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摘要

可溶性基底膜提取物是癌症研究中使用最广泛的生物基质，但其复杂的流变行为使其难以使用市售生物打印系统进行生物打印。这项工作提出了一种定制的生物打印策略，以在单层和多层中产生具有良好形状保真度的纯基质结构。

摘要

在转化研究中，3D 体外 模型对于推进科学理解和治疗开发至关重要。为此，源自小鼠肉瘤细胞的可溶性基底膜提取物 （SBMes） 在复制 体内 微环境的机械和生化特征方面发挥着关键作用。它们在从组织工程到药物测试的各种研究领域中特别有价值。特别是，它们已成为癌症研究的基础，因为该领域广泛使用的传统 2D 细胞培养物无法捕获三维 （3D） 结构和肿瘤微环境，因此可以提供误导性信息。

在癌症研究中，有效的 3D 体外 模型对于更好地了解癌症演变和预测挑战（例如耐药机制）至关重要。类器官已成为有前途的 3D 体外 模型，可以更准确地表示肿瘤生物学。它们在 SBM 中生长，因为它们创造了一个细胞可以生长并自组织成 3D 结构的环境。然而，SBMe 带来了重大挑战，包括低机械性能和复杂的流变行为，阻碍了它与市售气动挤出生物打印系统的使用。

为了解决这些限制，我们开发了一种低成本、体积受控的生物打印系统和一种使用 SBMe 打印结构的特定方案。该系统基于体积式挤出机，克服了传统气动驱动方法的局限性。使用特定的 g 代码进行组装和编程后，系统可以生物打印纯和稀释的 SBMe，以获得单层和多层构建体。这种方法为生成 3D 细胞培养模型提供了一种更可靠和可扩展的方法，为更有效地研究新疗法和药物测试铺平了道路。

引言

在转化研究中，创建紧密复制体内环境的 3D 体外模型对于促进科学理解和治疗开发至关重要1。构建它们的一个关键组成部分是使用细胞外基质 （ECM） 类似物，例如可溶性基底膜提取物 （SBM），它更好地反映了天然组织的复杂性。SBM 在从组织工程到药物检测的各种研究领域中特别有价值 2,3。特别是，它们已成为癌症研究的基础，因为它们复制了肿瘤微环境的机械和生化特征，从而能够开发出更能反映肿瘤生长、转移和治疗反应的模型。

事实上，尽管在过去几十年中取得了长足的进步，但许多疗法仍然失败，导致临床环境中的治疗经常失败。这种失败通常归因于高水平的细胞异质性引起的耐药机制 4,5。有效的体外模型能够准确概括人类肿瘤的复杂性，对于更好地了解癌症演变和预测这种现象至关重要。

传统的 2D 细胞培养一直是癌症研究的基础，但由于它们无法捕获实际肿瘤的 3D 结构和微环境，因此可能导致有关药物疗效和肿瘤行为的误导性信息 6,7,8。相比之下，3D 体外模型已成为有前途的替代方案，通过模拟 3D 复杂性提供更准确的肿瘤微环境和生物行为表示 9,10。

在癌症研究中，类器官被广泛用作研究疾病和药物疗效的 3D 模型，因为它们提供了更准确和相关的人体组织和器官模型。来源于 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤细胞的 SBMe 的使用在推进癌症研究方面发挥着关键作用11,12。它提供了一种凝胶状基质，细胞可以在其中生长、增殖和自组织成类器官结构，确保正常发育和生长13,14。

然而，由于其独特而复杂的特性，SBMe 带来了许多挑战。作为一种非牛顿流体，SBMe 具有剪切稀化特性，这意味着其粘度随着剪切应力的增加而降低，使其在可变力下的处理和应用不一致。此外，它的触变行为增加了复杂性，因为当去除剪切应力时，它可以随着时间的推移恢复其粘度15,16。这些特性，再加上低机械强度（储能模量值范围为 10 Pa 至 5,000 Pa，具体取决于蛋白质浓度）和热敏性，加剧了这些挑战，需要在制备和使用过程中进行细致的控制，以及对其进行纯生物打印。

