Implante de Eletroencefalograma e Telecardiograma em Kits Neonatais para Coelhos

Resumo

Os mecanismos de morte súbita inesperada na epilepsia (SUDEP) são pouco compreendidos e difíceis de traduzir a partir dos modelos atuais. Coelhos transgênicos podem oferecer informações sobre esses mecanismos. Descrevemos um método para eletroencefalografia contínua de longo prazo e registros eletrocardiográficos em kits de coelhos transgênicos para avaliar eventos graves que podem levar à morte.

Resumo

Variantes patogênicas em genes de canais iônicos estão associadas a uma alta taxa de morte súbita inesperada na epilepsia (SUDEP). Os mecanismos da SUDEP são pouco compreendidos, mas podem envolver disfunção autonômica e arritmias cardíacas, além de convulsões. Alguns genes de canais iônicos são expressos no cérebro e no coração, aumentando potencialmente o risco de SUDEP em pacientes com canalopatias iônicas associadas a epilepsia e arritmias cardíacas. Coelhos transgênicos que expressam variantes de epilepsia fornecem um organismo inteiro para estudar a complexa fisiologia da SUDEP. É importante ressaltar que os coelhos replicam mais de perto a fisiologia cardíaca humana do que os modelos de camundongos. No entanto, os modelos de coelhos têm considerações adicionais de saúde e anestesia quando submetidos a procedimentos de monitoramento invasivos. Desenvolvemos um novo método para implantar cirurgicamente um dispositivo de telemetria para monitoramento simultâneo de eletroencefalograma (EEG) e eletrocardiograma (ECG) de longo prazo em kits de coelhos neonatais. Aqui, demonstramos métodos cirúrgicos para implantar um dispositivo de telemetria em kits P14 (faixa de peso 175-250 g) com atenção detalhada à abordagem cirúrgica, anestesia e monitoramento adequados e cuidados pós-operatórios, resultando em uma baixa taxa de complicações. Este método permite o monitoramento contínuo da eletrofisiologia neural e cardíaca durante pontos críticos no desenvolvimento de arritmias cardíacas, convulsões e potencial SUDEP em modelos de coelhos de epilepsias genéticas ou adquiridas.

Introdução

A morte súbita inesperada na epilepsia (SUDEP) é uma das principais causas de morte em pacientes com epilepsia. Os mecanismos da SUDEP são pouco compreendidos, mas potencialmente envolvem disfunção autonômica, apneia e arritmias cardíacas, além de convulsões 1,2,3,4,5,6,7. Pacientes com epilepsias genéticas ligadas à canalopatia têm uma das taxas mais altas de SUDEP. Por exemplo, a SUDEP ocorre em até 20% dos pacientes com variantes no gene do canal de sódio dependente de voltagem SCN1A⁸, o gene responsável pela síndrome de Dravet, uma epilepsia genética com início no primeiro ano de vida. Muitos genes de canais iônicos ligados à epilepsia são expressos no cérebro e no coração, com dados laboratoriais e clínicos sugerindo que arritmias cardíacas podem estar presentes em pacientes com epilepsias genéticas ligadas à canalopatia^{7, 9,10,11,12}, aumentando potencialmente o risco de SUDEP devido a uma arritmia cardíaca fatal induzida por convulsão ou ocorrência simultânea de convulsões e arritmias. Avaliar a SUDEP no ambiente laboratorial apresenta inúmeros desafios. Do ponto de vista cardíaco, os potenciais de ação cardíacos em camundongos são muito diferentes dos humanos¹³, e os modelos de miócitos cardíacos iPSC humanos¹⁴ não podem replicar as complexidades de todo o organismo. Modelos transgênicos de epilepsias genéticas em coelhos fornecem um sistema ideal para estudar a SUDEP, pois a fisiologia cardíaca do coelho replica mais de perto a do humano^13,15, ao mesmo tempo em que fornece um organismo inteiro para estudar a fisiopatologia complexa. Como a SUDEP pode ocorrer já na primeira convulsão, avaliar esses modelos animais desde o início é essencial para entender o início das convulsões e arritmias cardíacas. A gravação de vídeo durante o período neonatal é um desafio, pois os filhotes de coelhos geralmente ainda estão no ninho. O registro contínuo de eletroencefalograma (EEG) ou eletrocardiograma (ECG) com um sistema tradicional com fio não é possível enquanto os kits estiverem com a barragem. É improvável que o registro intermitente capture eventos terminais raros associados à SUDEP. Portanto, recorremos ao monitoramento de telemetria implantável sem fio para fornecer registro de EEG e ECG de longo prazo, contínuo e simultâneo em kits de coelhos.

