Projeto e validação de uma bioimpressora de extrusão volumétrica para bioimpressão de extrato de membrana basal solúvel para pesquisa translacional

Resumo

Os extratos de membrana basal solúvel são as matrizes biológicas mais amplamente utilizadas na pesquisa do câncer, mas seu comportamento reológico complexo dificulta sua bioimpressão com sistemas de bioimpressão disponíveis comercialmente. Este trabalho apresenta uma estratégia de bioimpressão customizada para produzir construções matriciais puras com boa fidelidade de forma em camadas únicas e múltiplas.

Resumo

Na pesquisa translacional, os modelos 3D in vitro são essenciais para o avanço da compreensão científica e do desenvolvimento terapêutico. Para este objetivo, os Extratos de Membrana Basal Solúvel (SBMes), derivados de células de sarcoma de camundongo, desempenham o papel fundamental de replicar características mecânicas e bioquímicas do microambiente in vivo . Eles são particularmente valiosos em uma variedade de campos de pesquisa, desde engenharia de tecidos até testes de drogas. Em particular, eles se tornaram fundamentais na pesquisa do câncer, pois as culturas de células 2D tradicionais, amplamente utilizadas no campo, podem fornecer informações enganosas, uma vez que não capturam a estrutura tridimensional (3D) e o microambiente tumoral.

Na pesquisa do câncer, modelos 3D in vitro eficazes são cruciais para entender melhor a evolução do câncer e antecipar desafios, como mecanismos de resistência a medicamentos. Os organoides surgiram como modelos 3D in vitro promissores, oferecendo uma representação mais precisa da biologia do tumor. Eles crescem em SBMes à medida que criam um ambiente onde as células podem crescer e se auto-organizar em estruturas 3D. No entanto, o SBMe apresenta desafios significativos, incluindo baixas propriedades mecânicas e comportamento reológico complexo, impedindo seu uso com sistemas de bioimpressão por extrusão pneumática disponíveis comercialmente.

Para suprir essas limitações, desenvolvemos um sistema de bioimpressão volumétrico controlado de baixo custo e um protocolo específico para impressão de estruturas com SBMe. Este sistema é baseado em uma extrusora volumétrica e supera as limitações das abordagens tradicionais de acionamento pneumático. Uma vez montado e programado com um código g específico, o sistema pode bioimprimir SBMe puro e diluído para obter construções de camada única e multicamadas. Essa abordagem oferece um método mais confiável e escalável para produzir modelos de cultura de células 3D, abrindo caminho para pesquisas mais eficazes em novos tratamentos e testes de medicamentos.

Introdução

Na pesquisa translacional, a criação de modelos 3D in vitro que reproduzam de perto o ambiente in vivo é essencial para o avanço da compreensão científica e do desenvolvimento terapêutico¹. Um componente-chave na construção deles é o uso de análogos de matriz extracelular (ECM), como extratos de membrana basal solúvel (SBMes), que refletem melhor as complexidades dos tecidos naturais. Os SBMes são particularmente valiosos em uma variedade de campos de pesquisa, desde engenharia de tecidos até testes de drogas ^2,3. Em particular, eles se tornaram fundamentais na pesquisa do câncer, pois replicam características mecânicas e bioquímicas do microambiente tumoral, permitindo o desenvolvimento de modelos que refletem melhor o crescimento do tumor, metástase e respostas ao tratamento.

De fato, apesar dos avanços consideráveis nas últimas décadas, muitas terapias continuam a falhar, levando a falhas frequentes no tratamento em ambientes clínicos. Essa falha é frequentemente atribuída a mecanismos de resistência a drogas causados por altos níveis de heterogeneidade celular ^4,5. Modelos in vitro eficazes, capazes de recapitular com precisão as complexidades dos tumores humanos, são cruciais para entender melhor a evolução do câncer e antecipar esse fenômeno.

As culturas de células 2D tradicionais têm sido fundamentais na pesquisa do câncer, mas podem levar a informações enganosas sobre a eficácia do medicamento e o comportamento do tumor, pois não conseguem capturar a estrutura 3D e o microambiente dos tumores reais ^6,7,8. Em contraste, os modelos 3D in vitro surgiram como alternativas promissoras, oferecendo uma representação mais precisa do microambiente tumoral e do comportamento biológico, imitando a complexidade 3D ^9,10.

Na pesquisa do câncer, os organoides são amplamente utilizados como modelos 3D para estudar a eficácia de doenças e medicamentos, pois fornecem modelos mais precisos e relevantes de tecidos e órgãos humanos. O uso de SBMe, derivado de células de sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm, tem sido fundamental no avanço da pesquisa do câncer^11,12. Ele fornece um substrato semelhante a um gel no qual as células podem crescer, proliferar e se auto-organizar em estruturas organoides, garantindo o desenvolvimento e o crescimento adequados^13,14.

No entanto, o SBMe apresenta uma série de desafios devido às suas características únicas e complexas. Como um fluido não newtoniano, o SBMe exibe propriedades de afinamento por cisalhamento, o que significa que sua viscosidade diminui com o aumento da tensão de cisalhamento, tornando seu manuseio e aplicação inconsistentes sob forças variáveis. Além disso, seu comportamento tixotrópico aumenta a complexidade, pois pode recuperar sua viscosidade ao longo do tempo quando a tensão de cisalhamento é removida^15,16. Essas propriedades, juntamente com a baixa resistência mecânica (com valores de módulo de armazenamento variando de 10 Pa a 5.000 Pa, dependendo da concentração de proteína) e o comportamento termossensível, agravam esses desafios, exigindo controle meticuloso durante a preparação e uso, bem como bioimpressão pura.