标准气动驱动生物打印系统无法正确控制 SBMe 分配，因为压力的应用会导致其从注射器中弹出后出现无法控制的行为。它受到类似于聚合物熔体描述的“喷出”效应“的现象的影响，其中流速突然增加到某个临界压力值以上 17,18,19。正如我们之前的工作16 中报告的那样，体积控制分配策略允许将 SBMe 挤出与分配器中产生的压力解耦，这取决于基质的流变特性、工作条件和喷嘴几何形状。近年来，市场上已经进行了多次尝试来利用相同的原理，其中康宁的 Matribot 引领了这一潮流。由于温度条件受控，它允许处理和沉积 SBMe 和其他温度敏感的生物墨水。但是，它可能很昂贵，限制了小型实验室的可访问性。

在我们之前的论文中，我们提出了一种低成本的定制替代方案——体积驱动的生物打印系统16。此版本基于改进的入门级 3D 打印机，带有定制的 3D 打印挤出机。尽管它在生物打印中有效，但它在打印可重复性方面存在一些限制。它源自入门级 3D 打印机，在 Z 轴运动和自动归位方面存在一些问题。为了满足这些需求，我们开发了定制低成本体积分配系统的高级版本，以及使用 SBMe 的生物打印结构的特定方案。

在这里，我们提供了构建和使用该系统的协议。它由一个定制的体积控制挤出机（基于我们之前的研究16）、一个生物打印机案例和一个控制系统组成。每个模块都进行生产和组装。当使用特定的 gcode 文件进行组装和编程时，按照基质处理的方案描述，该系统能够使用 SBMe 生物打印纯或稀释的构建体，在单层和多层中均具有良好的形状保真度。

