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* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Die Mechanismen des plötzlichen unerwarteten Todes bei Epilepsie (SUDEP) sind nur unzureichend verstanden und lassen sich nur schwer aus aktuellen Modellen übertragen. Transgene Kaninchen könnten Einblicke in diese Mechanismen geben. Wir beschreiben ein Verfahren für langfristige, kontinuierliche Elektroenzephalographie- und Elektrokardiographie-Aufzeichnungen in transgenen Kaninchen-Kits zur Bewertung schwerwiegender Ereignisse, die zum Tod führen können.
Pathogene Varianten in Ionenkanal-Genen sind mit einer hohen Rate an plötzlichen unerwarteten Todesfällen bei Epilepsie (SUDEP) verbunden. Die Mechanismen von SUDEP sind nur unzureichend verstanden, können aber neben Krampfanfällen auch autonome Dysfunktionen und Herzrhythmusstörungen beinhalten. Einige Ionenkanalgene werden sowohl im Gehirn als auch im Herzen exprimiert, was möglicherweise das Risiko für SUDEP bei Patienten mit Ionenkanalopathien im Zusammenhang mit Epilepsie und Herzrhythmusstörungen erhöht. Transgene Kaninchen, die Epilepsievarianten exprimieren, bieten einen ganzen Organismus, um die komplexe Physiologie von SUDEP zu untersuchen. Wichtig ist, dass Kaninchen die menschliche Herzphysiologie besser nachbilden als Mausmodelle. Bei Kaninchenmodellen sind jedoch zusätzliche gesundheitliche und anästhesietechnische Überlegungen erforderlich, wenn sie sich invasiven Überwachungsverfahren unterziehen. Wir haben eine neuartige Methode entwickelt, um ein Telemetriegerät für die langfristige simultane Überwachung von Elektroenzephalogrammen (EEG) und Elektrokardiogrammen (EKG) in Kaninchen-Kits für Neugeborene chirurgisch zu implantieren. Hier demonstrieren wir chirurgische Methoden zur Implantation eines Telemetriegeräts in P14-Kits (Gewichtsbereich 175-250 g) mit detaillierter Berücksichtigung des chirurgischen Ansatzes, einer angemessenen Anästhesie und Überwachung sowie der postoperativen Versorgung, was zu einer niedrigen Komplikationsrate führt. Diese Methode ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung der neuronalen und kardialen Elektrophysiologie während kritischer Punkte in der Entwicklung von Herzrhythmusstörungen, Krampfanfällen und potenziellem SUDEP in Kaninchenmodellen für genetische oder erworbene Epilepsien.
Der plötzliche unerwartete Tod bei Epilepsie (SUDEP) ist eine der häufigsten Todesursachen bei Patienten mit Epilepsie. Die Mechanismen von SUDEP sind nur unzureichend verstanden, umfassen aber möglicherweise autonome Dysfunktion, Apnoe und Herzrhythmusstörungen zusätzlich zu Anfällen 1,2,3,4,5,6,7. Patienten mit kanalopathiebedingten genetischen Epilepsien gehören zu den höchsten SUDEP-Raten. So tritt SUDEP bei bis zu 20 % der Patienten mit Varianten im spannungsgesteuerten Natriumkanal-Gen SCN1A8 auf, dem Gen, das für das Dravet-Syndrom verantwortlich ist, eine genetische Epilepsie, die im ersten Lebensjahr beginnt. Viele epilepsiegebundene Ionenkanalgene werden sowohl im Gehirn als auch im Herzen exprimiert, wobei Labor- und klinische Daten darauf hindeuten, dass Herzrhythmusstörungen bei Patienten mit kanalopathiebedingten