Имплантация устройств электроэнцефалограммы и телеметрии электрокардиограммы в неонатальные кроличьи наборы

Резюме

Механизмы внезапной неожиданной смерти при эпилепсии (СВСЭ) плохо изучены, и их трудно перевести из современных моделей. Трансгенные кролики могут дать представление об этих механизмах. Мы описываем метод длительной непрерывной электроэнцефалографии и электрокардиографии в трансгенных кроличьих наборах для оценки серьезных событий, которые могут привести к смерти.

Аннотация

Патогенные варианты в генах ионных каналов связаны с высокой частотой внезапной неожиданной смерти при эпилепсии (SUDEP). Механизмы СВСЭ плохо изучены, но в дополнение к судорогам могут включать вегетативную дисфункцию и сердечные аритмии. Некоторые гены ионных каналов экспрессируются как в мозге, так и в сердце, потенциально увеличивая риск SUDEP у пациентов с ионными каналопатиями, связанными с эпилепсией и сердечными аритмиями. Трансгенные кролики, экспрессирующие варианты эпилепсии, обеспечивают целый организм для изучения сложной физиологии SUDEP. Важно отметить, что кролики более точно воспроизводят физиологию сердца человека, чем мышиные модели. Тем не менее, модели кроликов имеют дополнительные соображения по здоровью и анестезии при прохождении процедур инвазивного мониторинга. Нами разработан новый метод хирургической имплантации телеметрического устройства для длительного мониторинга одномоментной электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и электрокардиограммы (ЭКГ) в неонатальных наборах кроликов. В данной работе мы демонстрируем хирургические методы имплантации телеметрического устройства в комплектах P14 (вес 175-250 г) с подробным вниманием к хирургическому подходу, соответствующей анестезии и мониторингу, а также послеоперационному уходу, что приводит к низкому уровню осложнений. Этот метод позволяет осуществлять непрерывный мониторинг нервной и сердечной электрофизиологии в критические моменты развития сердечных аритмий, судорог и потенциального SUDEP в моделях генетических или приобретенных эпилепсий у кроликов.

Введение

Внезапная неожиданная смерть при эпилепсии (SUDEP) является основной причиной смерти пациентов с эпилепсией. Механизмы СВСЭ плохо изучены, но потенциально включают вегетативную дисфункцию, апноэ и сердечные аритмии в дополнение к судорогам 1,2,3,4,5,6,7. Пациенты с генетическими эпилепсиями, связанными с каналопатией, имеют одни из самых высоких показателей SUDEP. Например, СВСЭ встречается у 20% пациентов с вариантами гена-потенциал-зависимого натриевого канала SCN1A⁸, гена, ответственного за синдром Драве, генетическую эпилепсию с началом в первый год жизни. Многие гены ионных каналов, сцепленных с эпилепсией, экспрессируются как в мозге, так и в сердце, при этом лабораторные и клинические данные свидетельствуют о ^{том, что} сердечные аритмии могут присутствовать у пациентов с генетическими эпилепсиями, связанными с каналопатией^{, потенциально} увеличивая риск SUDEP из-за вызванной судорогами смертельной сердечной аритмии или одновременного возникновения судорог и аритмий. Оценка SUDEP в лабораторных условиях сопряжена с многочисленными трудностями. С кардиологической точки зрения, потенциалы сердечного действия у мышей сильно отличаются от человеческих¹³, и модели¹⁴ сердечных миоцитов человека iPSC не могут воспроизвести сложность всего организма. Трансгенные модели генетической эпилепсии кроликов обеспечивают идеальную систему для изучения SUDEP, поскольку физиология сердца кролика более точно повторяет физиологию сердца человека ^13,15, в то же время предоставляя целый организм для изучения сложной патофизиологии. Поскольку SUDEP может возникнуть уже после первого припадка, оценка этих животных моделей с ранней точки времени имеет важное значение для понимания начала как судорог, так и сердечных аритмий. Видеосъемка в неонатальный период является сложной задачей, так как кроличьи котята часто еще находятся в гнезде. Непрерывная запись электроэнцефалограммы (ЭЭГ) или электрокардиограммы (ЭКГ) с помощью традиционной проводной системы невозможна, пока комплекты находятся с плотиной. Прерывистая запись вряд ли позволит зафиксировать редкие, терминальные события, связанные с SUDEP. Поэтому мы обратились к беспроводному имплантируемому телеметрическому мониторингу, чтобы обеспечить длительную, непрерывную, одновременную запись ЭЭГ и ЭКГ в наборах кроликов.