研究方案

1. 3D 体积式生物打印机的打印和组装

  1. 准备并 3D 打印生物打印机组件。
    1. 下载 *.补充 文件 1 中的 STL 设计文件。
    2. 负荷*。STL 文件，用于定义印版上工件的方向以及 3D 打印机所需的所有选项。使用聚乳酸 （PLA） 打印工件，并提供中等质量选项（0.4 mm 喷嘴尺寸、1.75 mm 耗材直径、220 °C 挤出机温度、50 °C 打印底板温度、0.2 mm 层高、300 mm/s 打印速度）。
      注意：中等质量选项可能因用于打印作品的打印机而异。
    3. 从 3D 打印机床上拆下打印件。移除打印的支撑结构（如果有），并在需要时抛光表面。
  2. 组装挤出机（图 1）。
    1. 将两个线性滚珠轴承 （LM4UU） 插入推杆块的垂直孔中。将丝杠螺母 T8 插入后中央孔中，并用四个螺钉 （M3x10） 固定。
    2. 将刚性联轴器连接到步进电机上，然后使用四个螺钉 （M3x6） 将其固定到挤出机电机外壳上。
      注意： 根据挤出机电机外壳上的凹槽确定步进电机的方向，以便正确定位电缆插孔。
    3. 使用先前插入的刚性联轴器，将步骤 1.2.2 中组装的步进电机固定到 T8 丝杠 （150 mm） 上。确保每个块都用固定螺钉正确固定。
    4. 用两个螺钉 （M4x8） 将一个自调心法兰轴承（内径 8 mm）连接到挤出机底座的底部。
    5. 将两个滚珠轴承 （4 x 9 x 4 mm） 插入挤出机底座顶部的特定孔中，将另外两个插入下部的孔中。
    6. 将组装好的零件（步骤 1.2.1）通过结构上部的空腔插入挤出机底座。用两根 4 毫米的杆连接四个滚珠轴承（步骤 1.2.5），每侧一根。让杆穿过步骤 1.2.1 中组装零件中的两个直线滚珠轴承。
      注意：也可以先将杆插入上部两个滚珠轴承上，然后将它们放入挤出机底座中，直到它们到达底部滚珠轴承，并且所有东西都固定在规定的槽中。
    7. 将步骤 1.2.3 中组装好的零件插入挤出机底座的中心孔中。旋转导螺杆以穿过导螺杆螺母并到达自对准法兰轴承。使用组件中的固定螺钉锁定丝杠，使用两个螺钉 （M3x8） 将挤出机电机外壳固定在挤出机底座的顶部。
    8. 使用另外两个螺钉 （M3x40） 和 M3 螺母将点胶针筒法兰固定器连接到挤出机底座的底部，以锁定点胶筒筒法兰（插入方向从上到下）。使用另外两个螺钉 （M3x30） 和 M3 螺母将注射器活塞固定器连接到推杆块的上孔（插入方向从下到上）以锁定柱塞法兰。
    9. 将两个螺钉 （M4x80） 插入两个弹簧中，让它们穿过挤出机底座和注射器块底部的孔。拧下螺母，为注射器留出空间，以避免注射器块滑落。
      注意： 螺丝必须从后向前移动。
  3. 组装 X 轴（图 2）。
    1. 将四个直线滚珠轴承 （LM8UU x 24 mm） 插入X_Left_Block，并在上孔和下孔中X_Right_Block零件，每个孔两个。用螺钉 （M2x10） 将两个皮带块连接在 X 右和 X 左块的顶部，为皮带留出空间。
    2. 将两个滚珠轴承 （5 x 16 x 5 mm） 插入X_Right_Block的中心孔中，每侧一个。将滑轮（孔径 5 mm）放入X_Right_Block的内腔中，然后用 5 mm 的杆（35 mm 长）连接两个滚珠轴承，使其穿过滑轮。
      注意： 使用较长的杆使组件具有更好的处理效果。将碎片定位到位后，切割所需长度的杆。
    3. 用两个螺钉 （M3x8） 将限位开关连接到X_motor_housing。将 NEMA 17 电机插入电机外壳，并使用四颗螺丝 （M3x8） 将X_block_1盖固定到电机外壳和电机上。
    4. 将滑轮（孔径 5 mm）连接到电机上并用固定螺钉锁定，然后用四个螺钉 （M5x8） 将步骤 1.3.3 中的组装部件拧在一起以X_block_1。还要用两个螺钉 （M3x8） 在 X_Left_Block 底部连接一个限位开关。
      注意： 步骤 1.3.2 和 1.3.4 中皮带轮的外径必须相同。
    5. 将两个线性滚珠轴承 （LM8UU x 45 mm） 放入X_slider顶部和底部的孔中。
    6. 用两根 8 mm 的杆（200 mm 长）连接步骤 1.3.2 和 1.3.4 中的组装零件，让它们穿过步骤 1.3.5 中的组装零件。
      注意： 组装前剪下所需长度的杆。
    7. 使用皮带块和两个螺钉 （M2x8） 将皮带的一端锁定到X_slider_belt_connection。将皮带绕着组装零件 1.3.4 中的皮带轮运行，然后绕组装零件 1.3.2 中的皮带轮运行，并使用第二个皮带块和另外两个螺钉 （M2x8） 将皮带的另一端固定到X_slider_belt连接处。确保皮带适当拧紧以获得正确的运动。
      注意： 在此步骤中，X_slider必须向 X 轴结构的一端移动，以避免干涉。
    8. 用一个螺钉 （M6x20） 将X_slider_belt_connection拧到X_slider上。