genetischen Epilepsien vorliegen können7, 9,10,11,12, was möglicherweise ihr SUDEP-Risiko aufgrund einer anfallsinduzierten tödlichen Herzrhythmusstörung oder des gleichzeitigen Auftretens von Anfällen und Arrhythmien erhöht. Die Evaluierung von SUDEP im Labor bringt zahlreiche Herausforderungen mit sich. Aus kardialer Sicht unterscheiden sich die kardialen Aktionspotentiale bei Mäusen stark von denen beim Menschen13, und humane iPSC-Herzmyozytenmodelle14 können die Komplexität des gesamten Organismus nicht replizieren. Transgene Kaninchenmodelle genetischer Epilepsien bieten ein ideales System zur Untersuchung von SUDEP, da die Herzphysiologie von Kaninchen die des Menschen besser repliziert13,15, während sie gleichzeitig einen ganzen Organismus zur Untersuchung komplexer Pathophysiologie bieten. Da SUDEP bereits beim ersten Anfall auftreten kann, ist die Bewertung dieser Tiermodelle von einem frühen Zeitpunkt an unerlässlich, um das Auftreten von Anfällen und Herzrhythmusstörungen zu verstehen. Die Videoaufzeichnung während der Neugeborenenperiode ist eine Herausforderung, da sich die Kaninchenbabys oft noch im Nest befinden. Eine kontinuierliche Aufzeichnung eines Elektroenzephalogramms (EEG) oder Elektrokardiogramms (EKG) mit einem herkömmlichen kabelgebundenen System ist nicht möglich, solange sich die Kits beim Muttertier befinden. Es ist unwahrscheinlich, dass bei der intermittierenden Aufzeichnung seltene, terminale Ereignisse im Zusammenhang mit SUDEP erfasst werden. Wir haben uns daher der drahtlosen implantierbaren Telemetrieüberwachung zugewandt, um eine langfristige, kontinuierliche, gleichzeitige EEG- und EKG-Aufzeichnung in Kaninchen-Kits zu ermöglichen.
Der Schlüssel zum Erfolg dieses Protokolls ist eine angemessene Anästhesie und postoperative Unterstützung für diese gefährdeten Tiere. Kaninchen haben im Vergleich zu Hunden und Katzen (0,17-0,24%) aufgrund einzigartiger anatomischer und physiologischer Merkmale ein viel höheres Risiko für den Tod an Anästhetika (1,39%-4,8%) 16,17. Zu den Hauptursachen für dieses erhöhte Anästhesierisiko gehören ein suboptimales Atemwegsmanagement und akute postoperative Komplikationen. Mehrere Faktoren tragen zu den Schwierigkeiten der Intubation bei Kaninchen bei, darunter ein langes, schmales Maul mit breiter Zunge, ein spitzer Winkel zwischen Mund und Kehlkopf, eine dorsale Verschiebung der Epiglottis, eine erhöhte Anfälligkeit für Kehlkopftraumata und eine erhöhte Neigung zu Laryngospasmus 18,19,20. Nach der Sofortanästhesieepisode besteht bei Kaninchen das Risiko, ein lebensbedrohliches gastrointestinales Stauungssyndrom zu entwickeln. Dies ist ein komplexes, multifaktorielles Problem, und es wird postuliert, dass die Anästhesie über direkte Arzneimittelwirkungen, die die Magenmotilität und/oder sekundäre Magersucht nach dem Verfahren hemmen, aus irgendeinem Grund (nicht gelinderte Schmerzen, Übelkeit usw.) dazu beiträgt21. Urheberrecht