Ключом к успеху в этом протоколе является надлежащая анестезия и послеоперационная поддержка для этих уязвимых животных. Кролики подвергаются гораздо более высокому риску смерти от анестезии (1,39%-4,8%) по сравнению с собаками и кошками (0,17%-0,24%) из-за уникальных анатомических и физиологических характеристик ^16,17. Основными факторами, способствующими повышению риска анестезии, являются неоптимальное обеспечение проходимости дыхательных путей и острые послеоперационные осложнения. Трудности интубации у кроликов обусловливают многочисленные факторы, в том числе длинный, узкий рот с широким языком, острый угол между ртом и гортанью, дорсальное смещение надгортанника, повышенная восприимчивость к травме гортани и повышенная склонность к ларингоспазму 18,19,20. После непосредственного эпизода анестезии кролики подвержены риску развития опасного для жизни синдрома желудочно-кишечного застоя. Это сложная, многофакторная проблема, и предполагается, что анестезия способствует этому через прямое воздействие препарата, ингибирующее моторику желудка и/или вторичную анорексию после процедуры по любой причине (неутихающая боль, тошнота и т.д.)²¹.

Уникальная физиология новорожденных и младенцев кроликов усугубляет проблемы, связанные с анестезией и хирургическим вмешательством. Кролики рождаются альтрициальными детенышами с неразвитыми механизмами физиологического гомеостаза и особыми анатомическими особенностями. Внутривенный доступ и мониторинг затруднены, так как большинство коммерческих продуктов не оптимизированы для небольшого размера сосудов, высокой частоты сердечных сокращений в состоянии покоя и пигментированной кожи голландских поясов и новозеландских кроликов белого креста. Поскольку сердечный выброс у новорожденных²² существенно зависит от частоты сердечных сокращений, и, в целом, клиренс препарата почечным или печеночным путем снижен по сравнению со взрослыми²³, соображения по правильному выбору препарата и дозировке имеют решающее значение. Считается, что основная причина смерти от анестезии у кроликов является вторичной по отношению к угнетению дыхания и апноэ. В дополнение к уже рассмотренным проблемам с обеспечением проходимости дыхательных путей для всех кроликов, новорожденные имеют угнетенное дыхательное влечение на фоне гипоксемии и гиперкапнии, что делает этот и без того сложный аспект анестезии более^{рискованным.}

В этом протоколе мы описываем успешный метод имплантации телеметрии ЭЭГ и ЭКГ (рис. 1) на неонатальной модели эпилепсии кролика с высокой хирургической и анестезиологической выживаемостью. Эта информация позволит другим исследователям взяться за сложные неонатальные модели кроликов, чтобы продвинуть исследования эпилепсии, сердечной аритмии и связанных с ними расстройств развития нервной системы.

протокол

Вся описанная работа была рассмотрена и одобрена Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Мичиганского университета в рамках утвержденного протокола использования животных и соответствует соответствующим федеральным законам и рекомендациям, включая Закон о благополучии животных Министерства сельского хозяйства США и Политику службы общественного здравоохранения NIH. Мичиганский университет является учреждением, аккредитованным AAALACi.