    9. 将挤出机连接到X_slider并用四个螺钉 （M5x10） 固定。
  4. 组装 Y 轴（图 3）。
    1. 使用四个螺钉 （M3x10） 和四个螺母将固定支架放在向上的后部生物打印机部件上。
      注意： 可以调整固定支架的位置以获得皮带的适当张力并允许插入步进电机。
    2. 将步进电机插入固定支架，并用四个螺钉 （M3x8） 拧紧。接下来，在曲轴上放置一个皮带轮（孔径 5 毫米）并用固定螺钉固定。
      注意： 在将电机放入固定支架之前，可以将皮带轮连接到曲轴上，以避免组件之间的一些干扰。
    3. 在前 8 毫米杆上找到两个滑轮（8 毫米内径），并将它们锁定在两个杆上（距离末端 2.5 厘米）。对后杆重复此作，并在距离右端 5 cm 处添加另一个滑轮。
    4. 将 12 个自调心法兰轴承（直径 8 毫米）连接到生物打印机的内上部。
    5. 使用步骤 1.4.3 中组装好的杆连接两个前部生物打印机部件和两个后部生物打印机部件（左/右方向），并将它们锁定到自调心法兰轴承（直径 8 毫米）上。用螺钉 （M3x8） 将两个组装部件固定在所有连接处。
      注意： 放置后杆时，放置一条封闭的皮带，将步进电机上的皮带轮与杆上的内皮带轮连接起来。
      注意： 拧紧螺母，固定步进电机，确保电机不移动，皮带有适当的张力。
    6. 在步骤 1.4.5 中使用四根 8 毫米的杆连接两个组装部件。让杆穿过组装部件 1.3 中的直线球轴承，并将它们锁定到自调心法兰轴承（直径 8 mm）上。用螺钉 （M3x8） 将两个组装部件固定在所有连接处。
    7. 使用皮带块将开口的皮带端固定在X_block_1的上部，然后对X_block_2重复此作。将皮带绕着左侧的后滑轮走，然后绕着前滑轮走，然后用另一个皮带块将皮带的另一端再次固定到X_block_1上。对第二条传送带重复此作。
      注意： 必须正确收紧皮带以获得正确的运动，并保持相同的长度，以避免 Y 轴运动中的弯曲或干扰。
  5. 组装 Z 轴（图 4）。
    1. 将底部生物打印机外壳部件 （M4x8） 拧在一起。
    2. 在步骤 1.5.2 中，将一个自调心法兰轴承（直径 8 mm）连接到组装零件底部的地板上。
    3. 用螺钉 （M3x8） 将两个法兰直线球轴承 （LMH8UU） 固定到Z_slider的外部孔中，将一个丝杠螺母固定在中心孔中。
    4. 用两个螺钉 （M3x8） 将限位开关固定在Z_plane左侧。
    5. 将步进电机固定在刚性联轴器上。用四个螺钉 （M3x20） 将步进电机连接到Z_block上，并将一根螺纹杆连接到刚性联轴器上。确保每个块都用固定螺钉正确固定。
    6. 使用两根 8 毫米杆将步骤 1.5.5 中的组装部件连接到生物打印机底座。让它们穿过步骤 1.5.3 中的组装零件。
    7. 使用两颗螺钉 （M5x8） 将Z_block固定到后面板上。
    8. 使用四颗螺钉 （M3x25） 将Z_plane连接到 Z_slider。将它们从上到下插入Z_plane孔中，将弹簧穿过Z_plane和Z_slider之间，并用螺母固定。调整弹簧张力以调平平面。
    9. 在特定腔体中的生物打印机结构下安装四个可调节的支脚。通过调整支脚来调平生物打印机。
    10. 在步骤 1.4.6 中，用 8 个螺钉 （M4x12） 将组装的零件连接到组装的零件。
    11. 用螺钉 （M2x8） 在结构正面的特定位置连接两个铰链，在右侧部分的相对位置连接一个磁铁。将整体结构拧到 2 毫米透明有机玻璃板上以关闭开口。
      注意： 将前有机玻璃面板拧到铰链上，然后放入另一个与磁铁对应的螺钉以获得前门。
  6. 显示组件（图 5A）。
    1. 让连接到显示器的电线穿过底部孔，并使用四颗螺钉 （M3x3） 将显示器连接到显示器外壳。
      注意：此段落需要在没有 LCD 旋钮盖的情况下完成。它可以位于连接到显示器外壳后的预装旋钮上。
    2. 使用四颗螺钉 （M2x6） 关闭带有盖子的外壳。
    3. 将 SD 卡插入左侧插槽。
    4. 让电线穿过结构顶部的孔。用两个螺钉 （M3x8） 将组装好的部件拧到生物打印机的顶部。
      注意： 所有电线（电机、限位开关和显示器）都将靠近墙壁并从左下角的孔中引出。它们用电缆夹固定，以避免与机械部件发生干扰。
  7. 电子元件组装（图 5B）
    1. 用两颗螺丝 （M3x10） 将插座固定到电子外壳的外部。
    2. 用四颗螺丝 （M3x10） 将主板连接到电子外壳的内部。
    3. 用四颗螺丝 （M3x8） 将电源的底部连接到电子外壳的内部。
    4. 将电线穿过盖子上的圆孔，然后将它们连接到主板。使用四颗螺钉 （M3x10） 关闭电子外壳及其盖子。
      注意：可以将电子外壳连接到生物打印机结构上，或者在工作空间狭小的情况下将其留在桌面上。
      图 6 显示了所有电子电缆连接。根据使用的 3D 打印机主板，它们可能略有不同。

