Progettazione e validazione di una biostampante ad estrusione volumetrica per la biostampa di estratto solubile di membrana basale per la ricerca traslazionale

Riepilogo

Gli estratti solubili della membrana basale sono le matrici biologiche più utilizzate nella ricerca sul cancro, ma il loro complesso comportamento reologico rende difficile la loro biostampa con i sistemi di bioprinting disponibili in commercio. Questo lavoro presenta una strategia di bioprinting personalizzata per produrre costrutti di matrici pure con una buona fedeltà di forma sia in strati singoli che multipli.

Abstract

Nella ricerca traslazionale, i modelli 3D in vitro sono essenziali per far progredire la comprensione scientifica e lo sviluppo terapeutico. A questo scopo, gli estratti solubili di membrana basale (SBMes), derivati da cellule di sarcoma di topo, svolgono il ruolo chiave di replicare le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente in vivo . Sono particolarmente preziosi in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test sui farmaci. In particolare, sono diventate fondamentali nella ricerca sul cancro in quanto le tradizionali colture cellulari 2D, ampiamente utilizzate nel campo, possono fornire informazioni fuorvianti poiché non catturano la struttura tridimensionale (3D) e il microambiente tumorale.

Nella ricerca sul cancro, modelli 3D in vitro efficaci sono fondamentali per comprendere meglio l'evoluzione del cancro e anticipare le sfide, come i meccanismi di resistenza ai farmaci. Gli organoidi sono emersi come promettenti modelli 3D in vitro , che offrono una rappresentazione più accurata della biologia dei tumori. Crescono in SBMes poiché creano un ambiente in cui le cellule possono crescere e auto-organizzarsi in strutture 3D. Tuttavia, l'SBMe presenta sfide significative, tra cui basse proprietà meccaniche e comportamento reologico complesso, che ne impediscono l'uso con i sistemi di bioprinting per estrusione pneumatica disponibili in commercio.

Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo sviluppato un sistema di bioprinting a basso costo e a controllo volumetrico e un protocollo specifico per la stampa di strutture con SBMe. Questo sistema si basa su un estrusore volumetrico e supera i limiti dei tradizionali approcci ad azionamento pneumatico. Una volta assemblato e programmato con uno specifico g-code, il sistema può biostampare sia SBMe puro che diluito per ottenere costrutti sia monostrato che multistrato. Questo approccio offre un metodo più affidabile e scalabile per la produzione di modelli 3D di colture cellulari, aprendo la strada a una ricerca più efficace su nuovi trattamenti e test farmacologici.

Introduzione

Nella ricerca traslazionale, la creazione di modelli 3D in vitro che replichino fedelmente l'ambiente in vivo è essenziale per far progredire la comprensione scientifica e lo sviluppo terapeutico¹. Un componente chiave nella loro costruzione è l'uso di analoghi della matrice extracellulare (ECM), come gli estratti solubili della membrana basale (SBMes), che riflettono meglio la complessità dei tessuti naturali. Le SBMe sono particolarmente preziose in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test sui farmaci ^2,3. In particolare, sono diventati fondamentali nella ricerca sul cancro, in quanto replicano le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente tumorale, consentendo lo sviluppo di modelli che riflettono meglio la crescita tumorale, le metastasi e le risposte al trattamento.

Infatti, nonostante i notevoli progressi compiuti negli ultimi decenni, molte terapie continuano a fallire, portando a frequenti fallimenti del trattamento in ambito clinico. Questo fallimento è spesso attribuito a meccanismi di resistenza ai farmaci causati da alti livelli di eterogeneità cellulare ^4,5. Modelli in vitro efficaci, in grado di ricapitolare accuratamente la complessità dei tumori umani, sono fondamentali per comprendere meglio l'evoluzione del cancro e anticipare questo fenomeno.

Le tradizionali colture cellulari 2D sono state fondamentali nella ricerca sul cancro, ma possono portare a informazioni fuorvianti sull'efficacia dei farmaci e sul comportamento del tumore, poiché non riescono a catturare la struttura 3D e il microambiente dei tumori reali ^6,7,8. Al contrario, i modelli 3D in vitro sono emersi come alternative promettenti, offrendo una rappresentazione più accurata del microambiente tumorale e del comportamento biologico imitando la complessità 3D ^9,10.

Nella ricerca sul cancro, gli organoidi sono ampiamente utilizzati come modelli 3D per lo studio della malattia e dell'efficacia dei farmaci, poiché forniscono modelli più accurati e pertinenti di tessuti e organi umani. L'uso di SBMe, derivato dalle cellule del sarcoma di topo di Engelbreth-Holm-Swarm, è stato fondamentale per far progredire la ricerca sul cancro^11,12. Fornisce un substrato gelatinoso in cui le cellule possono crescere, proliferare e auto-organizzarsi in strutture di organoidi, garantendo un corretto sviluppo e crescita^13,14.