Die einzigartige Physiologie von Kaninchen-Neugeborenen und Säuglingen verschärft die Herausforderungen, die mit Anästhesie und Operation verbunden sind. Kaninchen haben altriciale Jungtiere, die mit unterentwickelten Mechanismen für physiologische Homöostase und besonderen anatomischen Überlegungen geboren werden. Der intravenöse Zugang und die Überwachung sind schwierig, da die meisten kommerziellen Produkte nicht für die geringe Gefäßgröße, die hohe Ruheherzfrequenz und die pigmentierte Haut von Kaninchen-Kits mit holländischem Gürtel und neuseeländischem Weißkreuz optimiert sind. Da das Herzzeitvolumen bei Neugeborenen im Wesentlichen von der Herzfrequenz abhängt22 und die Arzneimittelclearance über die Nieren oder Leber im Vergleich zu Erwachsenen im Allgemeinen verringert ist23, sind Überlegungen zur geeigneten Arzneimittelauswahl und Dosierung von entscheidender Bedeutung. Es wird angenommen, dass die Hauptursache für den Tod von Anästhetika bei Kaninchen sekundär zu Atemdepression und Apnoe ist. Zusätzlich zu den bereits bei allen Kaninchen diskutierten Problemen des Atemwegsmanagements haben Neugeborene angesichts von Hypoxämie und Hyperkapnie einen verminderten Atemantrieb, was diesen ohnehin schon schwierigen Aspekt der Anästhesie noch riskanter macht24.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine erfolgreiche Methode zur Implantation von EEG- und EKG-Telemetrie (Abbildung 1) in einem neonatalen Kaninchenmodell der Epilepsie mit einer hohen chirurgischen und anästhetischen Überlebensrate. Diese Informationen werden es anderen Forschern ermöglichen, anspruchsvolle Kaninchenmodelle für Neugeborene anzugehen, um die Forschung zu Epilepsie, Herzrhythmusstörungen und verwandten neurologischen Entwicklungsstörungen voranzutreiben.
Alle beschriebenen Arbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan im Rahmen eines genehmigten Tierverwendungsprotokolls überprüft und genehmigt und stehen in Übereinstimmung mit den einschlägigen Bundesgesetzen und -richtlinien, einschließlich des USDA Animal Welfare Act und der NIH Public Health Service Policy. Die University of Michigan ist eine AAALACi-akkreditierte Institution.
1. Vorbereitung der Tiere
2. Chirurgische Vorbereitung (Abbildung 2)
3. Platzierung des Implantats im Bauch
4. Platzierung der EKG-Ableitungen
5. Vorbereitung der Rückenfläche
6. Platzierung der EEG-Elektroden
7. Wiederherstellung der Anästhesie
8. Postoperative Pflege und Überwachung
Das erfolgreiche Ergebnis dieses Projekts erforderte die Entwicklung mehrerer Parameter im Implantatverfahren und im Aufzeichnungsprotokoll. Eine Implantatoperation wurde an 16 Kaninchen-Kits versucht oder durchgeführt, wobei 14 den Eingriff erfolgreich überlebten. Von diesen überlebten 12 bis zum experimentellen Endpunkt. In Tabelle 1 sind die Gründe für den intraoperativen oder postoperativen Tod aufgeführt, zusammen mit Verfahrensmodifikationen, die einen zukün...
Das beschriebene Protokoll für die Induktion, Überwachung und Unterstützung von Anästhetika gleicht den Forschungsbedarf an chirurgischen Ansätzen und Leichtigkeit mit den Goldstandards der tierärztlichen Versorgung aus. Bevor das Labor das beschriebene Protokoll als Standardverfahren anwendete, wurden mehrere andere potenzielle Verfeinerungen getestet, einschließlich der dorsalen subkutanen Implantatinsertion, der Verwendung eines Endotrachealtubus oder einer Larynxmaske und der ...