2. 软件设置和 gcode 生成过程

  1. 准备切片软件设置
    1. 打开切片软件。
      注意： 说明可能因所使用的软件或版本而异。
    2. 登录平台。
    3. 前往 个人设置 选项。选择打印机，然后选择 Add a non networked printer（添加非联网打印机）。选择自定义 FFF 打印机，然后在 打印机名称框中键入打印机的名称。单击 Add（添加）。
      注意：如果是第一次安装软件，则 Add printer （添加打印机） 面板 将在登录后自动打开。
    4. 在 机器设置 窗口中，将默认设置 x、y、z 更改为 176、120、45 毫米。
    5. 如果尚未取消选择 Heated bed 选项，请取消选择该选项。
    6. 将补充文件 2 中标题为“JoVE_Starting_G-code.txt”和“JoVE_Ending_G-code.txt”的文件中列出的文本行插入到“起始 g 代码”和“结束 g 代码”面板中。
      1. 根据要应用的流速，修改起始 g 代码文件中“M92 E150”行中的值 150。使用以下公式估计适当的值：
        figure-protocol-5780
        其中 Q 是所需的流速 [μL/min]。
        注意：该公式是用所描述的系统实验获得的。如果机械或电气组件发生变化，情况可能会有所不同。一种可能的替代方法是根据正在使用的系统固定该值，并创建自定义 MATLAB 代码以生成所需的 gcode 文件。
    7. 将 Extruder 1 面板中的 Compatible material diameter 值更改为 1,75，然后关闭。
    8. 转到 Marketplace，选择 Z 偏移设置 插件并安装它。在该过程结束时，重新启动软件以完成。重新打开后，选择 设置 |打印机 |管理打印机 。在 “首选项 ”窗口中，单击 “设置 ”并通过选择“ 选中所有 选项”来激活所有选项并关闭它。
    9. 通过单击舞台菜单中的 Print Settings（第三个按钮）来配置设置，该菜单包含配置面板。在配置面板的当前打印配置文件中输入填充百分比。选择 Custom 按钮以修改当前打印设置和配置文件 Fine 在下拉菜单中。将打印速度设置为 10 mm/s。
  2. gcode 准备
    1. 下载 *.STL 设计文件，标题为“JoVE_Square”，来自本文 的补充文件 2 。
    2. 负荷。STL 文件导入到切片软件中。
    3. 在平面上找到工件，并移动到坐标 65， 42.5， 0 （X， Y， Z） mm。通过单击创建两个副本 。STL 文件名，然后选择 multiply selected 选项。将它们移动到以下坐标：16、42.5、0 mm 和 -33、42.5、0 mm（X、Y、Z）。
      注意：除非直接在最终的 gcode 文件中手动修改，否则无法自动定义打印顺序。坐标是为 6 多孔板定义的。
    4. 转到舞台菜单中的 Print Settings。在 Walls （墙） 部分中，将 0 作为 Wall line count （墙线计数）。将 0 作为 Top/Bottom 部分中的 Top/Bottom 厚度值。在“填充”面板中，插入以下值：填充图案：网格，填充线距离：5 mm，填充线方向：[0]。
      注意： 可以在打印速度部分降低行进速度，以提高 X 轴精度。
    5. 在 Travel （行程） 部分中禁用缩回，并在 Cooling （冷却） 部分中打印冷却。
    6. 在 Build Plate Adhesion 部分中，选择 None 作为 Build Plate Adhesion Type，而在 Special Modes 部分中，选择 One at time 选项作为 Print Sequence 。
    7. 单击 Slice 按钮生成 g 代码。
    8. 使用记事本应用程序打开 g 代码文件，并删除第 12 行中的“M104 S200”、“M105”和“M109 S200”等行“;使用 Cura_SteamEngine 4.9.0 生成”。
    9. 在以下行 “;网格：JoVE_Square_rev。STL（6）“，然后将下一个一分为二：（1） G0 F3600 X142.46 Y7.499 和 （2） G1 Z0.3。
      注意：X 和 Y 坐标只是示例。
    10. 将 Z 值 修改为 Z25 在 “;TIME_ELAPSED“注释每首作品的每一层指令。
      注意：对于仅打印单件，不需要步骤 2.3.10。