Tuttavia, la SBMe pone una serie di sfide a causa delle sue caratteristiche uniche e complesse. Essendo un fluido non newtoniano, l'SBMe presenta proprietà di assottigliamento al taglio, il che significa che la sua viscosità diminuisce con l'aumentare dello sforzo di taglio, rendendo la sua manipolazione e applicazione incoerenti sotto forze variabili. Inoltre, il suo comportamento tissotropico aumenta la complessità, in quanto può recuperare la sua viscosità nel tempo quando lo stress di taglio viene rimosso^15,16. Queste proprietà, insieme alla bassa resistenza meccanica (con valori del modulo di stoccaggio che vanno da 10 Pa a 5.000 Pa a seconda della concentrazione proteica) e al comportamento termosensibile, peggiorano queste sfide, richiedendo un controllo meticoloso durante la preparazione e l'uso, nonché la biostampa pura.

I sistemi standard di bioprinting ad azionamento pneumatico non riescono a controllare correttamente l'erogazione di SBMe poiché l'applicazione della pressione provoca un comportamento incontrollabile dopo la sua espulsione dalla siringa. Essa è affetta da un fenomeno simile all'"effetto spurt" descritto per i fusi polimerici, in cui la portata aumenta bruscamente al di sopra di un certo valore critico di pressione 17,18,19. Come riportato nel nostro precedente lavoro¹⁶, la strategia di erogazione a controllo volumetrico consente di disaccoppiare l'estrusione SBMe dalla pressione generata nel dosatore, che dipende dalle proprietà reologiche della matrice, dalle condizioni di lavoro e dalla geometria dell'ugello. Negli ultimi anni, sul mercato sono stati fatti diversi tentativi di sfruttare lo stesso principio, con Matribot di Corning in testa. Consente la manipolazione e la deposizione di SBMe e altri bioink sensibili alla temperatura grazie a condizioni di temperatura controllata. Tuttavia, potrebbe essere costoso, limitando l'accessibilità per i laboratori più piccoli.

Nel nostro articolo precedente, abbiamo presentato un'alternativa personalizzata a basso costo: un sistema di bioprinting volumetrico¹⁶. Questa versione era basata su una stampante 3D entry-level modificata con un estrusore stampato in 3D personalizzato. Nonostante la sua efficacia nel bioprinting, presentava alcune limitazioni nella ripetibilità della stampa. Essendo derivato da una stampante 3D entry-level, aveva alcuni problemi con i movimenti Z e l'auto-homing. Per rispondere a queste esigenze, abbiamo sviluppato una versione avanzata del nostro sistema di dosaggio volumetrico personalizzato a basso costo e un protocollo specifico per le strutture di bioprinting che utilizzano SBMe.

Qui, forniamo protocolli per la costruzione e l'uso di questo sistema. È composto da un estrusore volumetrico personalizzato, basato sul nostro precedente studio¹⁶, una custodia per bioprinter e un sistema di controllo. La produzione e l'assemblaggio vengono effettuati per ogni modulo. Se assemblato e programmato con un file gcode specifico, seguendo la descrizione del protocollo per la gestione delle matrici, il sistema è in grado di biostampare costrutti puri o diluiti utilizzando l'SBMe con una buona fedeltà di forma sia in strati singoli che multipli.