As chaves para o sucesso neste protocolo são o suporte anestésico e pós-operatório adequado para esses animais vulneráveis. Os coelhos apresentam um risco muito maior de morte anestésica (1,39%-4,8%) em comparação com cães e gatos (0,17%-0,24%) devido às características anatômicas e fisiológicas únicas^16,17. Os principais contribuintes para esse aumento do risco anestésico incluem o manejo subótimo das vias aéreas e complicações pós-operatórias agudas. Múltiplos fatores contribuem para a dificuldade de intubação em coelhos, incluindo boca longa e estreita com língua larga, ângulo agudo entre a boca e a laringe, deslocamento dorsal da epiglote, aumento da suscetibilidade ao trauma laríngeo e aumento da propensão ao laringoespasmo 18,19,20. Após o episódio anestésico imediato, os coelhos correm o risco de desenvolver síndrome de estase gastrointestinal com risco de vida. Este é um problema complexo e multifatorial, e postula-se que a anestesia contribua por meio de efeitos diretos de drogas que inibem a motilidade gástrica e/ou anorexia secundária pós-procedimento por qualquer motivo (dor não aliviada, náusea, etc.)²¹.

A fisiologia única de recém-nascidos e bebês de coelhos agrava os desafios associados à anestesia e à cirurgia. Os coelhos têm filhotes altriciais nascidos com mecanismos subdesenvolvidos para homeostase fisiológica e considerações anatômicas especiais. O acesso intravenoso e o monitoramento são difíceis, pois a maioria dos produtos comerciais não é otimizada para o pequeno tamanho vascular, alta frequência cardíaca em repouso e pele pigmentada dos kits de coelhos com cinto holandês e cruz branca da Nova Zelândia. Como o débito cardíaco é essencialmente dependente da frequência cardíaca em neonatos²² e, em geral, a depuração do medicamento por via renal ou hepática é diminuída em comparação com adultos²³, as considerações para a seleção e dosagem adequadas do medicamento são críticas. Acredita-se que a principal causa de morte anestésica em coelhos seja secundária à depressão respiratória e apneia. Além dos problemas de manejo das vias aéreas já discutidos para todos os coelhos, os neonatos apresentam um impulso respiratório deprimido diante da hipoxemia e hipercapnia, tornando esse aspecto já desafiador da anestesia mais arriscado²⁴.

Neste protocolo, descrevemos um método bem-sucedido para implante de telemetria de EEG e ECG (Figura 1) em um modelo de epilepsia de coelho neonatal com alta taxa de sobrevida cirúrgica e anestésica. Essas informações permitirão que outros pesquisadores enfrentem modelos desafiadores de coelhos neonatais para avançar na pesquisa sobre epilepsia, arritmia cardíaca e distúrbios relacionados ao neurodesenvolvimento.

Protocolo

Todo o trabalho descrito foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan como parte de um protocolo de uso de animais aprovado e está de acordo com as leis e diretrizes federais relevantes, incluindo a Lei de Bem-Estar Animal do USDA e a Política de Serviço de Saúde Pública do NIH. A Universidade de Michigan é uma instituição credenciada pela AAALACi.

