会增加与癫痫和心律失常相关的离子通道病患者患 SUDEP 的风险。表达癫痫变异的转基因兔为研究 SUDEP 的复杂生理学提供了一个完整的生物体。重要的是，兔子比小鼠模型更紧密地复制人类心脏生理学。然而，兔子模型在接受侵入性监测程序时还需要考虑额外的健康和麻醉因素。我们开发了一种新方法，通过手术植入遥测设备，用于在新生兔试剂盒中长期同步监测脑电图 （EEG） 和心电图 （ECG）。在这里，我们展示了在 P14 （体重范围 175-250 g） 套件中植入遥测设备的手术方法，并详细关注手术入路、适当的麻醉和监测以及术后护理，从而降低并发症发生率。该方法允许在遗传性或获得性癫痫的兔模型中发生心律失常、癫痫发作和潜在 SUDEP 的关键点连续监测神经和心脏电生理学。

引言

癫痫猝死 （SUDEP） 是癫痫患者死亡的主要原因。SUDEP 的机制知之甚少，但除了癫痫发作外，还可能涉及自主神经功能障碍、呼吸暂停和心律失常 1,2,3,4,5,6,7。离子通道病相关遗传性癫痫患者的 SUDEP 发生率最高。例如，高达 20% 的电压门控钠通道基因 SCN1A⁸ 变异患者患有 SUDEP，该基因导致 Dravet 综合征，这是一种在出生后第一年发病的遗传性癫痫。许多与癫痫相关的离子通道基因在大脑和心脏中都有表达，实验室和临床数据表明，离子通道病相关的遗传性癫痫患者可能存在心律失常^{7、9、10、11、12}，由于癫痫发作诱导的致命性心律失常或同时发生癫痫发作和心律失常，可能会增加他们患 SUDEP 的风险。在实验室环境中评估 SUDEP 带来了许多挑战。从心脏的角度来看，小鼠的心脏动作电位与人类¹³ 有很大不同，人类 iPSC-心肌细胞模型¹⁴ 无法复制整个生物体的复杂性。遗传性癫痫的转基因兔模型为研究 SUDEP 提供了一个理想的系统，因为兔心脏生理学更接近于人类的心脏生理学^13,15，同时为研究复杂的病理生理学提供了一个完整的生物体。由于 SUDEP 可能早在第一次癫痫发作时发生，因此从早期时间点评估这些动物模型对于了解癫痫发作和心律失常的发作至关重要。新生儿期的视频录制具有挑战性，因为兔子幼崽通常仍在巢中。当套件与护套一起使用时，无法使用传统的有线系统进行连续脑电图 （EEG） 或心电图 （ECG） 记录。间歇性记录不太可能捕获与 SUDEP 相关的罕见终端事件。因此，我们转向无线植入式遥测监测，在兔子套件中提供长期、连续、同步的脑电图和心电图记录。

该方案成功的关键是为这些脆弱的动物提供适当的麻醉和术后支持。由于独特的解剖学和生理学特征，与狗和猫 （1.39%-4.8%） （0.17%-0.24%） 相比，兔子的麻醉死亡风险要高得多 （0.17%-0.24%）^16,17。这种麻醉风险增加的主要因素包括次优的气道管理和急性术后并发症。多种因素导致兔插管困难，包括长而窄的嘴和宽舌、嘴和喉之间的锐角、会厌背侧移位、对喉外伤的易感性增加以及喉痉挛倾向增加 18,19,20。立即麻醉发作后，兔子有患上危及生命的胃肠道淤滞综合征的风险。这是一个复杂的、多因素的问题，据推测，麻醉是通过直接药物作用抑制胃蠕动和/或手术后因任何原因（未缓解的疼痛、恶心等）引起的继发性厌食。²¹.