Os sistemas de bioimpressão pneumáticos padrão não controlam adequadamente a distribuição de SBMe, pois a aplicação de pressão causa um comportamento incontrolável após sua ejeção da seringa. É afetado por um fenômeno semelhante ao "efeito de surto" descrito para fundidos poliméricos, no qual a vazão aumenta abruptamente acima de um determinado valor de pressão crítica 17,18,19. Conforme relatado em nosso trabalho anterior¹⁶, a estratégia de dispensação de controle volumétrico permite desacoplar a extrusão de SBMe da pressão gerada no dispensador, que depende das propriedades reológicas da matriz, das condições de trabalho e da geometria do bico. Nos últimos anos, várias tentativas foram feitas no mercado para explorar o mesmo princípio, com o Matribot da Corning liderando o caminho. Permite o manuseio e a deposição de SBMe e outras biotintas sensíveis à temperatura graças às condições de temperatura controlada. No entanto, pode ser caro, limitando a acessibilidade para laboratórios menores.

Em nosso artigo anterior, apresentamos uma alternativa personalizada de baixo custo - um sistema de bioimpressão volumétrico¹⁶. Esta versão foi baseada em uma impressora 3D de nível básico modificada com uma extrusora impressa em 3D personalizada. Apesar de sua eficácia na bioimpressão, apresentou algumas limitações na repetibilidade da impressão. Sendo derivado de uma impressora 3D de nível básico, ele teve alguns problemas com os movimentos Z e auto-homing. Para atender a essas necessidades, desenvolvemos uma versão avançada de nosso sistema de dosagem volumétrica personalizado de baixo custo e um protocolo específico para estruturas de bioimpressão usando SBMe.

Aqui, fornecemos protocolos para a construção e uso deste sistema. É composto por uma extrusora controlada volumétrica personalizada, com base em nosso estudo anterior¹⁶, um caso de bioimpressora e um sistema de controle. A produção e a montagem são feitas para cada módulo. Quando montado e programado com um arquivo gcode específico, seguindo a descrição do protocolo para manuseio da matriz, o sistema é capaz de bioimprimir construções puras ou diluídas usando o SBMe com boa fidelidade de forma em camadas simples e múltiplas.