3. 溶胀/降解测试

  1. 准备步骤
    1. 取一个无菌的 1 mL 玻璃注射器（TLL 终端）和一个无菌的 25 G 锥形喷嘴。将它们组装起来，然后将组装好的注射器放入冰箱中。
    2. 在实验前一天，将移液器吸头和 SBMe 基质样品瓶放入冰箱中过夜。
    3. 打印三个 PLA 网格 （Φ = 20 mm），圆孔尺寸为 1 mm x 1 mm，侧面垂直柱用于抓取它们。
  2. 打印结构
    1. 从冰箱中取出组装好的注射器和 SBMe 基质样品瓶。吸出 500 μL SBMe 基质，并将其放入培养箱中 15 分钟以使其凝胶化。
    2. 从培养箱中取出注射器并将其放入生物打印机打印头中。确保注射器柱塞与推杆块正确接触。
    3. 用注射器活塞固定器固定注射器固定柱塞和注射器针筒法兰，并用注射器夹固定注射器针筒。
    4. 使用生物打印机菜单中的 Auto-home 设置校准系统，以自动检测轴的原点。
    5. 使用命令 Move Axes 移动挤出机，直到针尖接触 PLA 网格以手动定义 Z0。
    6. 通过在生物打印机菜单中选择要打印的 g 代码文件开始打印。
    7. 将多孔板放入培养箱中 2 分钟，让 SBMe 在挤出后沉淀下来。
    8. 取多孔板，将 2 mL 细胞培养基放入含有生物打印网格的三个孔中。将多孔板放入培养箱中。
    9. 在每个时间点（t0、1 小时、2 小时、3 小时、4 小时、1、3、7、10 和 14 天），从板中取出每个网格并用干净的纸干燥，以去除天平上多余的培养基和重量。将网格放回板中，然后放入培养箱中继续实验。使用以下公式估计膨胀率和降解速率：
      figure-protocol-9123
      其中 Wt 是每个时间点构建体的重量，Wt0 是干燥构建体的重量。
      figure-protocol-9277
      其中 Wi 是溶胀试验结束时的重量。