兔新生儿和婴儿独特的生理机能加剧了与麻醉和手术相关的挑战。兔子出生时年龄小，生理稳态机制和特殊解剖学考虑不发达。静脉通路和监测很困难，因为大多数商业产品并未针对荷兰带兔和新西兰白十字兔套件的小血管尺寸、高静息心率和色素沉着的皮肤进行优化。由于新生儿的心输出量基本上依赖于心率²² ，并且通常与成人²³ 相比，肾脏或肝脏途径的药物清除率降低，因此考虑适当的药物选择和剂量至关重要。兔子麻醉死亡的主要原因被认为是继发于呼吸抑制和呼吸暂停。除了已经讨论过所有兔子的气道管理问题外，新生儿在面对低氧血症和高碳酸血症时呼吸驱动低下，这使得麻醉的这一本已具有挑战性的方面更加危险²⁴。

在该协议中，我们描述了一种在新生儿兔癫痫模型中进行脑电图和心电图遥测植入物（图 1）的成功方法，该方法具有很高的手术和麻醉存活率。这些信息将使其他研究人员能够处理具有挑战性的新生兔模型，以推进对癫痫、心律失常和相关神经发育障碍的研究。

研究方案

所描述的所有工作均由密歇根大学机构动物护理和使用委员会审查和批准，作为批准的动物使用协议的一部分，并符合相关的联邦法律和指导方针，包括美国农业部动物福利法和 NIH 公共卫生服务政策。密歇根大学是 AAALACi 认可的机构。

1. 动物准备

1. 手术前 1-2 天使用粗剃套件（年龄 P14-P19，体重 >175 g），以尽量减少手术当天使用剪刀的麻醉时间。
2. 对所有手术工具和材料进行高压灭菌或气体灭菌（尽可能），为手术做准备。
3. 使用氯胺酮 （10 mg/kg IM）、稀释至 0.03 mg/mL 的盐酸丁丙诺啡 （0.01 mg/kg IM） 0.3 mg/mL 以及七氟烷和氧气通过使用非再呼吸回路的面罩麻醉诱导麻醉。
4. 将 26 G 3/4“ 静脉内 （IV） 导管放置在耳静脉（首选）或头静脉中，并用 10 单位/mL 的肝素化盐水冲洗。
5. 使用 #40 或 #50 刀片尽可能靠近皮肤剃须腹部、胸部、背部、颈部和头部。
6. 涂抹非药物润滑眼药膏以防止角膜溃疡。
7. 给予镇痛药（卡洛芬 4 mg/kg SQ - 稀释至 25 mg/mL）和围手术期抗生素（头孢唑啉 20 mg/kg IV 稀释至 50 mg/mL）。手术时间每 90-180 分钟重新给予抗生素。

2. 手术准备（图 2）

1. 将麻醉套件转移到手术台上，并将其仰卧放在通过直肠温度计控制的红外加热垫上。
2. 将鼻子和嘴巴放在定制的 3D 打印面罩中，该面罩通过旋转连接器连接到非再呼吸 Jackson-Rees 回路（0.5 L 袋），并保持七氟烷麻醉（1.5%-7% 效果），氧气流量为 2 L/min。
3. 使用七氟烷维持麻醉，并使用耳或爪上的脉搏血氧仪和/或股动脉或直接在心脏上的多普勒监测麻醉深度。
4. 在整个手术过程中调整麻醉效果，以维持心率 （HR） 在 180-260 之间，氧饱和度 >85%，呼吸频率在每分钟 10-50 次呼吸之间（直接观察再呼吸袋的偏移或移动）。
   注意：准备好应急药物（格隆溴铵、肾上腺素、多沙普兰）。
5. 将前肢轻轻地贴在面罩上，将套件固定到面罩上。
6. 通过将左后腿松散地固定在手术台上，将套件置于略微右侧的位置。
7. 用加热的手术磨砂膏准备整个腹部，交替使用优碘和无菌盐水。
   注意：如果需要，可以使用额外的手术解决方案来完成磨砂。外科医生穿着专用的磨砂膏、发帽和鞋套，将无菌擦洗并穿上无菌长袍和手套，在无菌条件下进行手术。
8. 将粘性手术巾放在套件的两侧，并用大手术单覆盖。切一个大小合适的洞，露出腹部和胸部。
9. 将植入物打开到手术区域，并将不可吸收的锚缝线放入每个植入物锚孔中。让缝合线连接 5-6 厘米的尾巴（图 3A）。将植入物放入一碗温热的无菌盐水中。