1. Подготовка животных

1. Наборы для грубого бритья (возраст P14-P19, вес >175 г) за 1-2 дня до процедуры, чтобы свести к минимуму время анестезии в день операции с помощью машинок для стрижки.
2. Автоклав или газовая стерилизация всех хирургических инструментов и материалов (насколько это возможно) при подготовке к процедуре.
3. Индуцируйте анестезию кетамином (10 мг/кг в/м), бупренорфином гидрохлоридом (0,01 мг/кг в/м) 0,3 мг/мл, разбавленными до 0,03 мг/мл, а также севофлураном и кислородом под маской с использованием контура без повторного дыхания.
4. Установите внутривенный (IV) катетер 26 G 3/4" в аурикулярную вену (предпочтительно) или головную вену и промойте гепаринизированным физиологическим раствором 10 единиц/мл.
5. Брейте живот, грудь, спину, шею и голову как можно ближе к коже с помощью лезвия #40 или #50.
6. Применяйте немедикаментозную смазывающую офтальмологическую мазь для профилактики изъязвления роговицы.
7. Назначают анальгетики (карпрофен 4 мг/кг кв/м - разведенный до 25 мг/мл) и периоперационный антибиотик (цефазолин 20 мг/кг в/в разведенный до 50 мг/мл). Повторно вводите антибиотики каждые 90-180 минут хирургического времени.

2. Хирургическая подготовка (Рисунок 2)

1. Перенесите набор под наркозом на операционный стол и положите его лежа на инфракрасную грелку, управляемую с помощью ректального термометра.
2. Поместите нос и рот в специальную 3D-печатную маску для лица, соединенную поворотным разъемом с недышащим контуром Джексона-Риса (мешок объемом 0,5 л) и поддерживайте анестезию севофлураном (эффект 1,5%-7%) с потоком кислорода со скоростью 2 л/мин.
3. Поддерживайте анестезию севофлураном и контролируйте глубину анестезии с помощью пульсоксиметра на ухе или лапе и/или допплера на бедренной артерии или непосредственно на сердце.
4. Отрегулируйте анестезию на протяжении всей процедуры, чтобы поддерживать частоту сердечных сокращений (ЧСС) в диапазоне 180-260, насыщение кислородом >85% и частоту дыхания в пределах 10-50 вдохов в минуту (прямая визуализация экскурсий или движения дыхательного мешка).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте под рукой препараты для экстренной помощи (гликопирролат, эпинефрин, доксапрам).
5. Закрепите набор на лицевой маске, аккуратно прикрепив передние конечности к маске.
6. Расположите набор в слегка право-боковом положении, неплотно прикрепив левую заднюю ногу к операционному столу.
7. Подготовьте всю брюшную полость с помощью подогретого хирургического скраба, чередуя бетадин и стерильный физиологический раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При желании для завершения скраба можно использовать дополнительное хирургическое решение. Хирург, одетый в специальные скрабы, чепчик для волос и бахилы, будет асептически чистить и надевать стерильный халат и перчатки, чтобы выполнить процедуру в стерильных условиях.
8. Положите клейкие хирургические полотенца по обе стороны от набора и накройте его большой хирургической простыней. Вырежьте отверстие подходящего размера, чтобы обнажить живот и грудь.
9. Откройте имплантат на операционном поле и наложите нерассасывающиеся анкерные швы в каждое из анкерных отверстий имплантата. Оставьте шов прикрепленным хвостом длиной 5-6 см (рисунок 3А). Поместите имплантат в миску с подогретым стерильным физиологическим раствором.

3. Установка имплантата в брюшную полость

1. Убедившись в адекватной анестезии, сделайте скальпелем разрез на 3 см через кожу по белой линии.
2. Сделайте аккуратный разрез через мышцу, чтобы открыть брюшинную полость.
3. Поместите имплантат в черепную часть брюшной полости и расположите его слева от разреза.
4. С помощью троакара проведите отрицательный провод ЭКГ из брюшинной полости и кожи примерно в 2 см справа от разреза. Проложите оставшиеся 3 провода в 3-4 см влево от разреза, чтобы имплантат мог удобно сидеть в брюшной полости.
5. Закрепите имплантат с помощью анкерных нитей на вентральной стенке брюшинной полости, не допуская ущемления кишечника (рис. 3B).
6. Закройте брюшную стенку рассасывающимся швом по непрерывной схеме.
7. Закройте разрез кожи нерассасывающимся швом в прерывистом порядке.