1. Preparação animal

1. Kits de barbear áspero (idade P14-P19, peso >175 g) 1-2 dias antes do procedimento para minimizar o tempo de anestesia no dia da cirurgia usando tesouras.
2. Autoclave ou esterilize a gás todas as ferramentas e materiais cirúrgicos (conforme possível) em preparação para o procedimento.
3. Induza a anestesia com cetamina (10 mg/kg IM), buprenorfina HCl (0,01 mg/kg IM) 0,3 mg/mL diluído a 0,03 mg/mL e sevoflurano e oxigênio por meio de máscara de anestesia usando um circuito sem reinalação.
4. Coloque um cateter intravenoso (IV) 26 G 3/4" na veia auricular (preferencial) ou na veia cefálica e lave com solução salina heparinizada 10 unidades/mL.
5. Depile o abdômen, peito, costas, pescoço e cabeça o mais próximo possível da pele usando uma lâmina #40 ou #50.
6. Aplique pomada oftálmica lubrificante não medicamentosa para prevenir a ulceração da córnea.
7. Administre analgésicos (carprofeno 4 mg/kg SQ - diluído a 25 mg/mL) e antibiótico perioperatório (cefazolina 20 mg/kg IV diluído a 50 mg/mL). Readministre antibióticos a cada 90-180 minutos de tempo cirúrgico.

2. Preparo cirúrgico (Figura 2)

1. Transfira o kit anestesiado para a mesa cirúrgica e coloque-o em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento infravermelho controlada por um termômetro retal.
2. Coloque o nariz e a boca em uma máscara facial impressa em 3D personalizada conectada com um conector giratório a um circuito Jackson-Rees sem reinalação (bolsa de 0,5 L) e mantenha a anestesia com sevoflurano (1,5% -7% para efeito) com fluxo de oxigênio a 2 L / min.
3. Mantenha a anestesia com sevoflurano e monitore a profundidade da anestesia com um oxímetro de pulso na orelha ou na pata e/ou um Doppler na artéria femoral ou diretamente no coração.
4. Ajuste a anestesia durante todo o procedimento para manter a frequência cardíaca (FC) entre 180-260, saturação de oxigênio >85% e frequência respiratória entre 10-50 respirações por minuto (visualização direta de excursões ou movimento da bolsa de reinalação).
   NOTA: Tenha medicamentos de emergência disponíveis (glicopirrolato, epinefrina, doxapram).
5. Prenda o kit à máscara facial colando suavemente os membros dianteiros na máscara.
6. Posicione o kit em uma posição ligeiramente lateral direita, prendendo frouxamente a perna traseira esquerda à mesa de operação.
7. Prepare todo o abdômen com uma esfoliação cirúrgica aquecida alternando betadina e soro fisiológico estéril.
   NOTA: Uma solução cirúrgica adicional pode ser usada para finalizar a esfoliação, se desejado. O cirurgião, usando jalecos dedicados, gorro de cabelo e capas de sapato, esfregará assepticamente e vestirá aventais e luvas estéreis para realizar o procedimento em condições estéreis.
8. Coloque toalhas cirúrgicas adesivas em ambos os lados do kit e cubra-o com uma grande cortina cirúrgica. Faça um orifício de tamanho apropriado para expor o abdômen e o peito.
9. Abra o implante no campo cirúrgico e coloque suturas de âncora não absorvíveis em cada um dos orifícios de ancoragem do implante. Deixe a sutura presa com uma cauda de 5-6 cm (Figura 3A). Coloque o implante em uma tigela de solução salina estéril aquecida.

3. Colocação do implante no abdômen

1. Depois de garantir a anestesia adequada, faça uma incisão de 3 cm através da pele ao longo da linha alba com um bisturi.
2. Faça uma incisão cuidadosa através do músculo para abrir a cavidade peritoneal.
3. Coloque o implante na porção cranial da cavidade abdominal e posicione-o à esquerda da incisão.
4. Use um trocarte para tunelar o fio de ECG negativo para fora da cavidade peritoneal e da pele aproximadamente 2 cm à direita da incisão. Encapsule os 3 fios restantes 3-4 cm à esquerda da incisão para permitir que o implante se encaixe confortavelmente dentro da cavidade peritoneal.
5. Prenda o implante com os pontos de ancoragem na parede ventral da cavidade peritoneal, garantindo que não haja aprisionamento intestinal (Figura 3B).
6. Feche a parede abdominal com uma sutura absorvível em um padrão contínuo.
7. Feche a incisão na pele com uma sutura não absorvível em um padrão interrompido.