Protocolo

1. 3D impressão e montagem de bioimpressora volumétrica

1. Prepare e imprima em 3D os componentes da bioimpressora.
   1. Baixe o *. Arquivos de design STL do Arquivo Suplementar 1.
   2. Carga*. STL no software proprietário de fatiamento para definir a orientação das peças na chapa de impressão e todas as opções necessárias para a impressora 3D. Imprima as peças usando ácido polilático (PLA) com opções de qualidade média (tamanho do bico de 0,4 mm, diâmetro do filamento de 1,75 mm, temperatura da extrusora de 220 °C, temperatura da placa da mesa de impressão de 50 °C, altura da camada de 0,2 mm, velocidade de impressão de 300 mm/s).
      NOTA: As opções de qualidade média podem diferir de acordo com a impressora usada para imprimir as peças.
   3. Retire as peças impressas da base da impressora 3D. Remova as estruturas de suporte impressas, se houver, e polir as superfícies quando necessário.
2. Monte a extrusora (Figura 1).
   1. Insira dois rolamentos lineares de esferas (LM4UU) nos orifícios verticais do bloco empurrador. Insira também uma porca de parafuso de avanço T8 no orifício central traseiro e prenda-a com quatro parafusos (M3x10).
   2. Conecte um acoplamento de eixo rígido ao motor de passo e, em seguida, prenda-o à carcaça do motor da extrusora usando quatro parafusos (M3x6).
      NOTA: Oriente o motor de passo de acordo com a ranhura na carcaça do motor da extrusora para permitir o posicionamento adequado do conector para cabos.
   3. Fixe o motor de passo, montado na etapa 1.2.2, a um parafuso de avanço T8 (150 mm) usando o acoplamento de eixo rígido inserido anteriormente. Certifique-se de que cada bloco esteja devidamente preso com os parafusos de fixação.
   4. Fixe um rolamento de flange autocompensador (8 mm de diâmetro interno) na parte inferior da base da extrusora com dois parafusos (M4x8).
   5. Insira dois rolamentos de esferas (4 x 9 x 4 mm) nos orifícios específicos na parte superior da base da extrusora e os outros dois nos orifícios na seção inferior.
   6. Insira a peça montada (etapa 1.2.1) na base da extrusora através da cavidade na parte superior da estrutura. Conecte os quatro rolamentos de esferas (passo 1.2.5) com duas hastes de 4 mm, uma para cada lado. Deixe as hastes passarem pelos dois rolamentos lineares de esferas na peça montada na etapa 1.2.1.
      NOTA: Também é possível inserir primeiro as barras nos dois rolamentos de esferas superiores e depois colocá-las na base da extrusora até que atinjam o rolamento de esferas inferior e tudo esteja preso nas ranhuras definidas.
   7. Insira a peça montada na etapa 1.2.3 no orifício central da base da extrusora. Gire o parafuso de avanço para passar a porca do parafuso de avanço e alcançar o rolamento de flange autocompensador. Use os parafusos de fixação no componente para travar o parafuso de avanço e dois parafusos (M3x8) para prender a carcaça do motor da extrusora na parte superior da base da extrusora.
   8. Use dois outros parafusos (M3x40) e porcas M3 para prender o retentor do flange do cilindro da seringa na parte inferior da base da extrusora, para travar o flange do cilindro da seringa (insira a direção de cima para baixo). Use dois outros parafusos (M3x30) e porcas M3 para prender o retentor do pistão da seringa aos orifícios superiores do bloco empurrador (insira a direção de baixo para cima) para travar o flange do êmbolo.
   9. Insira dois parafusos (M4x80) em duas molas e deixe-os passar pelos orifícios presentes na parte inferior da base da extrusora e do bloco da seringa. Aperte as porcas deixando espaço para a seringa para evitar que o bloco da seringa escorregue.
      NOTA: Os parafusos devem ir de trás para a frente.
3. Monte o eixo X (Figura 2).
   1. Insira quatro rolamentos lineares de esferas (LM8UU x 24 mm) no X_Left_Block e X_Right_Block peças nos orifícios superior e inferior, dois para cada. Prenda também dois blocos de cinto em cima dos blocos X direito e X esquerdo com parafusos (M2x10) deixando espaço para o cinto.
   2. Insira dois rolamentos de esferas (5 x 16 x 5 mm) nos orifícios centrais de X_Right_Block, um de cada lado. Coloque uma polia (Furo 5 mm) na cavidade interna de X_Right_Block e conecte os dois rolamentos de esferas com uma haste de 5 mm (35 mm de comprimento), deixando-a passar pela polia.
      NOTA: Use uma haste mais longa para o conjunto para ter um melhor manuseio. Depois de posicionar as peças no lugar, corte a haste do comprimento desejado.
   3. Fixe um interruptor de limite ao X_motor_housing com dois parafusos (M3x8). Insira o motor NEMA 17 na carcaça do motor e use quatro parafusos (M3x8) para fixar a tampa do X_block_1 na carcaça do motor e no motor.
   4. Fixe uma polia (Furo 5 mm) ao motor e trave-a com parafusos de fixação e, em seguida, aparafuse a peça montada na etapa 1.3.3 para X_block_1 com quatro parafusos (M5x8). Fixe também um interruptor de limite na parte inferior do X_Left_Block com dois parafusos (M3x8).
      NOTA: O diâmetro externo das polias nas etapas 1.3.2 e 1.3.4 deve ser o mesmo.
   5. Coloque dois rolamentos lineares de esferas (LM8UU x 45 mm) nos orifícios na parte superior e inferior do X_slider.
   6. Conecte as peças montadas nas etapas 1.3.2 e 1.3.4 com duas hastes de 8 mm (200 mm de comprimento) e deixe-as passar pela peça montada na etapa 1.3.5.
      NOTA: Corte as hastes do comprimento desejado antes de montar.
   7. Trave uma extremidade da correia na X_slider_belt_connection usando o bloco da correia e dois parafusos (M2x8). Passe a correia ao redor da polia na peça montada 1.3.4, depois ao redor da polia na peça montada 1.3.2 e fixe a outra extremidade da correia na conexão X_slider_belt usando o segundo bloco da correia e dois outros parafusos (M2x8). Certifique-se de que o cinto esteja bem apertado para obter o movimento correto.
      NOTA: Durante esta etapa, o X_slider deve ser movido em direção a uma extremidade da estrutura do eixo X para evitar interferência.
