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* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Les mécanismes de la mort subite inattendue dans l’épilepsie (SUDEP) sont mal compris et difficiles à traduire à partir des modèles actuels. Les lapins transgéniques peuvent offrir des informations sur ces mécanismes. Nous décrivons une méthode d’enregistrement continu à long terme de l’électroencéphalographie et de l’électrocardiographie dans des chatons de lapin transgénique afin d’évaluer les événements graves pouvant entraîner la mort.
Les variants pathogènes des gènes des canaux ioniques sont associés à un taux élevé de mort subite et inattendue dans l’épilepsie (SUDEP). Les mécanismes de la SUDEP sont mal compris, mais peuvent impliquer un dysfonctionnement autonome et des arythmies cardiaques en plus des convulsions. Certains gènes des canaux ioniques sont exprimés à la fois dans le cerveau et le cœur, ce qui peut augmenter le risque de SUDEP chez les patients atteints de canalopathies ioniques associées à l’épilepsie et aux arythmies cardiaques. Les lapins transgéniques exprimant des variantes de l’épilepsie fournissent un organisme entier pour étudier la physiologie complexe de la SUDEP. Il est important de noter que les lapins reproduisent plus fidèlement la physiologie cardiaque humaine que les modèles murins. Cependant, les modèles de lapins ont des considérations supplémentaires en matière de santé et d’anesthésie lorsqu’ils subissent des procédures de surveillance invasives. Nous avons mis au point une nouvelle méthode pour implanter chirurgicalement un dispositif de télémétrie pour la surveillance simultanée à long terme de l’électroencéphalogramme (EEG) et de l’électrocardiogramme (ECG) dans les kits de lapin nouveau-né. Ici, nous démontrons des méthodes chirurgicales pour implanter un appareil de télémétrie dans des kits P14 (plage de poids 175-250 g) avec une attention particulière à l’approche chirurgicale, à l’anesthésie et à la surveillance appropriées, et aux soins postopératoires, ce qui entraîne un faible taux de complications. Cette méthode permet une surveillance continue de l’électrophysiologie neurale et cardiaque aux moments critiques du développement des arythmies cardiaques, des convulsions et des SUDEP potentielles dans des modèles de lapin d’épilepsies génétiques ou acquises.
La mort subite et inattendue dans l’épilepsie (SUDEP) est l’une des principales causes de décès chez les patients atteints d’épilepsie. Les mécanismes de la SUDEP sont mal compris, mais impliquent potentiellement un dysfonctionnement autonome, une apnée et des arythmies cardiaques en plus des crises d’épilepsie 1,2,3,4,5,6,7. Les patients atteints d’épilepsie génétique liée à la canalopathie ont l’un des taux les plus élevés de SUDEP. Par exemple, la SUDEP survient chez jusqu’à 20 % des patients avec des variantes du gène du canal sodique voltage-dépendant SCN1A8, le gène responsable du syndrome de Dravet, une épilepsie génétique qui apparaît au cours de la première année de vie. De nombreux gènes des canaux ioniques liés à l’épilepsie sont exprimés à la fois dans le cerveau et le cœur, les données de laboratoire et cliniques suggérant que des arythmies cardiaques peuvent être présentes chez les patients atteints d’épilepsies génétiques liées à la canalopathie7, 9, 10, 11, 12, augmentant potentiellement leur risque de SUDEP en raison d’une arythmie cardiaque mortelle induite par une crise ou de l’apparition simultanée de crises et d’arythmies. L’évaluation de la SUDEP en laboratoire pose de nombreux défis. D’un point de vue cardiaque, les potentiels d’action cardiaque chez la souris sont très différents de ceux de l’homme13, et les modèles humains iPSC-myocytes cardiaques14 ne peuvent pas reproduire les complexités de l’organisme entier. Les modèles transgéniques d’épilepsie génétique chez le lapin constituent un système idéal pour étudier la SUDEP, car la physiologie cardiaque du lapin reproduit plus fidèlement celle de l’homme13,15, tout en fournissant un organisme entier pour étudier la physiopathologie complexe. Étant donné que la SUDEP peut survenir dès la première crise, il est essentiel d’évaluer ces modèles animaux à un stade précoce pour comprendre l’apparition des crises et des arythmies cardiaques. L’enregistrement vidéo pendant la période néonatale est difficile, car les chatons sont souvent encore dans le nid. L’enregistrement continu d’un électroencéphalogramme (EEG) ou d’un électrocardiogramme (ECG) avec un système filaire traditionnel n’est pas possible lorsque les kits sont avec la digue. Il est peu probable que l’enregistrement intermittent permette de saisir des événements terminaux rares associés à la SUDEP. Nous nous sommes donc tournés vers le suivi télémétrique implantable sans fil pour fournir un enregistrement EEG et ECG simultané à long terme, continu et simultané dans les kits de lapin.