3. 将植入物放置在腹部

1. 确保充分麻醉后，用手术刀沿白线在皮肤上切开 3 厘米。
2. 小心地切开肌肉以打开腹膜腔。
3. 将植入物放入腹腔的颅骨部分，并将其放置在切口的左侧。
4. 使用穿刺器将负极心电图线从腹膜腔和切口右侧约 2 cm 的皮肤中挖出。将剩余的 3 根电线连接到切口左侧 3-4 厘米处，以使植入物舒适地位于腹膜腔内。
5. 用锚缝线将植入物固定在腹膜腔的腹壁上，确保没有肠卡住（图3B）。
6. 用连续模式的可吸收缝合线闭合腹壁。
7. 用不可吸收的缝线以间断方式闭合皮肤切口。

4. 放置心电图导联

1. 将负向心电图导联皮下隧道化至第一肋骨水平的右上胸部。
2. 钝性解剖皮下袋，松散地盘绕约 10 cm 的金属丝。
   注意：皮肤下的紧密线圈可能会导致皮肤腐蚀和金属丝暴露。
3. 剪断多余的电线，并通过用不可吸收的缝合线将末端绑在绝缘电线上，与裸露的电线形成一个环。
4. 用 2 根不可吸收的缝合线将环固定在肌肉上。
5. 用 1-2 根可吸收缝合线以间断方式闭合金属丝周围右侧的腹膜肌。
6. 用 2-3 条不可吸收的缝合线以间断模式闭合右上胸部和右腹部的皮肤。
7. 将阳性心电图通联至左下肋骨，并重复上述步骤以将其固定到肌肉上并关闭切口。
8. 在手术区域内，将 EEG 导通线尽可能皮下引向左侧。
9. 在出现的钢丝周围左侧的腹膜肌上添加 1 根可吸收缝合线。用不可吸收的缝合线以间断方式闭合皮肤。
10. 用无菌铝箔包裹裸露的脑电图线。

5. 背表面的准备

1. 然后，未消毒的助手将取下无菌窗帘和腿系带。
2. 将套件转到俯卧位置（图 2B），同时使用面罩和电路之间的旋转连接器旋转以确保面罩牢固地固定到位。根据需要调整脉搏血氧和/或多普勒监测器，以确保持续的麻醉监测。
3. 用 betadine 磨砂膏准备手术区域，包括头部、颈部和整个背部，小心擦洗左侧的出线区域。
4. 然后，外科医生会在左侧下方放置一条无菌胶巾，而铝箔电线包则由非无菌助手握住。
5. 以无菌方式轻轻地从铝包中取出电线，然后将它们放在无菌区域上。用无菌毛巾完成垂坠。
6. 用无菌窗帘覆盖，并切一个足够大的窗户以暴露整个无菌区域。