4. Размещение отведений ЭКГ

1. Туннель отрицательного отведения ЭКГ подкожно проведите к правой верхней части грудной клетки на уровне первого ребра.
2. Тупо рассеките подкожный карман, чтобы неплотно намотать примерно 10 см проволоки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тугие спирали под кожей могут привести к эрозии кожи и обнажению проволоки.
3. Отрежьте лишнюю проволоку и создайте петлю из оголенной проволоки, привязав конец к изолированной проволоке нерассасывающимся швом.
4. Закрепите петлю на мышце 2 нерассасывающимися швами.
5. Закройте мышцу брюшины справа вокруг проволоки 1-2 рассасывающимися швами по прерывистой схеме.
6. Закройте кожу на правой верхней части груди и правой брюшной полости 2-3 нерассасывающимися швами по прерывистой схеме.
7. Туннельируйте положительный провод ЭКГ к левому нижнему ребру и повторите описанные выше шаги, чтобы закрепить его на мышце и закрыть разрез.
8. Туннельная ЭЭГ выводит подкожно на левую боковую сторону как можно дальше в операционном поле.
9. Добавьте 1 рассасывающийся шов к мышце брюшины слева вокруг возникающих проволок. Закройте кожу нерассасывающимся швом прерывистым узором.
10. Оберните оголенные провода ЭЭГ стерильной алюминиевой фольгой.

5. Подготовка дорсальной поверхности

1. Затем нестерильный помощник снимет стерильную простыню и ножную стяжку.
2. Поверните комплект в положение лежа (рис. 2B), убедившись, что маска надежно остается на месте, вращая с помощью поворотного разъема между лицевой маской и цепью. При необходимости отрегулируйте пульсоксиметры и/или допплеровские мониторы, чтобы обеспечить непрерывный мониторинг анестезии.
3. Подготовьте операционное поле с помощью бетадинового скраба, охватывающего голову, шею и всю спину, тщательно протирая область выходящих проводов с левой стороны.
4. Затем хирург положит стерильное клейкое полотенце под левую сторону, в то время как пакет с проводами из алюминиевой фольги будет удерживаться нестерильным помощником.
5. Стерильно и аккуратно извлеките провода из алюминиевого пакета и поместите их на стерильное поле. Завершите драпировку стерильными полотенцами.
6. Накройте стерильной портьерой и вырежьте окошко, достаточно большое, чтобы обнажить все стерильное поле.

6. Размещение отведений ЭЭГ

1. Сделайте 3-сантиметровый разрез через кожу головы по средней линии, чтобы обнажить череп.
2. С помощью троакара подкожно туннелируйте провода ЭЭГ с левой стороны к черепу.
3. Очистите и соскребите надкостницу с обнаженных теменных костей с помощью скальпеля.
4. Вставьте ручную дрель в стерильный чехол для ультразвука. Вставьте в сверло сверлильный жернов диаметром 1,0 мм.
5. Просверлите двусторонние отверстия в париетальных костях примерно на 0,5 см впереди лямбды и на 0,5 см латеральнее сагиттального шва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с величиной давления, оказываемого на дорсальный череп, так как это может привести к окклюзии вентральных дыхательных путей, поэтому мониторинг дыхания является ключевым на этом этапе процедуры. Устойчивое или значительное снижение частоты сердечных сокращений может указывать на окклюзию дыхания (брадикардия на фоне апноэ) и должно побудить к немедленной оценке и действиям.
6. С помощью тонких щипцов вставьте винт в отверстие для заусенцев. С помощью отвертки вставьте примерно наполовину (Рисунок 3C).
7. Тупо рассеките подкожный карман вдоль задней части шеи, чтобы неплотно намотать примерно 10 см проволоки.
8. Отрежьте лишнюю проволоку. Снимите изоляцию с кончика и натяните провод.
9. Создайте петлю на конце оголенной проволоки, завязав узел, сохранив маленькую петлю. Наденьте петлю на винт и затяните винт к черепу, следя за тем, чтобы провод касался винта. Поместите провод заземления слева, а провод записи — справа.
10. Оценивайте сигналы телеметрии в программном обеспечении для анализа на предмет точности после того, как все провода будут установлены. Сигнал ЭЭГ будет появляться с низкой амплитудой во время приема набора под действием седативных препаратов.
11. Закрепите винты и провода на черепе стоматологическим акрилом и дайте ему полностью застыть.
12. Закройте кожу нерассасывающимся швом на голове и левом боку.
13. Бупивакаин (максимальная доза 2 мг/кг 5 мг/мл разбавленная до 2,5 мг/мл) вводят подкожно в каждый разрез. Покройте каждый разрез небольшим количеством клея для кожи, введенным с помощью туберкулинового шприца.