4. Colocação das derivações de ECG

1. Tunelamente a derivação negativa do ECG por via subcutânea para a parte superior direita do tórax, ao nível da primeira costela.
2. Disseque sem rodeios uma bolsa subcutânea para enrolar frouxamente aproximadamente 10 cm de fio.
   NOTA: Bobinas apertadas sob a pele podem levar à erosão da pele e à exposição do fio.
3. Corte o excesso de fio e crie um laço com o fio exposto amarrando a extremidade ao fio isolado com uma sutura não absorvível.
4. Prenda o laço ao músculo com 2 suturas não absorvíveis.
5. Feche o músculo peritoneal à direita ao redor do fio com 1-2 suturas absorvíveis em um padrão interrompido.
6. Feche a pele na parte superior direita do tórax e abdômen direito com 2-3 suturas não absorvíveis em um padrão interrompido.
7. Tunelamente o eletrodo de ECG positivo para a costela inferior esquerda e repita as etapas acima para prendê-lo ao músculo e fechar a incisão.
8. Túnel o EEG leva subcutaneamente para o lado lateral esquerdo, tanto quanto possível no campo cirúrgico.
9. Adicione 1 sutura absorvível ao músculo peritoneal à esquerda ao redor dos fios emergentes. Feche a pele com sutura não absorvível em um padrão interrompido.
10. Enrole os fios de EEG expostos com papel alumínio estéril.

5. Preparação da superfície dorsal

1. Um assistente não estéril removerá a cortina estéril e o laço da perna.
2. Vire o kit para a posição de bruços (Figura 2B) enquanto garante que a máscara facial permaneça firmemente no lugar, girando usando o conector giratório entre a máscara facial e o circuito. Ajuste os monitores de oxímetro de pulso e/ou doppler conforme necessário para garantir o monitoramento anestésico contínuo.
3. Prepare o campo cirúrgico com uma esfoliação betadina para incluir a cabeça, pescoço e costas inteiras com cuidado para esfregar ao redor da região dos fios de saída no lado esquerdo.
4. O cirurgião colocará uma toalha adesiva estéril sob o lado esquerdo enquanto o pacote de fios de papel alumínio é segurado por um assistente não estéril.
5. Remova de forma estéril e cuidadosa os fios do pacote de alumínio e coloque-os no campo estéril. Termine de cobrir com toalhas estéreis.
6. Cubra com uma cortina estéril e corte uma janela grande o suficiente para expor todo o campo estéril.

6. Colocação de eletrodos de EEG

1. Faça uma incisão de 3 cm no couro cabeludo na linha média para expor o crânio.
2. Use um trocarte para tunelar subcutaneamente os eletrodos do EEG do lado esquerdo para o crânio.
3. Limpe e raspe o periósteo dos ossos parietais expostos usando um bisturi.
4. Insira uma broca portátil em uma capa de ultrassom estéril. Insira uma broca de 1.0 mm na broca.
5. Faça furos de broca bilaterais nos ossos parietais aproximadamente 0,5 cm anterior à lambda e 0,5 cm lateral à sutura sagital.
   NOTA: Cuidado com a quantidade de pressão colocada na parte dorsal do crânio, pois isso pode ocluir as vias aéreas ventrais, portanto, o monitoramento respiratório é fundamental neste ponto do procedimento. Uma queda constante ou significativa na frequência cardíaca pode indicar oclusão respiratória (bradicardia secundária à apneia) e deve levar a uma avaliação e ação imediatas.
6. Use uma pinça fina para colocar um parafuso no orifício da rebarba. Use a chave de fenda para inserir aproximadamente na metade (Figura 3C).
7. Disseque sem rodeios uma bolsa subcutânea ao longo da parte de trás do pescoço para enrolar frouxamente aproximadamente 10 cm de fio.
8. Corte o excesso de fio. Descasque o isolamento da ponta e estique o fio.
9. Crie um laço na extremidade do fio exposto dando um nó, mantendo um pequeno laço. Coloque o laço sobre o parafuso e aperte o parafuso no crânio, certificando-se de que o fio esteja tocando o parafuso. Coloque o fio terra à esquerda e o fio de gravação à direita.
10. Avalie a fidelidade dos sinais de telemetria no software de análise assim que todos os fios estiverem no lugar. O sinal de EEG aparecerá em baixa amplitude enquanto o kit estiver sedado.
11. Prenda os parafusos e fios ao crânio com acrílico dental e deixe-o endurecer completamente.
12. Feche a pele com uma sutura não absorvível na cabeça e no flanco esquerdo.
13. Injete bupivacaína (dose máxima de 2 mg/kg de 5 mg/mL diluída a 2,5 mg/mL) por via subcutânea em cada incisão. Cubra cada incisão com uma pequena quantidade de cola para a pele administrada com uma seringa de tuberculina.