6. 脑电图导联的放置

1. 在中线的头皮上做一个 3 厘米的切口，露出头骨。
2. 使用套管针将脑电图导联从左侧皮下隧道化到颅骨。
3. 使用手术刀从暴露的顶骨上清洁并刮除骨膜。
4. 将手持式钻头插入无菌超声罩中。将 1.0 mm 的钻头毛刺插入钻头中。
5. 在 lambda 前方约 0.5 cm 和矢状缝外侧 0.5 cm 的顶骨上钻双侧钻孔。
   注意：小心施加在颅背上的压力，因为这会阻塞腹侧气道，因此在手术的此时，呼吸监测是关键。心率持续或显著下降可能提示呼吸闭塞（继发于呼吸暂停的心动过缓），应立即进行评估并采取行动。
6. 使用细镊子将螺钉放入毛刺孔中。使用螺丝刀插入大约一半（图 3C）。
7. 沿颈部后部钝性解剖皮下袋，松散地盘绕约 10 cm 的金属丝。
8. 剪断多余的电线。剥去尖端的绝缘层并拉伸电线。
9. 通过打结在裸露的电线的末端创建一个环，保持一个小环。将环套在螺钉上，然后将螺钉拧紧到头骨上，确保电线接触螺钉。将地线放在左侧，将记录线放在右侧。
10. 一旦所有电线都就位，在分析软件上评估遥测信号的保真度。当套件处于镇静状态时，EEG 信号将以低幅度出现。
11. 用牙科丙烯酸将螺钉和电线固定到头骨上，并使其完全硬化。
12. 在头部和左侧用不可吸收的缝合线缝合皮肤。
13. 在每个切口皮下注射布比卡因（最大剂量 2 mg/kg 的 5 mg/mL 稀释至 2.5 mg/mL）。使用结核菌素注射器施用少量皮肤胶覆盖每个切口。

7. 麻醉恢复

1. 关闭七氟烷麻醉，只提供氧气至少 5 分钟，同时取下剩余的胶带、悬垂和麻醉监测。
2. 使用血糖仪检查血糖水平，并以体重 （kg） 的 10% 给予加热的皮下液体。
3. 一旦动物对痛苦的刺激（脚趾捏）产生反应，就移至设置为 37-38 °C 的恢复培养箱中。
   注意：通常，在这种转移过程中，套件的温度会显著下降。将套件放回生物反馈红外加热垫或提供额外的补充热量可能是有益的。
4. 目视连续监测并每 10-15 分钟记录一次直肠温度、脉搏血氧仪读数、心率和呼吸频率。
5. 一旦动物持续走动和警觉，就取出静脉导管并对该部位施加压力，直到出血停止。

8. 术后护理和监测

1. 将幼崽放回母犬和幼崽伴侣。确保笼子里有筑巢材料和补充营养（材料表），以帮助体温调节和恢复。
2. 手术后 7-10 天内每天检查套件，每天称重并在笼子中提供补充营养。
3. 对于恢复后的前 2 天 （D1 和 D2），每 24 小时给予额外的镇痛药 （卡洛芬 4 mg/kg SQ - 稀释至 5 mg/mL） 和皮下液体 （5-7 mL）。
4. 在恢复后的前 3 天（第 1 天、第 2 天和第 3 天），每天检查试剂盒两次，评估疼痛、行走、切口外观和水合作用的证据。在此期间，每天一次测量试剂盒的体温，以确保没有感染迹象和适当的体温调节。
5. 如果切口在 7-10 天时适当愈合，请拆线。

结果

该项目的成功结果需要在植入程序和记录协议中开发多个参数。尝试或对 16 个兔子套件进行植入手术，其中 14 个成功存活。其中，12 例存活到实验终点。 表 1 强调了术中或术后死亡的原因，以及允许未来成功达到实验终点的程序修改。最常见的手术并发症是呼吸抑制，导致缺氧和心动过缓。该方案被修改为包括多种监测方式，包括 2 个脉搏血氧仪和一个多?...