7. Восстановление после анестезии

1. Выключите анестезию севофлураном и подавайте только кислород в течение не менее 5 минут, снимая оставшуюся ленту, драпировку и мониторинг анестезии.
2. Проверьте уровень глюкозы в крови с помощью глюкометра и введите подогретые подкожные жидкости в количестве 10% от массы тела (кг).
3. Как только животное начнет реагировать на болезненный раздражитель (щипнуть палец ноги), переместите его в реабилитационный инкубатор, установленный при температуре 37-38 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часто температура набора значительно снижается во время такой передачи. Может быть полезно вернуть в комплект инфракрасную грелку с биологической обратной связью или обеспечить дополнительное дополнительное тепло.
4. Контролируйте визуально непрерывно и записывайте прямую температуру, показания пульсоксиметра, частоту сердечных сокращений и частоту дыхания каждые 10-15 минут.
5. После того, как животное будет постоянно передвигаться и находиться в сознании, удалите внутривенный катетер и надавите на это место до тех пор, пока кровотечение не остановится.

8. Послеоперационный уход и мониторинг

1. Верните комплект на плотину и товарищей по помету. Убедитесь, что в клетке имеется материал для гнездования и дополнительное питание (Таблица материалов), способствующие терморегуляции и восстановлению.
2. Проверяйте набор ежедневно в течение 7-10 дней после операции, взвешивая ежедневно и обеспечивая дополнительное питание в клетке.
3. В течение первых 2 дней после выздоровления (D1 и D2) давайте дополнительные анальгетики каждые 24 ч (карпрофен 4 мг/кг SQ - разбавленный до 5 мг/мл) и подкожные жидкости (5-7 мл).
4. В течение первых 3 дней после выздоровления (D1, D2 и D3) проверяйте набор два раза в день, оценивая признаки боли, передвижения, появления разрезов и гидратации. Один раз в день в течение этого периода времени измеряйте температуру набора, чтобы убедиться в отсутствии признаков инфекции и соответствующей терморегуляции.
5. Снимите швы, если разрезы заживают должным образом через 7-10 дней.

Результаты

Успешный исход этого проекта потребовал разработки нескольких параметров в процедуре имплантации и протоколе записи. Операция по имплантации была предпринята на 16 кроликах, 14 из которых успешно выжили после процедуры. Из них 12 дожили до экспериментальной конечной т?...