   8. Aparafuse o X_slider_belt_connection ao X_slider com um parafuso (M6x20).
   9. Conecte a extrusora ao X_slider e fixe-a com quatro parafusos (M5x10).
4. Monte o eixo Y (Figura 3).
   1. Coloque o suporte de fixação na parte traseira da bioimpressora usando quatro parafusos (M3x10) e quatro porcas.
      NOTA: A posição do suporte de fixação pode ser adaptada para obter a tensão adequada da correia e permitir a inserção do motor de passo.
   2. Insira o motor de passo no suporte de fixação e aperte-o com quatro parafusos (M3x8). Em seguida, coloque uma polia (furo de 5 mm) no virabrequim e fixe-a com parafusos de fixação.
      NOTA: A polia pode ser fixada ao virabrequim antes de colocar o motor no suporte de fixação para evitar alguma interferência entre os componentes.
   3. Localize duas polias (8 mm de diâmetro interno) na haste frontal de 8 mm e trave-as nas duas hastes (2.5 cm de distância da extremidade). Repita esta operação para a haste traseira e adicione outra polia, a 5 cm de distância da extremidade direita.
   4. Conecte 12 rolamentos de flange autocompensadores (8 mm de diâmetro) nas partes superiores internas da bioimpressora.
   5. Conecte as duas peças frontais da bioimpressora e as duas partes traseiras da bioimpressora (direção esquerda/direita) usando as hastes montadas na etapa 1.4.3 e trave-as nos rolamentos de flange autocompensadores (8 mm de diâmetro). Prenda as duas peças montadas em todas as junções com parafusos (M3x8).
      NOTA: Ao posicionar a haste traseira, coloque uma correia fechada que conecte a polia do motor de passo com a polia interna da haste.
      NOTA: Prenda o motor de passo apertando as porcas para garantir que não haja movimento do motor e tensão adequada da correia.
   6. Conecte as duas peças montadas na etapa 1.4.5 usando quatro hastes de 8 mm. Deixe as hastes passarem pelos rolamentos lineares de esferas presentes na parte montada 1.3 e trave-as nos rolamentos de flange autocompensadores (8 mm de diâmetro). Prenda as duas peças montadas em todas as junções com parafusos (M3x8).
   7. Fixe uma extremidade da correia aberta na parte superior da X_block_1 usando o bloco da correia e repita esta operação para o X_block_2. Passe a correia ao redor das polias traseiras à esquerda, depois ao redor da polia dianteira e fixe a outra extremidade da correia novamente na X_block_1 com outro bloco de correia. Repita esta operação para a segunda correia.
      NOTA: As correias devem ser devidamente apertadas para obter o movimento correto e do mesmo comprimento para evitar flexão ou interferência nos movimentos em Y.
5. Monte o eixo Z (Figura 4).
   1. Aparafuse as peças inferiores da caixa da bioimpressora (M4x8).
   2. Fixe um rolamento de flange autocompensador (8 mm de diâmetro) ao piso da parte inferior da peça montada na etapa 1.5.2.
   3. Fixe dois rolamentos lineares de esferas flangeados (LMH8UU) nos orifícios externos presentes no Z_slider e uma porca de parafuso de avanço no orifício central com parafusos (M3x8).
   4. Fixe um interruptor de limite no lado esquerdo Z_plane com dois parafusos (M3x8).
   5. Prenda o motor de passo a um acoplamento de eixo rígido. Conecte um motor de passo ao Z_block com quatro parafusos (M3x20) e uma haste rosqueada ao acoplamento do eixo rígido. Certifique-se de que cada bloco esteja devidamente preso com os parafusos de fixação.
   6. Conecte a peça montada na etapa 1.5.5 à base da bioimpressora usando duas hastes de 8 mm. Deixe-os passar pela parte montada na etapa 1.5.3.
   7. Fixe o Z_block no painel traseiro usando dois parafusos (M5x8).
   8. Conecte Z_plane a Z_slider usando quatro parafusos (M3x25). Insira-os nos orifícios Z_plane de cima para baixo, passe a mola entre Z_plane e Z_slider e prenda-os com porcas. Ajuste a tensão da mola para nivelar o plano.
   9. Prenda quatro pés ajustáveis sob a estrutura da bioimpressora na cavidade específica. Nivele a bioimpressora ajustando os pés.
   10. Conecte a peça montada à peça montada na etapa 1.4.6 com oito parafusos (M4x12).
   11. Prenda duas dobradiças na frente da estrutura nos locais específicos e um ímã na parte direita no ponto relativo com parafusos (M2x8). Aparafuse a estrutura geral em folhas de plexiglass transparentes de 2 mm para fechar as aberturas.
       NOTA: Aparafuse o painel frontal de plexiglass nas dobradiças e coloque outro parafuso em correspondência com o ímã para obter uma porta frontal.
6. Exiba a montagem (Figura 5A).
   1. Deixe os fios, conectados ao monitor, passarem pelo orifício inferior e prenda o monitor ao invólucro do monitor com quatro parafusos (M3x3).
      NOTA: Esta passagem precisa ser feita sem a tampa do botão LCD. Ele pode estar localizado no botão pré-instalado após a fixação na caixa da tela.
   2. Feche a caixa com a tampa usando quatro parafusos (M2x6).
   3. Insira o cartão SD no slot esquerdo.
   4. Deixe os fios passarem pelo orifício no topo da estrutura. Aparafuse a peça montada na parte superior da bioimpressora com dois parafusos (M3x8).
      NOTA: Todos os fios (motores, interruptores de limite e display) passarão perto da parede e sairão pelo orifício inferior esquerdo. Eles são fixados com clipes de cabo para evitar interferência com as partes mecânicas.
7. Montagem eletrônica (Figura 5B)
   1. Fixe o soquete na parte externa da caixa eletrônica com dois parafusos (M3x10).
   2. Prenda a placa-mãe na parte interna do gabinete eletrônico com quatro parafusos (M3x10).
   3. Conecte a parte inferior da fonte de alimentação à parte interna da caixa eletrônica com quatro parafusos (M3x8).
   4. Passe os fios pelo orifício circular na tampa e conecte-os à placa-mãe. Feche a caixa eletrônica com sua tampa usando quatro parafusos (M3x10).
      NOTA: É possível conectar o estojo eletrônico à estrutura da bioimpressora ou deixá-lo na mesa no caso de pequenos espaços de trabalho.
      A Figura 6 mostra todas as conexões de cabos eletrônicos. Eles podem ser ligeiramente diferentes de acordo com a placa-mãe da impressora 3D em uso.