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Die Autoren sind dankbar für die Finanzierung durch die NIH R61NS130070 an LLI.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 inch elastic wrap - Coban or Vetwrap | 3M | https://www.3m.com/3M/en_US/p/d/b00003186/ | |
4-0 PDS monofilament suture | Ethicon | https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products | |
5-0 Ethilon nylon suture | Ethicon | https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products | |
Acquisition computer | Dell | https://www.dell.com/en-us | |
Adhesive surgical towels | N/A | N/A | |
Anesthesia circuit - Jackson-Reevs with 0.5 L rebreathing bag | JorVet | J0248GA | |
Betadine scrub | N/A | N/A | |
Bupivicaine (0.5%) | N/A | N/A | Diluted to 2.5 mg/mL prior to administration |
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | N/A | N/A | Diluted to 0.03 mg/mL prior to administration |
Burr - 1.00 mm | Cell Point Scientific | 60-1000 | to drill skull |
Cafazolin (1 g lypholized) | N/A | N/A | Diluted to 50 mg/mL |
Carprofen (50 mg/mL) | MWI Veterinary | Diluted to 25 mg/mL prior to administration | |
Cotton tipped applicators | N/A | N/A | |
Custom 3-D printed face mask | N/A | https://www.thingiverse.com/thing:923725 | |
Dental acrylic | N/A | N/A | |
Diet Gel Criticare | Clear H2O | 72-05-5042 | Nutritional support |
Dopper Gel - Aquasonic | Patterson | 07-890-5542 | |
Doppler - Vet-Dop2 | Patterson | 07-888-8986 | |
Doxapram (20 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For holding screws |
Duraprep | 3M | 8630 | Final skin prep |
ecgAuto data analysis software | emka technologies | N/A | |
Epinephrine (1:1000) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Gauze | N/A | N/A | |
Glucometer ipet Pro | MWI Veterinary | 63867 | Monitor if poor recovery |
Glycopyrrolate (0.2 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Gram scale | N/A | N/A | |
Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | Hold wire loops while tying the loop in place |
Ideal Micro-drill | Cell Point Scientific | 67-1204 | To drill skull |
Incubator | DRE-veterinary (Infantia - NB1) | N/A | |
Induction box | VetEquip | 941444 | |
Infared heating pad - RightTemp Jr | Kent Scientific Corporation | RT-0502 | |
IOX2 data acquisition software | emka technologies | N/A | |
IV Catheter - Covidein Monoject 26 G, 3/4 inch PTFE | Patterson | 07-836-8494 | |
ketamine (100 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | |
Medical tape | N/A | N/A | |
Narrow Pattern Forceps - Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11002-12 | |
Neonatal stethescope | Ultrascope | N/A | |
Olsen-Hegar Needle holder with scissors - 12 cm | Fine Science Tools | 12002-12 | For suturing |
Ophthalmic ointment Puralube | MWI Veterinary | N/A | Administered to both eyes during anesthesia |
Opthalmic Lubricant - Paralube Vet | Patterson | 07-888-2572 | |
Pulse oximeter (AccuWave Portable ) | Patterson | 07-892-9128 | For prep and recovery; reads HR up to 400 |
Pulse oximeter (SDI - Vet/Ox plus 4700) | Heska | N/A | Intra-operative; no longer producted |
Receiver | emka technologies | N/A | 1 receiver for every 4 telemetry implants |
Rectal thermometer | N/A | N/A | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | To cut drape |
Screw driver - 1.0 mm | N/A | N/A | From mini-screwdriver set for electronics |
Screws 00-96 x 3/32 (2.4 mm) | Protech International | 8L0X3905202F | |
Sevoflurane | MWI Veterinary | Maintenance anesthesia | |
Sevoflurane vaporizer and anesthesia machine | N/A | N/A | |
Skin glue, Gluture | MWI Veterinary | 34207 | Apply sparingly with syringe |
Small scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Sterile aluminum foil | N/A | N/A | To wrap wires prior to rotating animal |
Sterile paint brush | N/A | N/A | To apply dental acrylic |
Sterile Saline | N/A | N/A | |
Sterile surgical gloves | N/A | N/A | |
Sterile ultrasound cover | N/A | N/A | To cover the drill |
Sterile Water | N/A | N/A | For cefazolin reconstitution |
Surgical blade no. 15 | N/A | N/A | |
Surgical drape | N/A | N/A | |
Surgical gown | N/A | N/A | |
Swivel connector - Jorgensen Labs | Patterson | 07-802-2349 | To connect anesthesia circuit to face mask |
Telemetry implant | emka technologies | easyTEL+_M1_EETA_B_35 | |
Trocar | SAI | TRO-10-6 | To tunnel wires |
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