Les clés du succès de ce protocole sont une anesthésie appropriée et un soutien postopératoire pour ces animaux vulnérables. Les lapins courent un risque beaucoup plus élevé de mort par anesthésie (1,39 % à 4,8 %) que les chiens et les chats (0,17 % à 0,24 %) en raison de caractéristiques anatomiques et physiologiques uniques16,17. Les principaux facteurs contribuant à ce risque accru d’anesthésie comprennent une gestion sous-optimale des voies respiratoires et des complications postopératoires aiguës. De multiples facteurs contribuent à la difficulté de l’intubation chez les lapins, notamment une bouche longue et étroite avec une langue large, un angle aigu entre la bouche et le larynx, un déplacement dorsal de l’épiglotte, une susceptibilité accrue aux traumatismes laryngés et une propension accrue au laryngospasme 18,19,20. Après l’épisode d’anesthésie immédiat, les lapins risquent de développer un syndrome de stase gastro-intestinale potentiellement mortel. Il s’agit d’un problème complexe et multifactoriel, et l’anesthésie est supposée être contributive via des effets directs de médicaments inhibant la motilité gastrique et/ou l’anorexie secondaire post-procédurale pour n’importe quelle raison (douleur non soulagée, nausées, etc.)21. Aéroport de Lyna
La physiologie unique des lapins, des nouveau-nés et des nourrissons complique les défis associés à l’anesthésie et à la chirurgie. Les lapins ont des jeunes nés nidicoles avec des mécanismes sous-développés pour l’homéostasie physiologique et des considérations anatomiques particulières. L’accès et la surveillance par voie intraveineuse sont difficiles car la plupart des produits commerciaux ne sont pas optimisés pour la petite taille vasculaire, la fréquence cardiaque élevée au repos et la peau pigmentée des lapins à ceinture hollandaise et à croix blanche de Nouvelle-Zélande. Étant donné que le débit cardiaque dépend essentiellement de la fréquence cardiaque chez les nouveau-nés22 et qu’en général, la clairance du médicament par voie rénale ou hépatique est réduite par rapport aux adultes23, il est essentiel de prendre en compte le choix du médicament et la posologie appropriés. On pense que la principale cause de mort par anesthésie chez les lapins est secondaire à la dépression respiratoire et à l’apnée. En plus des problèmes de gestion des voies respiratoires déjà discutés pour tous les lapins, les nouveau-nés ont une respiration déprimée face à l’hypoxémie et à l’hypercapnie, ce qui rend cet aspect déjà difficile de l’anesthésie plus risqué24.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode réussie d’implantation de télémétrie EEG et ECG (Figure 1) dans un modèle d’épilepsie néonatale chez le lapin avec un taux de survie chirurgical et anesthésique élevé. Ces informations permettront à d’autres chercheurs de s’attaquer à des modèles de lapins néonatals difficiles pour faire avancer la recherche sur l’épilepsie, l’arythmie cardiaque et les troubles neurodéveloppementaux connexes.
Tous les travaux décrits ont été examinés et approuvés par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan dans le cadre d’un protocole d’utilisation des animaux approuvé et sont conformes aux lois et directives fédérales pertinentes, y compris la loi sur le bien-être des animaux de l’USDA et la politique du service de santé publique des NIH. L’Université du Michigan est une institution accréditée par l’AAALACi.
1. Préparation des animaux
2. Préparation chirurgicale (figure 2)
3. Pose de l’implant dans l’abdomen
4. Placement des dérivations ECG
5. Préparation de la face dorsale
6. Placement des sondes EEG
7. Récupération de l’anesthésie
8. Soins postopératoires et suivi
Le succès de ce projet a nécessité le développement de plusieurs paramètres dans la procédure d’implant et le protocole d’enregistrement. La chirurgie implantaire a été tentée ou réalisée sur 16 petits lapins, dont 14 ont survécu avec succès à la procédure. Parmi eux, 12 ont survécu jusqu’au point final expérimental. Les raisons de la mort peropératoire ou postopératoire sont mises en évidence dans le tableau 1, ainsi que les modifications appor...