2. Configuração de software e processo de geração de gcode

1. Preparação das configurações do software de fatiamento
   1. Abra o software de fatiamento.
      NOTA: As instruções podem diferir dependendo do software usado ou da versão.
   2. Faça login na plataforma.
   3. Vá para as opções de configurações . Selecione a impressora e, em seguida, Adicionar uma impressora sem rede. Selecione a impressora FFF personalizada e, na caixa Nome da impressora, digite o nome da impressora. Clique em Adicionar.
      NOTA: Se for a primeira instalação de software, o painel Adicionar impressora será aberto automaticamente após o login.
   4. Na janela Configurações da máquina , altere as configurações padrão x, y, z para 176, 120, 45 mm.
   5. Desmarque a opção Cama aquecida se ainda não estiver desmarcada.
   6. Insira nos painéis Código G inicial e Código g final As linhas de texto relatadas nos arquivos intitulados 'JoVE_Starting_G-code.txt' e 'JoVE_Ending_G-code.txt' no Arquivo Suplementar 2.
      1. Modificar o valor 150 na linha «M92 E150» no ficheiro de código g de partida de acordo com o caudal a aplicar. Estime o valor adequado usando a seguinte fórmula:
         
         Onde Q é a vazão desejada [μL/min].
         NOTA: Esta fórmula foi obtida experimentalmente com o sistema descrito. Pode ser diferente se houver alterações nos componentes mecânicos ou elétricos. Uma alternativa possível poderia ser corrigir o valor de acordo com o sistema em uso e criar um código MATLAB personalizado para gerar o arquivo gcode desejado.
   7. Altere o valor do diâmetro do material compatível no painel Extrusora 1 para 1,75 e, em seguida, feche.
   8. Vá para o Marketplace, selecione o plug-in Z Offset Setting e instale-o. No final do processo, reinicie o software para finalizar. Depois de reabrir, selecione Configurações | Impressora | Gerenciar impressoras na barra de ferramentas. Na janela Preferências , clique em Configurações e ative todas as opções selecionando a opção Verificar tudo e feche-a.
   9. Configure a configuração clicando em Configurações de impressão (terceiro botão) no menu do palco , que contém o painel de configuração . Insira a porcentagem de preenchimento no perfil de impressão atual no painel de configuração . Selecione o botão Personalizado para modificar as configurações de impressão atuais e o perfil Fino no menu suspenso. Defina a velocidade de impressão para 10 mm/s.
2. Preparação do GCode
   1. Baixe o *. Arquivo de design STL, intitulado 'JoVE_Square', do Arquivo Suplementar 2 deste artigo.
   2. Carga. STL no software de fatiamento.
   3. Localize a peça na superfície plana e vá para as coordenadas 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Crie duas cópias clicando no ícone . STL na lista de objetos e selecionando a opção multiplicar selecionados. Mova-os para as seguintes coordenadas: 16, 42,5, 0 mm e -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      NOTA: Não é possível definir automaticamente a ordem de impressão, a menos que seja modificado manualmente diretamente no arquivo gcode final. As coordenadas são definidas para uma placa de 6 multipoços.
   4. Vá para Configurações de impressão no menu do palco . Na seção Paredes , coloque 0 como Contagem de linhas de parede. Coloque 0 como valor de espessura superior/inferior na seção Superior/Inferior . No painel Preenchimento , insira os seguintes valores: Padrão de preenchimento: Grade, Distância da linha de preenchimento: 5 mm, Direções da linha de preenchimento: [0].
      NOTA: É possível reduzir a velocidade de deslocamento na seção Velocidade de impressão para melhorar a precisão do eixo X.
   5. Desative a retração na seção Viagem e imprima o resfriamento na seção Resfriamento .
   6. Na seção Adesão da placa de impressão , selecione Nenhum como o Tipo de adesão da placa de impressão, enquanto na seção Modos especiais , selecione a opção Um de cada vez como a Sequência de impressão.
   7. Clique no botão Slice para gerar o código g.
   8. Abra o arquivo de código g com o aplicativo Bloco de Notas e remova as linhas "M104 S200", "M105" e "M109 S200" na linha 12 após a frase "; Gerado com Cura_SteamEngine 4.9.0".
   9. Adicionar "G1 Z25" antes da linha seguinte"; MALHA: JoVE_Square_rev. STL(6)" e divida o próximo em dois: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 e (2) G1 Z0.3.
      NOTA: As coordenadas X e Y são apenas exemplos.
   10. Modifique o valor Z para Z25 em todas as linhas presentes após "; TIME_ELAPSED" comente cada instrução de camada de cada peça.
       NOTA: Para imprimir apenas uma única peça, a etapa 2.3.10 não é necessária.

3. Teste de inchaço/degradação

1. Etapas preparatórias
   1. Pegue uma seringa de vidro estéril de 1 mL (terminal TLL) e um bico cônico estéril de 25 G. Monte-os e coloque a seringa montada na geladeira.
   2. Coloque as pontas da pipeta e o frasco da matriz SBMe na geladeira durante a noite no dia anterior ao experimento.
   3. Imprima três grades de PLA (Φ = 20 mm) com tamanho de poro circular de 1 mm x 1 mm e um pilar vertical lateral para segurá-las.
2. Construções de impressão
   1. Retire a seringa montada e o frasco para injetáveis da matriz SBMe do frigorífico. Aspire 500 μL da matriz SBMe e coloque-a na incubadora por 15 min para permitir a gelificação.
   2. Retire a seringa da incubadora e coloque-a no cabeçote de impressão da bioimpressora. Certifique-se de que o êmbolo da seringa esteja devidamente em contato com o bloco empurrador.
   3. Prenda o êmbolo de fixação da seringa e o flange do cilindro da seringa com os retentores do pistão da seringa e o corpo da seringa com a seringa clamp.
   4. Calibre o sistema usando a configuração Auto-home no menu da bioimpressora para detectar automaticamente a origem dos eixos.
   5. Mova a extrusora usando o comando Move Axes até que a ponta da agulha toque a grade PLA para definir manualmente Z0.
   6. Comece a imprimir selecionando o arquivo de código g a ser impresso no menu da bioimpressora.
   7. Coloque a placa multipoços na incubadora por 2 min para permitir que o SBMe assente após a extrusão.
   8. Pegue a placa multipoços e coloque 2 mL de meio de cultura de células nos três poços contendo as grades bioimpressas. Coloque a placa multipoços na incubadora.
   9. Em cada ponto de tempo (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 e 14 dias), retire cada grade do prato e seque-a com papel limpo para remover o excesso de meio e peso em uma balança. Coloque a grade de volta na placa e depois na incubadora para continuar o experimento. Estime a taxa de inchaço e a taxa de degradação usando as seguintes fórmulas:
      
      Onde W_t é o peso das construções em cada ponto de tempo e W_t0 o peso das construções secas.
      
      Onde W_i é o peso no final do teste de inchaço.

4. Bioimpressão de construções SBMe

1. Etapas preparatórias
   1. Pegue uma seringa de vidro estéril de 1 mL (terminal TLL) e um bico cônico estéril de 25 G e monte-os sob o gabinete de biossegurança. Coloque-os em uma caixa estéril na geladeira.
   2. Coloque as pontas da pipeta e o frasco para injetáveis da matriz SBMe no frigorífico durante a noite (4 °C no gelo) no dia anterior à experiência.
   3. Adicione 20 μL de azul de tripano a um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
   4. Regular a centrifugadora a 345 × g, 4 °C e deixar arrefecer (~3-4 h).
   5. Leve 5 mL de água para um tubo de centrífuga de 15 mL como balança para a centrífuga.
   6. Solução tampão fosfato quente (PBS) e meio em banho-maria.
      NOTA: O meio de cultura celular é feito de meio de Eagle modificado com Dulbecco completo (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina e L-glutamina.
   7. Coloque a bioimpressora sob o gabinete de segurança biológica. Esterilize sob luz ultravioleta por 20 min.
      NOTA: Para garantir o bom funcionamento da bioimpressora, execute a função Auto-home e verifique os movimentos adequados de cada eixo e o funcionamento dos interruptores de limite.
2. Preparação de biotinta
   1. Pegue o frasco na incubadora contendo células comerciais de câncer de próstata murino e coloque-o sob o gabinete de biossegurança.
   2. Retirar o meio de cultura celular do balão.
      NOTA: Os volumes relatados neste protocolo se aplicam aos frascos de cultura de células T25.
   3. Lave as células uma vez com 2 mL de PBS e aspire-as.
   4. Adicione 500 μL de tripsina e coloque o frasco na incubadora por 5 min para permitir o descolamento celular da placa.
   5. Verifique as células quanto à tripsinização e, se necessário, bata suavemente no fundo do frasco.
   6. Adicionar 4,5 ml de meio ao balão. Lave cuidadosamente a placa para garantir que todas as células destacadas estejam flutuando no meio de cultura de células.
   7. Aspirar o meio e adicioná-lo a um tubo de centrífuga de 15 ml.
   8. Pegue uma alíquota de 20 μL e misture com a alíquota azul de tripano. Em seguida, coloque 10 μL dessa mistura na câmara de contagem de células para contar as células vivas usando a seguinte fórmula:
      
