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* Estos autores han contribuido por igual
Los mecanismos de muerte súbita inesperada en la epilepsia (SUDEP) son poco conocidos y difíciles de traducir de los modelos actuales. Los conejos transgénicos pueden ofrecer información sobre estos mecanismos. Describimos un método para el registro continuo de electroencefalografías y electrocardiografías a largo plazo en cachorros de conejos transgénicos para evaluar eventos graves que pueden llevar a la muerte.
Las variantes patogénicas en los genes de los canales iónicos se asocian con una alta tasa de muerte súbita inesperada en la epilepsia (SUDEP). Los mecanismos de SUDEP son poco conocidos, pero pueden implicar disfunción autonómica y arritmias cardíacas, además de convulsiones. Algunos genes de canales iónicos se expresan tanto en el cerebro como en el corazón, lo que puede aumentar el riesgo de SUDEP en pacientes con canalopatías iónicas asociadas con epilepsia y arritmias cardíacas. Los conejos transgénicos que expresan variantes de epilepsia proporcionan un organismo completo para estudiar la compleja fisiología del SUDEP. Es importante destacar que los conejos replican más de cerca la fisiología cardíaca humana que los modelos de ratón. Sin embargo, los modelos de conejos tienen consideraciones adicionales de salud y anestesia cuando se someten a procedimientos de monitoreo invasivos. Hemos desarrollado un método novedoso para implantar quirúrgicamente un dispositivo de telemetría para la monitorización simultánea a largo plazo de electroencefalograma (EEG) y electrocardiograma (ECG) en cachorros de conejos neonatos. Aquí, demostramos métodos quirúrgicos para implantar un dispositivo de telemetría en kits P14 (rango de peso 175-250 g) con una atención detallada al abordaje quirúrgico, la anestesia y el seguimiento adecuados, y los cuidados postoperatorios, lo que resulta en una baja tasa de complicaciones. Este método permite la monitorización continua de la electrofisiología neural y cardíaca durante los puntos críticos en el desarrollo de arritmias cardíacas, convulsiones y posibles SUDEP en modelos de conejos de epilepsias genéticas o adquiridas.
La muerte súbita inesperada en epilepsia (SUDEP) es una de las principales causas de muerte en pacientes con epilepsia. Los mecanismos del SUDEP son poco conocidos, pero potencialmente involucran disfunción autonómica, apnea y arritmias cardíacas, además de convulsiones 1,2,3,4,5,6,7. Los pacientes con epilepsias genéticas ligadas a la canalopatía se encuentran entre las tasas más altas de SUDEP. Por ejemplo, el SUDEP se presenta hasta en el 20% de los pacientes con variantes en el gen del canal de sodio dependiente de voltaje SCN1A8, el gen responsable del síndrome de Dravet, una epilepsia genética que comienza en el primer año de vida. Muchos genes de los canales iónicos relacionados con la epilepsia se expresan tanto en el cerebro como en el corazón, y los datos clínicos y de laboratorio sugieren que las arritmias cardíacas pueden estar presentes en pacientes con epilepsias genéticas relacionadas con la canalopatía7, 9,10,11,12, lo que podría aumentar su riesgo de SUDEP debido a una arritmia cardíaca mortal inducida por convulsiones o a la aparición simultánea de convulsiones y arritmias. La evaluación de SUDEP en el entorno de laboratorio plantea numerosos desafíos. Desde un punto de vista cardíaco, los potenciales de acción cardíaca en ratones son muy diferentes a los de los humanos13, y los modelos de miocitos cardíacos iPSC humanos14 no pueden replicar las complejidades de todo el organismo. Los modelos transgénicos de epilepsias genéticas de conejo proporcionan un sistema ideal para estudiar el SUDEP, ya que la fisiología cardíaca del conejo se asemeja más a la del ser humano13,15, al tiempo que proporciona un organismo completo para estudiar la fisiopatología compleja. Dado que el SUDEP puede ocurrir tan pronto como en la primera convulsión, la evaluación de estos modelos animales desde un punto de tiempo temprano es esencial para comprender el inicio de las convulsiones y las arritmias cardíacas. La grabación de video durante el período neonatal es un desafío, ya que los cachorros de conejo a menudo todavía están en el nido. El registro continuo de electroencefalograma (EEG) o electrocardiograma (ECG) con un sistema cableado tradicional no es posible mientras los kits están con la presa. Es poco probable que el registro intermitente capture eventos terminales raros asociados con SUDEP. Por lo tanto, hemos recurrido a la monitorización inalámbrica de telemetría implantable para proporcionar un registro de EEG y ECG simultáneo, continuo y a largo plazo en kits de conejos.