Обсуждение

Описанный протокол индукции, мониторинга и поддержки анестезии уравновешивает потребности исследований в хирургическом подходе и простоте с золотыми стандартами ветеринарной помощи. До того, как лаборатория приняла описанный протокол в качестве стандартной проце?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 inch elastic wrap - Coban or Vetwrap	3M	https://www.3m.com/3M/en_US/p/d/b00003186/
4-0 PDS monofilament suture	Ethicon	https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
5-0 Ethilon nylon suture	Ethicon	https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
Acquisition computer	Dell	https://www.dell.com/en-us
Adhesive surgical towels	N/A	N/A
Anesthesia circuit - Jackson-Reevs with 0.5 L rebreathing bag	JorVet	J0248GA
Betadine scrub	N/A	N/A
Bupivicaine (0.5%)	N/A	N/A	Diluted to 2.5 mg/mL prior to administration
Buprenorphine (0.3 mg/mL)	N/A	N/A	Diluted to 0.03 mg/mL prior to administration
Burr - 1.00 mm	Cell Point Scientific	60-1000	to drill skull
Cafazolin (1 g lypholized)	N/A	N/A	Diluted to 50 mg/mL
Carprofen (50 mg/mL)	MWI Veterinary		Diluted to 25 mg/mL prior to administration
Cotton tipped applicators	N/A	N/A
Custom 3-D printed face mask	N/A	https://www.thingiverse.com/thing:923725
Dental acrylic	N/A	N/A
Diet Gel Criticare	Clear H2O	72-05-5042	Nutritional support
Dopper Gel - Aquasonic	Patterson	07-890-5542
Doppler - Vet-Dop2	Patterson	07-888-8986
Doxapram (20 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	For holding screws
Duraprep	3M	8630	Final skin prep
ecgAuto data analysis software	emka technologies	N/A
Epinephrine (1:1000)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Gauze	N/A	N/A
Glucometer ipet Pro	MWI Veterinary	63867	Monitor if poor recovery
Glycopyrrolate (0.2 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Gram scale	N/A	N/A
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12	Hold wire loops while tying the loop in place
Ideal Micro-drill	Cell Point Scientific	67-1204	To drill skull
Incubator	DRE-veterinary (Infantia - NB1)	N/A
Induction box	VetEquip	941444
Infared heating pad - RightTemp Jr	Kent Scientific Corporation	RT-0502
IOX2 data acquisition software	emka technologies	N/A
IV Catheter - Covidein Monoject 26 G, 3/4 inch PTFE	Patterson	07-836-8494
ketamine (100 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A
Medical tape	N/A	N/A
Narrow Pattern Forceps - Straight/12 cm	Fine Science Tools	11002-12
Neonatal stethescope	Ultrascope	N/A
Olsen-Hegar Needle holder with scissors - 12 cm	Fine Science Tools	12002-12	For suturing
Ophthalmic ointment Puralube	MWI Veterinary	N/A	Administered to both eyes during anesthesia
Opthalmic Lubricant - Paralube Vet	Patterson	07-888-2572
Pulse oximeter (AccuWave Portable )	Patterson	07-892-9128	For prep and recovery; reads HR up to 400
Pulse oximeter (SDI - Vet/Ox plus 4700)	Heska	N/A	Intra-operative; no longer producted
Receiver	emka technologies	N/A	1 receiver for every 4 telemetry implants
Rectal thermometer	N/A	N/A
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14002-12	To cut drape
Screw driver - 1.0 mm	N/A	N/A	From mini-screwdriver set for electronics
Screws 00-96 x 3/32 (2.4 mm)	Protech International	8L0X3905202F
Sevoflurane	MWI Veterinary		Maintenance anesthesia
Sevoflurane vaporizer and anesthesia machine	N/A	N/A
Skin glue, Gluture	MWI Veterinary	34207	Apply sparingly with syringe
Small scissors	Fine Science Tools	14084-08
Sterile aluminum foil	N/A	N/A	To wrap wires prior to rotating animal
Sterile paint brush	N/A	N/A	To apply dental acrylic
Sterile Saline	N/A	N/A
Sterile surgical gloves	N/A	N/A
Sterile ultrasound cover	N/A	N/A	To cover the drill
Sterile Water	N/A	N/A	For cefazolin reconstitution
Surgical blade no. 15	N/A	N/A
Surgical drape	N/A	N/A
Surgical gown	N/A	N/A
Swivel connector - Jorgensen Labs	Patterson	07-802-2349	To connect anesthesia circuit to face mask
Telemetry implant	emka technologies	easyTEL+_M1_EETA_B_35
Trocar	SAI	TRO-10-6	To tunnel wires