Le protocole décrit pour l’induction, la surveillance et le soutien de l’anesthésie équilibre les besoins de recherche pour l’approche chirurgicale et la facilité avec les normes d’or des soins vétérinaires. Avant que le laboratoire n’adopte le protocole décrit comme procédure standard, plusieurs autres améliorations potentielles ont été testées, notamment la pose d’implants sous-cutanés dorsaux, l’utilisation d’un tube endotrachéal ou d’un masque laryngé...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Les auteurs sont reconnaissants du financement accordé par les NIH R61NS130070 à LLI.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 inch elastic wrap - Coban or Vetwrap | 3M | https://www.3m.com/3M/en_US/p/d/b00003186/ | |
4-0 PDS monofilament suture | Ethicon | https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products | |
5-0 Ethilon nylon suture | Ethicon | https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products | |
Acquisition computer | Dell | https://www.dell.com/en-us | |
Adhesive surgical towels | N/A | N/A | |
Anesthesia circuit - Jackson-Reevs with 0.5 L rebreathing bag | JorVet | J0248GA | |
Betadine scrub | N/A | N/A | |
Bupivicaine (0.5%) | N/A | N/A | Diluted to 2.5 mg/mL prior to administration |
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | N/A | N/A | Diluted to 0.03 mg/mL prior to administration |
Burr - 1.00 mm | Cell Point Scientific | 60-1000 | to drill skull |
Cafazolin (1 g lypholized) | N/A | N/A | Diluted to 50 mg/mL |
Carprofen (50 mg/mL) | MWI Veterinary | Diluted to 25 mg/mL prior to administration | |
Cotton tipped applicators | N/A | N/A | |
Custom 3-D printed face mask | N/A | https://www.thingiverse.com/thing:923725 | |
Dental acrylic | N/A | N/A | |
Diet Gel Criticare | Clear H2O | 72-05-5042 | Nutritional support |
Dopper Gel - Aquasonic | Patterson | 07-890-5542 | |
Doppler - Vet-Dop2 | Patterson | 07-888-8986 | |
Doxapram (20 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For holding screws |
Duraprep | 3M | 8630 | Final skin prep |
ecgAuto data analysis software | emka technologies | N/A | |
Epinephrine (1:1000) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Gauze | N/A | N/A | |
Glucometer ipet Pro | MWI Veterinary | 63867 | Monitor if poor recovery |
Glycopyrrolate (0.2 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Gram scale | N/A | N/A | |
Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | Hold wire loops while tying the loop in place |
Ideal Micro-drill | Cell Point Scientific | 67-1204 | To drill skull |
Incubator | DRE-veterinary (Infantia - NB1) | N/A | |
Induction box | VetEquip | 941444 | |
Infared heating pad - RightTemp Jr | Kent Scientific Corporation | RT-0502 | |
IOX2 data acquisition software | emka technologies | N/A | |
IV Catheter - Covidein Monoject 26 G, 3/4 inch PTFE | Patterson | 07-836-8494 | |
ketamine (100 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | |
Medical tape | N/A | N/A | |
Narrow Pattern Forceps - Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11002-12 | |
Neonatal stethescope | Ultrascope | N/A | |
Olsen-Hegar Needle holder with scissors - 12 cm | Fine Science Tools | 12002-12 | For suturing |
Ophthalmic ointment Puralube | MWI Veterinary | N/A | Administered to both eyes during anesthesia |
Opthalmic Lubricant - Paralube Vet | Patterson | 07-888-2572 | |
Pulse oximeter (AccuWave Portable ) | Patterson | 07-892-9128 | For prep and recovery; reads HR up to 400 |
Pulse oximeter (SDI - Vet/Ox plus 4700) | Heska | N/A | Intra-operative; no longer producted |
Receiver | emka technologies | N/A | 1 receiver for every 4 telemetry implants |
Rectal thermometer | N/A | N/A | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | To cut drape |
Screw driver - 1.0 mm | N/A | N/A | From mini-screwdriver set for electronics |
Screws 00-96 x 3/32 (2.4 mm) | Protech International | 8L0X3905202F | |
Sevoflurane | MWI Veterinary | Maintenance anesthesia | |
Sevoflurane vaporizer and anesthesia machine | N/A | N/A | |
Skin glue, Gluture | MWI Veterinary | 34207 | Apply sparingly with syringe |
Small scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Sterile aluminum foil | N/A | N/A | To wrap wires prior to rotating animal |
Sterile paint brush | N/A | N/A | To apply dental acrylic |
Sterile Saline | N/A | N/A | |
Sterile surgical gloves | N/A | N/A | |
Sterile ultrasound cover | N/A | N/A | To cover the drill |
Sterile Water | N/A | N/A | For cefazolin reconstitution |
Surgical blade no. 15 | N/A | N/A | |
Surgical drape | N/A | N/A | |
Surgical gown | N/A | N/A | |
Swivel connector - Jorgensen Labs | Patterson | 07-802-2349 | To connect anesthesia circuit to face mask |
Telemetry implant | emka technologies | easyTEL+_M1_EETA_B_35 | |
Trocar | SAI | TRO-10-6 | To tunnel wires |
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