Las claves del éxito de este protocolo son la adecuada anestesia y el apoyo postoperatorio para estos animales vulnerables. Los conejos tienen un riesgo mucho mayor de muerte anestésica (1,39%-4,8%) en comparación con los perros y gatos (0,17%-0,24%) debido a las características anatómicas y fisiológicas únicas16,17. Los principales contribuyentes a este mayor riesgo anestésico incluyen el manejo subóptimo de las vías respiratorias y las complicaciones postoperatorias agudas. Múltiples factores contribuyen a la dificultad de la intubación en conejos, incluyendo una boca larga y estrecha con una lengua ancha, un ángulo agudo entre la boca y la laringe, el desplazamiento dorsal de la epiglotis, el aumento de la susceptibilidad al trauma laríngeo y el aumento de la propensión al laringoespasmo 18,19,20. Después del episodio anestésico inmediato, los conejos corren el riesgo de desarrollar el síndrome de estasis gastrointestinal potencialmente mortal. Este es un problema complejo y multifactorial, y se postula que la anestesia contribuye a través de los efectos directos de los medicamentos que inhiben la motilidad gástrica y/o la anorexia secundaria después del procedimiento por cualquier motivo (dolor no aliviado, náuseas, etc.)Artículo 21.
La fisiología única de los conejos recién nacidos y las crías agrava los desafíos asociados con la anestesia y la cirugía. Los conejos tienen crías altriciales nacidas con mecanismos poco desarrollados para la homeostasis fisiológica y consideraciones anatómicas especiales. El acceso intravenoso y el monitoreo son difíciles ya que la mayoría de los productos comerciales no están optimizados para el pequeño tamaño vascular, la alta frecuencia cardíaca en reposo y la piel pigmentada de los cachorros de conejo cruzado de Nueva Zelanda y cinturón holandés. Dado que el gasto cardíaco depende esencialmente de la frecuencia cardíaca en los neonatos22 y, en general, el aclaramiento del fármaco por vía renal o hepática está disminuido en comparación con los adultos23, es fundamental tener en cuenta la selección y la dosis adecuadas del fármaco. Se cree que la causa principal de la muerte anestésica en los conejos es secundaria a la depresión respiratoria y la apnea. Además de los problemas de manejo de las vías respiratorias ya discutidos para todos los conejos, los neonatos tienen un impulso respiratorio deprimido frente a la hipoxemia y la hipercapnia, lo que hace que este aspecto de la anestesia, ya de por sí desafiante, sea más riesgoso24.
En este protocolo, describimos un método exitoso para el implante de telemetría EEG y ECG (Figura 1) en un modelo neonatal de conejo con epilepsia con una alta tasa de supervivencia quirúrgica y anestésica. Esta información permitirá a otros investigadores abordar modelos desafiantes de conejos neonatos para avanzar en la investigación sobre la epilepsia, la arritmia cardíaca y los trastornos del neurodesarrollo relacionados.
Todo el trabajo descrito fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan como parte de un protocolo de uso de animales aprobado y está en línea con las leyes y pautas federales relevantes, incluida la Ley de Bienestar Animal del USDA y la Política del Servicio de Salud Pública de los NIH. La Universidad de Michigan es una institución acreditada por AAALACi.
1. Preparación animal
2. Preparación quirúrgica (Figura 2)
3. Colocación del implante en el abdomen
4. Colocación de las derivaciones de ECG
5. Preparación de la superficie dorsal
6. Colocación de electrodos electroencefalograma
7. Recuperación de la anestesia
8. Cuidados y seguimiento postoperatorio
El resultado exitoso de este proyecto requirió el desarrollo de múltiples parámetros en el procedimiento de implante y el protocolo de registro. La cirugía de implante se intentó o se realizó en 16 cachorros de conejo, y 14 sobrevivieron con éxito al procedimiento. De ellos, 12 sobrevivieron hasta el criterio de valoración experimental. En la Tabla 1 se destacan las causas de muerte intraoperatoria o posoperatoria, junto con las modificaciones del procedimiento q...
El protocolo descrito para la inducción, el monitoreo y el apoyo anestésico equilibra las necesidades de investigación para el abordaje quirúrgico y la facilidad con los estándares de oro de la atención veterinaria. Antes de que el laboratorio adoptara el protocolo descrito como procedimiento estándar, se probaron otros posibles refinamientos, incluida la colocación de un implante subcutáneo dorsal, el uso de un tubo endotraqueal o una máscara laríngea para la vía aérea, y e...
Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores están agradecidos por la financiación de los NIH R61NS130070 a LLI.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 inch elastic wrap - Coban or Vetwrap | 3M | https://www.3m.com/3M/en_US/p/d/b00003186/ | |
4-0 PDS monofilament suture | Ethicon | https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products | |
5-0 Ethilon nylon suture | Ethicon | https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products | |
Acquisition computer | Dell | https://www.dell.com/en-us | |
Adhesive surgical towels | N/A | N/A | |
Anesthesia circuit - Jackson-Reevs with 0.5 L rebreathing bag | JorVet | J0248GA | |
Betadine scrub | N/A | N/A | |
Bupivicaine (0.5%) | N/A | N/A | Diluted to 2.5 mg/mL prior to administration |
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | N/A | N/A | Diluted to 0.03 mg/mL prior to administration |
Burr - 1.00 mm | Cell Point Scientific | 60-1000 | to drill skull |
Cafazolin (1 g lypholized) | N/A | N/A | Diluted to 50 mg/mL |
Carprofen (50 mg/mL) | MWI Veterinary | Diluted to 25 mg/mL prior to administration | |
Cotton tipped applicators | N/A | N/A | |
Custom 3-D printed face mask | N/A | https://www.thingiverse.com/thing:923725 | |
Dental acrylic | N/A | N/A | |
Diet Gel Criticare | Clear H2O | 72-05-5042 | Nutritional support |
Dopper Gel - Aquasonic | Patterson | 07-890-5542 | |
Doppler - Vet-Dop2 | Patterson | 07-888-8986 | |
Doxapram (20 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For holding screws |
Duraprep | 3M | 8630 | Final skin prep |
ecgAuto data analysis software | emka technologies | N/A | |
Epinephrine (1:1000) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Gauze | N/A | N/A | |
Glucometer ipet Pro | MWI Veterinary | 63867 | Monitor if poor recovery |
Glycopyrrolate (0.2 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | Emergency only |
Gram scale | N/A | N/A | |
Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | Hold wire loops while tying the loop in place |
Ideal Micro-drill | Cell Point Scientific | 67-1204 | To drill skull |
Incubator | DRE-veterinary (Infantia - NB1) | N/A | |
Induction box | VetEquip | 941444 | |
Infared heating pad - RightTemp Jr | Kent Scientific Corporation | RT-0502 | |
IOX2 data acquisition software | emka technologies | N/A | |
IV Catheter - Covidein Monoject 26 G, 3/4 inch PTFE | Patterson | 07-836-8494 | |
ketamine (100 mg/mL) | MWI Veterinary | N/A | |
Medical tape | N/A | N/A | |
Narrow Pattern Forceps - Straight/12 cm | Fine Science Tools | 11002-12 | |
Neonatal stethescope | Ultrascope | N/A | |
Olsen-Hegar Needle holder with scissors - 12 cm | Fine Science Tools | 12002-12 | For suturing |
Ophthalmic ointment Puralube | MWI Veterinary | N/A | Administered to both eyes during anesthesia |
Opthalmic Lubricant - Paralube Vet | Patterson | 07-888-2572 | |
Pulse oximeter (AccuWave Portable ) | Patterson | 07-892-9128 | For prep and recovery; reads HR up to 400 |
Pulse oximeter (SDI - Vet/Ox plus 4700) | Heska | N/A | Intra-operative; no longer producted |
Receiver | emka technologies | N/A | 1 receiver for every 4 telemetry implants |
Rectal thermometer | N/A | N/A | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | To cut drape |
Screw driver - 1.0 mm | N/A | N/A | From mini-screwdriver set for electronics |
Screws 00-96 x 3/32 (2.4 mm) | Protech International | 8L0X3905202F | |
Sevoflurane | MWI Veterinary | Maintenance anesthesia | |
Sevoflurane vaporizer and anesthesia machine | N/A | N/A | |
Skin glue, Gluture | MWI Veterinary | 34207 | Apply sparingly with syringe |
Small scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Sterile aluminum foil | N/A | N/A | To wrap wires prior to rotating animal |
Sterile paint brush | N/A | N/A | To apply dental acrylic |
Sterile Saline | N/A | N/A | |
Sterile surgical gloves | N/A | N/A | |
Sterile ultrasound cover | N/A | N/A | To cover the drill |
Sterile Water | N/A | N/A | For cefazolin reconstitution |
Surgical blade no. 15 | N/A | N/A | |
Surgical drape | N/A | N/A | |
Surgical gown | N/A | N/A | |
Swivel connector - Jorgensen Labs | Patterson | 07-802-2349 | To connect anesthesia circuit to face mask |
Telemetry implant | emka technologies | easyTEL+_M1_EETA_B_35 | |
Trocar | SAI | TRO-10-6 | To tunnel wires |
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