7. Recuperação anestésica

1. Desligue a anestesia com sevoflurano e forneça apenas oxigênio por pelo menos 5 minutos enquanto remove a fita restante, o campo e o monitoramento anestésico.
2. Verifique os níveis de glicose no sangue usando um glicosímetro e administre fluidos subcutâneos aquecidos a 10% do peso corporal (kg).
3. Quando o animal estiver reativo a um estímulo doloroso (pinçamento do dedo do pé), vá para uma incubadora de recuperação ajustada a 37-38 °C.
   NOTA: Muitas vezes, a temperatura do kit cairá significativamente durante esta transferência. Pode ser benéfico devolver o kit à almofada de aquecimento infravermelho de biofeedback ou fornecer calor suplementar adicional.
4. Monitore visualmente continuamente e registre a temperatura retal, leituras do oxímetro de pulso, frequência cardíaca e frequência respiratória a cada 10-15 minutos.
5. Quando o animal estiver consistentemente ambulatorial e alerta, remova o cateter intravenoso e aplique pressão no local até que o sangramento pare.

8. Cuidados e monitoramento pós-operatório

1. Retorne o kit para a barragem e mate os companheiros de ninhada. Certifique-se de que o material de nidificação e a nutrição suplementar (Tabela de Materiais) estejam disponíveis na gaiola para ajudar na termorregulação e recuperação.
2. Verifique o kit diariamente por 7 a 10 dias após a cirurgia, pesando diariamente e fornecendo nutrição suplementar na gaiola.
3. Nos primeiros 2 dias após a recuperação (D1 e D2), administre analgésicos adicionais a cada 24 h (carprofeno 4 mg/kg SQ - diluído a 5 mg/mL) e fluidos subcutâneos (5-7 mL).
4. Nos primeiros 3 dias após a recuperação (D1, D2 e D3), verifique o kit duas vezes ao dia, avaliando evidências de dor, deambulação, aparência incisional e hidratação. Uma vez por dia durante esse período, meça a temperatura do kit para garantir que não haja evidência de infecção e termorregulação adequada.
5. Remova as suturas se as incisões cicatrizarem adequadamente em 7 a 10 dias.

Resultados

O resultado bem-sucedido deste projeto exigiu o desenvolvimento de múltiplos parâmetros no procedimento de implante e no protocolo de registro. A cirurgia de implante foi tentada ou realizada em 16 kits de coelhos, com 14 sobrevivendo com sucesso ao procedimento. Destes, 12 sobreviveram até o desfecho experimental. Os motivos para óbito intra ou pós-operatório são destacados na Tabela 1, juntamente com as modificações do procedimento que permitiram o sucesso fut...