      Em que f é o factor de diluição para a suspensão de azul de tripano (proporção de 1:1); V é o volume de suspensão celular [mL].
   9. Centrifugar a suspensão de células restante durante 5 min (345 × g, 4 °C).
   10. Remova o sobrenadante e ressuspenda na matriz SBMe fria na densidade celular desejada (10⁶ células / mL)
   11. Aspirar 800 μL da suspensão da matriz contendo células com a seringa fria.
   12. Remova as bolhas de ar que possam estar presas na seringa e coloque-a em uma caixa estéril. Em seguida, coloque-o na incubadora por 15 min para permitir a gelificação.
3. Processo de bioimpressão
   1. Pegue a seringa da incubadora e coloque-a no cabeçote de impressão da bioimpressora. Certifique-se de que o êmbolo da seringa esteja devidamente em contato com o bloco empurrador.
      NOTA: O modelo e o volume devem ser iguais à seringa utilizada para o experimento.
   2. Prenda o êmbolo de fixação da seringa e o flange do cilindro da seringa com os retentores do pistão da seringa e o corpo da seringa com a seringa clamp.
   3. Use porcas M4 na parte inferior da extrusora para ajustar a pressão da mola e travar a seringa no lugar.
      NOTA: As etapas 4.3.1 a 4.3.4 são mostradas na Figura 7.
   4. Calibre o sistema usando a configuração Auto-home no menu da bioimpressora para detectar automaticamente a origem dos eixos.
      NOTA: Esta passagem sempre garante as configurações iniciais adequadas, independentemente do tipo de suporte que usamos para impressão.
   5. Coloque uma placa de 6 poços múltiplos no plano de impressão.
   6. Mova a extrusora usando o comando Move Axes até que a ponta da agulha toque o fundo do poço para definir manualmente Z0.
   7. Selecione o arquivo gcode na opção de menu do menu da bioimpressora e comece a imprimir. Uma grade quadrada de seis camadas (2,6 cm de lado) será impressa em cada poço.
   8. Após o processo de bioimpressão, use um microscópio invertido para garantir que o processo de impressão foi bem-sucedido e coloque a placa multipoços na incubadora por 2 min para permitir que o SBMe se estabilize após a extrusão.
   9. Coloque 2 mL de meio de cultura celular em cada poço.
      NOTA: O volume deve cobrir totalmente as construções.

Resultados

Neste artigo, apresentamos um protocolo para construções de bioimpressão feitas de SBMe usando uma bioimpressora volumétrica de baixo custo, feita sob medida. Fornecemos uma descrição detalhada e impressão 3D *. STL para construir o sistema e demonstramos seu uso potencial na pesquisa do câncer imprimindo estruturas de uma e várias camadas. Cada componente impresso em 3D foi devidamente limpo da estrutura de suporte ou resíduos de impressão indesejados antes da montagem.