4. SBMe 构建体的生物打印

  1. 准备步骤
    1. 取一个无菌的 1 mL 玻璃注射器（TLL 终端）和一个无菌的 25 G 锥形喷嘴，将它们组装在生物安全柜下。将它们放入冰箱中的无菌盒中。
    2. 实验前一天，将移液器吸头和 SBMe 基质小瓶放入冰箱中过夜（4 °C 冰上）。
    3. 向 1.5 mL 离心管中加入 20 μL 台盼蓝。
    4. 将离心机设置为 345 × g，4 °C，并让它冷却（~3-4 h）。
    5. 将 5 mL 水倒入 15 mL 离心管中，作为离心机的天平。
    6. 在水浴中加热磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 和培养基。
      注：细胞培养基由补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、青霉素-链霉素和 L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改性 Eagle 培养基 （DMEM） 制成。
    7. 将生物打印机放在生物安全柜下。在紫外线下消毒 20 分钟。
      注意： 为确保生物打印机正常运行，请执行自动归位功能并验证每个轴的正确移动和限位开关的工作。
  2. 生物墨水制备
    1. 将培养瓶放入含有商业小鼠前列腺癌细胞的培养箱中，将其置于生物安全柜下。
    2. 从培养瓶中取出细胞培养基。
      注：本方案中报告的体积适用于 T25 细胞培养瓶。
    3. 用 2 mL PBS 洗涤细胞一次，然后吸出。
    4. 加入 500 μL 胰蛋白酶，将培养瓶放入培养箱中 5 分钟，使细胞从培养板中分离。
    5. 检查细胞是否胰蛋白酶消化，如有必要，轻轻敲击培养瓶底部。
    6. 向培养瓶中加入 4.5 mL 培养基。仔细清洗板，确保所有分离的细胞都漂浮在细胞培养基中。
    7. 吸出培养基并将其添加到 15 mL 离心管中。
    8. 取 20 μL 等分试样，与台盼蓝等分试样混合。然后，将 10 μL 这种混合物放入细胞计数室中，使用以下公式对活细胞进行计数：
      figure-protocol-10410
      其中 f 是台盼蓝悬浮液的稀释因子（1：1 比例）;V 是细胞悬液体积 [mL]。
    9. 将剩余的细胞悬液离心 5 分钟（345 × g，4 °C）。
    10. 去除上清液，以所需的细胞密度 （10 6个细胞/ mL） 重悬到冷的 SBMe 基质中
    11. 用冷注射器吸出 800 μL 含有细胞的基质悬液。
    12. 去除可能滞留在注射器中的气泡，并将其放入无菌盒中。然后，将其放入培养箱中 15 分钟以使其凝胶化。
  3. 生物打印工艺
    1. 从培养箱中取出注射器，然后将其放入生物打印机打印头中。确保注射器柱塞与推杆块正确接触。
      注意：型号和体积必须与用于实验的注射器相同。
    2. 用注射器活塞固定器固定注射器固定柱塞和注射器针筒法兰，并用注射器夹固定注射器针筒。
    3. 使用挤出机底部的 M4 螺母调整弹簧压力并将注射器锁定到位。
      注意：步骤 4.3.1 至 4.3.4 如图 7 所示。
    4. 使用生物打印机菜单中的 Auto-home 设置校准系统，以自动检测轴的原点。
      注意：本文始终确保正确的初始设置，而与我们用于打印的支撑类型无关。
    5. 将 6 孔板放在打印平面上。
    6. 使用命令移动 轴 移动挤出机，直到针尖接触孔底部以手动定义 Z0。
    7. 在 bioprinter 菜单的菜单选项中选择 gcode 文件并开始打印。每个孔中将打印一个方形的六层网格（边 2.6 厘米）。
    8. 生物打印过程后，使用倒置显微镜确保打印过程成功，并将多孔板放入培养箱中 2 分钟，让 SBMe 在挤出后沉淀下来。
    9. 向每个孔中加入 2 mL 细胞培养基。
      注意：体积必须完全覆盖构建体。

结果

在本文中，我们提出了一种使用低成本、定制的体积生物打印机由 SBMe 制成的生物打印构建体的方案。我们提供详细的描述和 3D 打印 *。STL 文件来构建系统，我们通过打印单层和多层结构来展示其在癌症研究中的潜在用途。在组装之前，每个 3D 打印组件都已正确清除支撑结构或不需要的打印残留物。 图 8 显示了整个组件的不同视图。有两种不同的...