讨论

描述的麻醉诱导、监测和支持方案平衡了手术方法和易用性的研究需求与兽医护理的黄金标准。在实验室采用所述方案作为标准程序之前，还试验了其他几种潜在的改进方法，包括背侧皮下植入物植入、使用气管插管或喉罩气道以及使用食管听诊器附件进行心率监测。然而，由于各种原因，所有这些最终都被放弃了。虽然有足够的皮下空间用于遥测放置，但由于遥测本体...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 inch elastic wrap - Coban or Vetwrap	3M	https://www.3m.com/3M/en_US/p/d/b00003186/
4-0 PDS monofilament suture	Ethicon	https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
5-0 Ethilon nylon suture	Ethicon	https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
Acquisition computer	Dell	https://www.dell.com/en-us
Adhesive surgical towels	N/A	N/A
Anesthesia circuit - Jackson-Reevs with 0.5 L rebreathing bag	JorVet	J0248GA
Betadine scrub	N/A	N/A
Bupivicaine (0.5%)	N/A	N/A	Diluted to 2.5 mg/mL prior to administration
Buprenorphine (0.3 mg/mL)	N/A	N/A	Diluted to 0.03 mg/mL prior to administration
Burr - 1.00 mm	Cell Point Scientific	60-1000	to drill skull
Cafazolin (1 g lypholized)	N/A	N/A	Diluted to 50 mg/mL
Carprofen (50 mg/mL)	MWI Veterinary		Diluted to 25 mg/mL prior to administration
Cotton tipped applicators	N/A	N/A
Custom 3-D printed face mask	N/A	https://www.thingiverse.com/thing:923725
Dental acrylic	N/A	N/A
Diet Gel Criticare	Clear H2O	72-05-5042	Nutritional support
Dopper Gel - Aquasonic	Patterson	07-890-5542
Doppler - Vet-Dop2	Patterson	07-888-8986
Doxapram (20 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	For holding screws
Duraprep	3M	8630	Final skin prep
ecgAuto data analysis software	emka technologies	N/A
Epinephrine (1:1000)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Gauze	N/A	N/A
Glucometer ipet Pro	MWI Veterinary	63867	Monitor if poor recovery
Glycopyrrolate (0.2 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Gram scale	N/A	N/A
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12	Hold wire loops while tying the loop in place
Ideal Micro-drill	Cell Point Scientific	67-1204	To drill skull
Incubator	DRE-veterinary (Infantia - NB1)	N/A
Induction box	VetEquip	941444
Infared heating pad - RightTemp Jr	Kent Scientific Corporation	RT-0502
IOX2 data acquisition software	emka technologies	N/A
IV Catheter - Covidein Monoject 26 G, 3/4 inch PTFE	Patterson	07-836-8494
ketamine (100 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A
Medical tape	N/A	N/A
Narrow Pattern Forceps - Straight/12 cm	Fine Science Tools	11002-12
Neonatal stethescope	Ultrascope	N/A
Olsen-Hegar Needle holder with scissors - 12 cm	Fine Science Tools	12002-12	For suturing
Ophthalmic ointment Puralube	MWI Veterinary	N/A	Administered to both eyes during anesthesia
Opthalmic Lubricant - Paralube Vet	Patterson	07-888-2572
Pulse oximeter (AccuWave Portable )	Patterson	07-892-9128	For prep and recovery; reads HR up to 400
Pulse oximeter (SDI - Vet/Ox plus 4700)	Heska	N/A	Intra-operative; no longer producted
Receiver	emka technologies	N/A	1 receiver for every 4 telemetry implants
Rectal thermometer	N/A	N/A
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14002-12	To cut drape
Screw driver - 1.0 mm	N/A	N/A	From mini-screwdriver set for electronics
Screws 00-96 x 3/32 (2.4 mm)	Protech International	8L0X3905202F
Sevoflurane	MWI Veterinary		Maintenance anesthesia
Sevoflurane vaporizer and anesthesia machine	N/A	N/A
Skin glue, Gluture	MWI Veterinary	34207	Apply sparingly with syringe
Small scissors	Fine Science Tools	14084-08
Sterile aluminum foil	N/A	N/A	To wrap wires prior to rotating animal
Sterile paint brush	N/A	N/A	To apply dental acrylic
Sterile Saline	N/A	N/A
Sterile surgical gloves	N/A	N/A
Sterile ultrasound cover	N/A	N/A	To cover the drill
Sterile Water	N/A	N/A	For cefazolin reconstitution
Surgical blade no. 15	N/A	N/A
Surgical drape	N/A	N/A
Surgical gown	N/A	N/A
Swivel connector - Jorgensen Labs	Patterson	07-802-2349	To connect anesthesia circuit to face mask
Telemetry implant	emka technologies	easyTEL+_M1_EETA_B_35
Trocar	SAI	TRO-10-6	To tunnel wires