Discussão

O protocolo descrito para indução, monitoramento e suporte anestésico equilibra as necessidades de pesquisa para abordagem cirúrgica e facilidade com os padrões ouro de cuidados veterinários. Antes de o laboratório adotar o protocolo descrito como procedimento padrão, vários outros refinamentos potenciais foram testados, incluindo a colocação de implantes subcutâneos dorsais, o uso de um tubo endotraqueal ou máscara laríngea e o uso de um estetoscópio esofágico para monit...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 inch elastic wrap - Coban or Vetwrap	3M	https://www.3m.com/3M/en_US/p/d/b00003186/
4-0 PDS monofilament suture	Ethicon	https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
5-0 Ethilon nylon suture	Ethicon	https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
Acquisition computer	Dell	https://www.dell.com/en-us
Adhesive surgical towels	N/A	N/A
Anesthesia circuit - Jackson-Reevs with 0.5 L rebreathing bag	JorVet	J0248GA
Betadine scrub	N/A	N/A
Bupivicaine (0.5%)	N/A	N/A	Diluted to 2.5 mg/mL prior to administration
Buprenorphine (0.3 mg/mL)	N/A	N/A	Diluted to 0.03 mg/mL prior to administration
Burr - 1.00 mm	Cell Point Scientific	60-1000	to drill skull
Cafazolin (1 g lypholized)	N/A	N/A	Diluted to 50 mg/mL
Carprofen (50 mg/mL)	MWI Veterinary		Diluted to 25 mg/mL prior to administration
Cotton tipped applicators	N/A	N/A
Custom 3-D printed face mask	N/A	https://www.thingiverse.com/thing:923725
Dental acrylic	N/A	N/A
Diet Gel Criticare	Clear H2O	72-05-5042	Nutritional support
Dopper Gel - Aquasonic	Patterson	07-890-5542
Doppler - Vet-Dop2	Patterson	07-888-8986
Doxapram (20 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	For holding screws
Duraprep	3M	8630	Final skin prep
ecgAuto data analysis software	emka technologies	N/A
Epinephrine (1:1000)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Gauze	N/A	N/A
Glucometer ipet Pro	MWI Veterinary	63867	Monitor if poor recovery
Glycopyrrolate (0.2 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A	Emergency only
Gram scale	N/A	N/A
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12	Hold wire loops while tying the loop in place
Ideal Micro-drill	Cell Point Scientific	67-1204	To drill skull
Incubator	DRE-veterinary (Infantia - NB1)	N/A
Induction box	VetEquip	941444
Infared heating pad - RightTemp Jr	Kent Scientific Corporation	RT-0502
IOX2 data acquisition software	emka technologies	N/A
IV Catheter - Covidein Monoject 26 G, 3/4 inch PTFE	Patterson	07-836-8494
ketamine (100 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A
Medical tape	N/A	N/A
Narrow Pattern Forceps - Straight/12 cm	Fine Science Tools	11002-12
Neonatal stethescope	Ultrascope	N/A
Olsen-Hegar Needle holder with scissors - 12 cm	Fine Science Tools	12002-12	For suturing
Ophthalmic ointment Puralube	MWI Veterinary	N/A	Administered to both eyes during anesthesia
Opthalmic Lubricant - Paralube Vet	Patterson	07-888-2572
Pulse oximeter (AccuWave Portable )	Patterson	07-892-9128	For prep and recovery; reads HR up to 400
Pulse oximeter (SDI - Vet/Ox plus 4700)	Heska	N/A	Intra-operative; no longer producted
Receiver	emka technologies	N/A	1 receiver for every 4 telemetry implants
Rectal thermometer	N/A	N/A
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14002-12	To cut drape
Screw driver - 1.0 mm	N/A	N/A	From mini-screwdriver set for electronics
Screws 00-96 x 3/32 (2.4 mm)	Protech International	8L0X3905202F
Sevoflurane	MWI Veterinary		Maintenance anesthesia
Sevoflurane vaporizer and anesthesia machine	N/A	N/A
Skin glue, Gluture	MWI Veterinary	34207	Apply sparingly with syringe
Small scissors	Fine Science Tools	14084-08
Sterile aluminum foil	N/A	N/A	To wrap wires prior to rotating animal
Sterile paint brush	N/A	N/A	To apply dental acrylic
Sterile Saline	N/A	N/A
Sterile surgical gloves	N/A	N/A
Sterile ultrasound cover	N/A	N/A	To cover the drill
Sterile Water	N/A	N/A	For cefazolin reconstitution
Surgical blade no. 15	N/A	N/A
Surgical drape	N/A	N/A
Surgical gown	N/A	N/A
Swivel connector - Jorgensen Labs	Patterson	07-802-2349	To connect anesthesia circuit to face mask
Telemetry implant	emka technologies	easyTEL+_M1_EETA_B_35
Trocar	SAI	TRO-10-6	To tunnel wires