讨论

在转化研究中，SBM 在从组织工程到药物测试的各种研究领域中特别有价值 2,3。特别是，它们已成为癌症研究的基础，因为它们复制了肿瘤微环境的机械和生化特征，从而能够开发出更能反映肿瘤生长、转移和治疗反应的模型。SBMe 是使用最广泛的生物基质，尤其是 3D 类器官13,14。作?...

披露声明

作者没有需要声明的利益冲突。

致谢

这项工作部分由加速器奖 A26815 资助，题为：“临床中的单细胞癌症进化”，由英国癌症研究中心和 Fondazione AIRC（编号 22790）和欧盟 - 下一代欧盟，任务 4，第 1 部分，CUP D53D23003310006 合作资助。

材料

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Ball bearing 5 mmXiKe625-2RSDimensions 5 x 16 x 5 mm
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Belt openFajoedahttps://www.amazon.it/gp/product/
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Bioprinting nozzleFisher Scientific17780789Corning Standard Conical Bioprinting Nozzles
Bürker Cell Counting chamberGLASWARENFABRIK KARL HECHT40443001
CentrifugeEppendorf5702 R
Centrifuge tubeSigma-AldrichCLS43147015 mL
Centrifuge tubeSigma-AldrichEP00301200861.5 mL
DisplaySigma-AldrichBR718905
DMEM Gibco Thermofisher11965092
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Glass syringeFisher Scientific11520062Hamilton GasTight 1 mL (TLL terminal)
HingesYASQZhttps://www.amazon.it/gp/product/
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IncubatorFisher Scientific15481374Eppendorf Galaxy 48 R CO2 Incubator, 48 L, Stainless Steel
Inverted microscopeNikonEclipse Ti2-U
Jumper wiresIverntechhttps://www.amazon.it/Iverntech-XH2
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LCD unitParadisetronic.comhttps://www.amazon.it/Display-controller
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printer%2Bprusa%2Bi3%2Cindustrial%
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Leadscrew nut M8Comiokehttps://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4?
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Leadscrew nut T8Aipaidehttps://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref
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Leadscrew T8VBESTLIFEhttps://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref
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L-GlutammineSigma-AldrichG7513
Limit switchCESFONJERhttps://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref
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Linear ball bearing (LM4UU)A ABSOPROhttps://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1		Dimensions 4 x 8 x 12 mm
Linear ball bearing (LM8LUU)Fdithttps://www.amazon.it/LM8LUU-Linear
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Linear ball bearing (LM8UU)ARCELIhttps://www.amazon.it/gp/product/
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search_asin_title?ie=UTF8&psc=1		Dimensions 8 x 15 x 24 mm
MagnetsOCEUMAOAhttps://www.amazon.it/gp/product/
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search_asin_title?ie=UTF8&th=1		8 x 3 mm
MatrigelGibco ThermofisherLOT 0202003SBMe
Motor driver Longrunerhttps://www.amazon.it/gp/product/
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_asin_title?ie=UTF8&psc=1		Driver A4988
PBSMicroGem, VWRTL1006-500ML
Penicillin-StreptomycinGibco Thermofisher15070063
Pipette tipsSigma-AldrichZ740058BRAND filter tips, racked, TipBox (volume 50-1000 μL)
Plexiglass sheetsMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti-
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Plexiglass sheetsMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
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Pulley 8 mmYxtaiihttps://www.amazon.it/gp/product/
B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8&th=1		Bore 8 mm, Width belt space 6 mm
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