Discussão

Na pesquisa translacional, os SBMes são particularmente valiosos em uma variedade de campos de pesquisa, desde engenharia de tecidos até testes de drogas ^2,3. Em particular, eles se tornaram fundamentais na pesquisa do câncer, pois replicam características mecânicas e bioquímicas do microambiente tumoral, permitindo o desenvolvimento de modelos que refletem melhor o crescimento do tumor, metástase e respostas ao tratamento...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-multiwell plate	Sigma-Aldrich	CLS351143
3D FDM printer	Flashforge	Adventurer 5M Pro
3D printer Motherboard	GEETECH	GT2560 REV A+
6-multiwell plate	Sigma-Aldrich	M8687
AC socket	HiLetgo	https://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket -Holder-Switch/dp/B0814PT3YG/ref=sr_1_1?__ mk_it_IT=%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=2TRIBP34VJ61A &dib=eyJ2IjoiMSJ9.zW6_VmeiudR I4yMpjJqJm7OdeoctTKW2mrEzml BAyJVa1hkM4PiJT3pLY0mXdxm1 AZQxa2_f5J4q4d5v3vUeqLkjJ6BM kWHAoeEfbEQJNuZaQ3NjmUlqWy _1AfQpnRp4VqJ2m3bkWsChztCa Ok-ZdQJlobGxJaMKg7WbV352 Hyo.0tEw2GYoPQJ4SdNYXO1XM Jrl2yXMvRey55Hj7GhISkk&dib_ tag=se&keywords=AC+socket+HiLetgo&nsdOpt OutParam=true&qid=1734702097&sprefix=ac+ socket+hiletgo%2Caps%2C173&sr=8-1	15 A 250 V
Adjustable feet	EXIN DEHCEN	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CPLTSNQB/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Height 27-40 mm
Ball bearing 4 mm	QUARKZMAN	684ZZ	Dimensions 4 x 9 x 4 mm
Ball bearing 5 mm	XiKe	625-2RS	Dimensions 5 x 16 x 5 mm
Belt closed	Turmberg3D	https://www.amazon.it/gp/product/ B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Width 6 mm
Belt open	Fajoeda	https://www.amazon.it/gp/product/ B09QCTVPTH/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Width 6 mm
Bioprinting nozzle	Fisher Scientific	17780789	Corning Standard Conical Bioprinting Nozzles
Bürker Cell Counting chamber	GLASWARENFABRIK KARL HECHT	40443001
Centrifuge	Eppendorf	5702 R
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	CLS431470	15 mL
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	EP0030120086	1.5 mL
Display	Sigma-Aldrich	BR718905
DMEM	Gibco Thermofisher	11965092
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Flanged linear ball bearing	Sourcing map	https://www.amazon.it/gp/product/ B07S6LZHM7/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	LMF8UU
Glass syringe	Fisher Scientific	11520062	Hamilton GasTight 1 mL (TLL terminal)
Hinges	YASQZ	https://www.amazon.it/gp/product/ B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Incubator	Fisher Scientific	15481374	Eppendorf Galaxy 48 R CO2 Incubator, 48 L, Stainless Steel
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti2-U
Jumper wires	Iverntech	https://www.amazon.it/Iverntech-XH2 -54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/ B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_ mcx_views_0_image?pd_rd_w=cb2r J&content-id=amzn1.sym.57a351cf- ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209%3 Aamzn1.symc.ca948091-a64d-450e- 86d7-c161ca33337b&pf_rd_p=57a3 51cf-ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209 &pf_rd_r=YHY9RFYZJK7PYAY2RXX D&pd_rd_wg=7WkXB&pd_rd_r=8239 66cb-4977-48ce-b095-0dcedf8c372f& pd_rd_i=B07Q12B6K5&th=1
LCD unit	Paradisetronic.com	https://www.amazon.it/Display-controller -conduttori-adattatore-stampante/dp/B01 DUR4064/ref=sr_1_9?__mk_it_IT=%C3 %85M%C3%85%C5%BD%C3%95%C3 %91&crid=1OAHVIIRA16X3&dib=eyJ2Ij oiMSJ9.07V2Jf7RzJjTUlIuFobUJFjUzG4 8633KkdcMXSEfnWLRX41d5vAF7xPBJ maniVxDoXecfihZzzOXlP3v-e29cUjoGLf GDyv5DoDVwp7ndohNTYvYzoi3gWkF- Hsd2YbT7tjb1Dra1afqSn26CbFdEvJ84y qyX7Gi3-7DHh8yMwdd6_7quiuW_mjsm w1nu0YQG68GZ0XM7unOsvyddQ__R_ 3dndxb3mOjgGjklEgu_KEbZJPOZDIdSo oU3nrrKHj56hCfk9ACwYpB80QGCbTPK 0p-fE0g9h02WPmtHV38UU3m5AdZsTQ HqvnVlJg703qGT-8ze8fQItw2rtbgl_J86H RMReJOhVLQBkqNwxh57CQ.yNbeFmZ ZBEUhadz2dQa8NxpZD9g4P6ighRU_97 yxgnw&dib_tag=se&keywords=display% 2B3D%2Bprinter%2Bprusa%2Bi3&nsdO ptOutParam=true&qid=1734714093&s= industrial&sprefix=display%2B3d%2B printer%2Bprusa%2Bi3%2Cindustrial% 2C143&sr=1-9&th=1	Old Prusa i3 LCD unit. Link to commercially available alternative
Leadscrew M8	RS PRO	280-408
Leadscrew nut M8	Comioke	https://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4? ref=ppx_yo2ov_dt_b_fed_asin_title&th=1	Nut for M8 screws
Leadscrew nut T8	Aipaide	https://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Nut for T8 screws
Leadscrew T8	VBESTLIFE	https://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Length 15 mm
L-Glutammine	Sigma-Aldrich	G7513
Limit switch	CESFONJER	https://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Linear ball bearing (LM4UU)	A ABSOPRO	https://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 4 x 8 x 12 mm
Linear ball bearing (LM8LUU)	Fdit	https://www.amazon.it/LM8LUU-Linear -Motion-cuscinetti-stampante/dp/B07N 58W3GZ/ref=sr_1_1_sspa?__mk_it_IT =%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=33VNCCCSIFJRP& dib=eyJ2IjoiMSJ9._JJ2doXI33C2JagX 8x6E2Bz2ILo10852tBi1erWqGn363ku zbcvknbMtsK6wm5jdR1P5XwC6Ovui at3kGIJPpYFOG_FiIBYT8xLkkbiphhR 4ncR6R9tPPyeN--_3RxFgKMh5tMO_ jesAcu7Anp87Qb91ruM85CKqduV-y6 HQJtAvVSXmfG4yE4N7d4_dDVKsR7 UkEmDIznJE0HIhvvI2R6vX2tMN5yMc _ZrUbUB0gPF6SgXHVJmKRizCRqL7J 64WRD-XnMSpVHY_LUVJ7gn9kJQ35 _zQw8vLD-_kRyvxwvE.4IVMdKzF1Ax mQHQhWEi6LH12UI4CmMgi288_g3zG CPY&dib_tag=se&keywords=LM8LUU+ Fdit&nsdOptOutParam=true&qid=17347 04494&s=industrial&sprefix=lm8luu+fdit+ %2Cindustrial%2C136&sr=1-1-spons&sp _csd=d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 45 mm
Linear ball bearing (LM8UU)	ARCELI	https://www.amazon.it/gp/product/ B07BV3YBP2/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 24 mm
Magnets	OCEUMAOA	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CB6C2RF4/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	8 x 3 mm
Matrigel	Gibco Thermofisher	LOT 0202003	SBMe
Motor driver	Longruner	https://www.amazon.it/gp/product/ B071P41ZBW/ref=ppx_yo_dt_b_search _asin_title?ie=UTF8&psc=1	Driver A4988
PBS	MicroGem, VWR	TL1006-500ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco Thermofisher	15070063
Pipette tips	Sigma-Aldrich	Z740058	BRAND filter tips, racked, TipBox (volume 50-1000 μL)
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti- plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0CF Q4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.bf7 Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_NuF ZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZgdzI 356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfklAYrb rXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPcLF2f2E EcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0sLPnM0ts wdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpVNMA4Kwh 0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9LLj1uMID2E Gi_ScmYqY5LahbYOmKVVPPiPIgCVdLjaM8 yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ 88x9GkX7EWuOwYO0dEUYSzHCdGONWo eZLfSJOR3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3A H53BtIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO 6upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq8 MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_ E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexiglass+ 2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-14	2 mm thickness, transparent sheet, 21 x 32.5 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.b f7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_N uFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZ gdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfk lAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPc LF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0s LPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpV NMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9 LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYOmKVVPP iPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHx mMeaQUqGkoQ88x9GkX7EWuOwYO0dE UYSzHCdGONWoeZLfSJOR3C6-knjzKrO Q0ziouJfo-ktbak7v3AH53BtIOiXbT57cKqh- uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6upc61MoydZujux nfLG7hwytqHQG2.ApKq8MVs8Xihn_zcA3 9nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_E&dib_tag=se &keywords=lastra+plexiglass+2+mm&nsd OptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-15	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 20 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9. bf7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_ NuFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHB tZgdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG- kfklAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJ PcLF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA 0sLPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh 4fpVNMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYft Xvvz9LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYO mKVVPPiPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge 2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ88x9GkX7E WuOwYO0dEUYSzHCdGONWoeZLfSJO R3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3AH53B tIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6 upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq 8MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJ N_E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexigl ass+2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1 734702823&sr=8-16	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 30 cm
Polylactic acid (PLA) filament	Flashforge	Black 100102
Power supply	SQUADO	https://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore -stabilizzato-dissipatore-efficienza /dp/B0DMTG6SJD/ref=sr_1_6?dib =eyJ2IjoiMSJ9.1vVze6Zt6fhKCvFb eAOSiRe57N6a1mlBnkLdHiEym4 ugHzueF6_FdOodb3sftCXb5raTg eerMMUbL5KcaI_SDa_2j7s2XohI B01QMJDyq0xQ5Gp3KLIZozDHV fGBdSrvwgyOl-BXSDy_ocZlj2TL5 e21p3K6qpvSaT5yo8WA5tngS93 Eqe8s8D6mjpnnPFrb9RpQpj299Y nNRYgr_YF3NCt3mH0r0FocKcCa LNpKtfGLCbnz_yB-360tp5SAi7A7 cgBf5I4NzQ5iQTTXAG727x0Hml mG-eaFBSJv6M1LPooZiT2aT7dx o_7tzyU6MQ9vAEozXkLTaTTMX RA_svPp96sxp93NRLReI64xpFd S3Zh1y_JPQijbMAIuvuYflhh6JlPB W6-fpW6QXl9v5wNEs_YwjzP9Sf RKxRmchzZhgsK-34XJeaEmjbRq H3piM0Zx.MfPYUNvCEhDBqLDh C-iqBEu-vjIVgsrQmOjeLuGo9YQ& dib_tag=se&keywords=power+sup ply+AC+INPUT%3A+110-220V%2 C+DC+OUTPUT%3A+12V+15A&n sdOptOutParam=true&qid=173471 4722&sr=8-6	Old Prusa i3 power supply (AC INPUT: 110-220 V, DC OUTPUT: 12 V 15 A). Link to commercially available alternative
Pulley 5 mm	VooGenzek	https://www.amazon.it/gp/product/ B0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Bore 5 mm, Width belt space 6 mm
Pulley 8 mm	Yxtaii	https://www.amazon.it/gp/product/ B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Bore 8 mm, Width belt space 6 mm
Ribbon cables	QUARKZMAN	https://www.amazon.it/sspa/click?ie =UTF8&spc=MTo0NDgyNTkwNzU wNjM5NzM5OjE3MzQ3MTQ1OTE6 c3BfbXRmOjMwMDEyMjk4NTMzN TYzMjo6MDo6&url=%2FQUARKZM AN-connettore-Lunghezza-Comput er-confezione%2Fdp%2FB0CQRM DQNG%2Fref%3Dsr_1_15_sspa% 3F__mk_it_IT%3D%25C3%2585M %25C3%2585%25C5%25BD%25 C3%2595%25C3%2591%26crid%3 D3BZ8Q05YA50TX%26dib%3Dey J2IjoiMSJ9.zoYnL2ViiarlDS_7165D ldxu-TTbVbWUVAP3pCybFB-bjGl wSgrpnkMhhsJj3NRo8Mvht8ev5H vGQ-UUpPom12OcOcwyRVXLAR UvMyTm8mpAdZSaOritwHRgwu2 JuW9UoS4jlCbA-gzP2FEAAH47K fFOWN6FEhc5r0YGBcSIsA6_QV6 _LA1k_ifj3c2BFm2Fj8YjW-auz7Yiy ULfZusvGX28S1K5kJdTa_YOwJY YC0Y__s-CCchHKiZgDhFjtFogUz0 Tonob4HQZiO_hkrnm3ixpNj9rgE- hvVq1FK1uD9M.kkP89x1SJ0SLxZ sv3YomYEfmkhpvP4WQf2TtC76K YAE%26dib_tag%3Dse%26keywords %3DCavo%2Bflessibile%2Ba%2Bna stro%2Bpiatto%2Bper%2Bstampant e%2B3D%2Ba%2B10%2Bpin%26n sdOptOutParam%3Dtrue%26qid% 3D1734714591%26s%3Dindustrial %26sprefix%3Dcavo%2Bflessibile %2Ba%2Bnastro%2Bpiatto%2Bper %2Bstampante%2B3d%2Ba%2B10 %2Bpin%252Cindustrial%252C170 %26sr%3D1-15-spons%26sp_csd% 3Dd2lkZ2V0TmFtZT1zcF9tdGY%26psc%3D1	ribbon cable 2651 28AWG 10 pins
Rigid shaft coupling	Gwolf	https://www.amazon.it/gp/product/ B088R8CW5Z/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Coupling from 5 to 8 mm
Rods 4 mm	RS-components	682-810	Diameter 4 mm
Rods 5 mm	Sourcingmap	a14010200ux0214	Diameter 5 mm
Rods 8 mm	RS-components	682-078	Diameter 8 mm
Screws	Bnnrjia	281-984	M2x6 - Flat head
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