Protocollo

1. 3D stampa e assemblaggio di bioprinter volumetrici

1. Prepara e stampa in 3D i componenti della biostampante.
   1. Scarica il file *. File di progettazione STL dal file supplementare 1.
   2. Carico*. STL nel software proprietario di slicing per definire l'orientamento dei pezzi sulla lastra di stampa e tutte le opzioni necessarie per la stampante 3D. Stampa i pezzi utilizzando acido polilattico (PLA) con opzioni di media qualità (dimensione ugello 0,4 mm, diametro filamento 1,75 mm, temperatura estrusore 220 °C, temperatura piastra di stampa 50 °C, altezza strato 0,2 mm, velocità di stampa 300 mm/s).
      NOTA: Le opzioni di qualità media possono variare a seconda della stampante utilizzata per la stampa dei pezzi.
   3. Staccare i pezzi stampati dal piano della stampante 3D. Rimuovere le strutture di supporto stampate, se presenti, e lucidare le superfici dove necessario.
2. Assemblare l'estrusore (Figura 1).
   1. Inserire due cuscinetti lineari a sfere (LM4UU) nei fori verticali del blocco spintore. Inserire anche un dado per vite T8 nel foro centrale posteriore e fissarlo con quattro viti (M3x10).
   2. Fissare un giunto rigido dell'albero al motore passo-passo e quindi fissarlo all'alloggiamento del motore dell'estrusore utilizzando quattro viti (M3x6).
      NOTA: Orientare il motore passo-passo in base alla scanalatura nell'alloggiamento del motore dell'estrusore per consentire il corretto posizionamento del jack per i cavi.
   3. Fissare il motore passo-passo, montato al punto 1.2.2, ad una vite T8 (150 mm) utilizzando il giunto rigido dell'albero precedentemente inserito. Assicurarsi che ogni blocco sia fissato correttamente con le viti di fermo.
   4. Fissare un cuscinetto a flangia autoallineante (diametro interno 8 mm) nella parte inferiore della base dell'estrusore con due viti (M4x8).
   5. Inserire due cuscinetti a sfera (4 x 9 x 4 mm) negli appositi fori sulla parte superiore della base dell'estrusore e gli altri due nei fori della sezione inferiore.
   6. Inserire la parte assemblata (passaggio 1.2.1) nella base dell'estrusore attraverso la cavità nella parte superiore della struttura. Collegare i quattro cuscinetti a sfera (passaggio 1.2.5) con due aste da 4 mm, una per lato. Far passare le aste attraverso i due cuscinetti lineari a sfere nella parte assemblata al punto 1.2.1.
      NOTA: E' anche possibile inserire prima le barre sui due cuscinetti a sfera superiori e poi inserirle nella base dell'estrusore fino a raggiungere il cuscinetto a sfere inferiore e il tutto è fissato nelle fessure definite.
   7. Inserire la parte assemblata al punto 1.2.3 nel foro centrale della base dell'estrusore. Ruotare la vite di comando per far passare il dado della vite di comando e raggiungere il cuscinetto della flangia autoallineante. Utilizzare le viti di fermo nel componente per bloccare la vite di comando e due viti (M3x8) per fissare l'alloggiamento del motore dell'estrusore sulla parte superiore della base dell'estrusore.
   8. Utilizzare altre due viti (M3x40) e dadi M3 per fissare il fermo della flangia del cilindro della siringa alla parte inferiore della base dell'estrusore, per bloccare la flangia del cilindro della siringa (direzione di inserimento dall'alto verso il basso). Utilizzare altre due viti (M3x30) e dadi M3 per fissare il fermo del pistone della siringa ai fori superiori del blocco di spinta (direzione di inserimento dal basso verso l'alto) per bloccare la flangia dello stantuffo.
   9. Inserire due viti (M4x80) in due molle e farle passare attraverso i fori presenti nella parte inferiore della base dell'estrusore e del blocco siringa. Avvitare i dadi lasciando lo spazio per la siringa per evitare che il blocco siringa scivoli.
      NOTA: Le viti devono andare da dietro in avanti.
3. Assemblare l'asse X (Figura 2).
   1. Inserire quattro cuscinetti a sfere lineari (LM8UU x 24 mm) nel X_Left_Block e X_Right_Block parti nei fori superiore e inferiore, due per ciascuno. Fissare anche due blocchi della cintura sopra i blocchi X destro e X sinistro con le viti (M2x10) lasciando spazio per la cintura.
   2. Inserire due cuscinetti a sfera (5 x 16 x 5 mm) nei fori centrali di X_Right_Block, uno per lato. Posizionare una puleggia (foro 5 mm) nella cavità interna del X_Right_Block e collegare i due cuscinetti a sfera con un'asta da 5 mm (lunghezza 35 mm), facendola passare attraverso la puleggia.
      NOTA: Utilizzare un'asta più lunga per il montaggio per avere una migliore maneggevolezza. Dopo aver posizionato i pezzi in posizione, tagliare l'asta della lunghezza desiderata.
   3. Fissare un finecorsa al X_motor_housing con due viti (M3x8). Inserire il motore NEMA 17 nell'alloggiamento del motore e utilizzare quattro viti (M3x8) per fissare il coperchio del X_block_1 all'alloggiamento del motore e al motore.
   4. Fissare una puleggia (foro 5 mm) al motore e bloccarla con viti di fermo, quindi avvitare la parte assemblata al punto da 1.3.3 a X_block_1 con quattro viti (M5x8). Fissare anche un finecorsa nella parte inferiore del X_Left_Block con due viti (M3x8).
      NOTA: Il diametro esterno delle pulegge nei passaggi 1.3.2 e 1.3.4 deve essere lo stesso.
   5. Posizionare due cuscinetti a sfere lineari (LM8UU x 45 mm) nei fori nella parte superiore e inferiore del X_slider.
   6. Collegare le parti assemblate nei passaggi 1.3.2 e 1.3.4 con due aste da 8 mm (lunghezza 200 mm) e farle passare attraverso la parte assemblata nel passaggio 1.3.5.
      NOTA: Tagliare le aste della lunghezza desiderata prima del montaggio.
   7. Bloccare un'estremità della cinghia al X_slider_belt_connection utilizzando il blocco della cinghia e due viti (M2x8). Far passare la cinghia attorno alla puleggia nella parte assemblata 1.3.4, quindi attorno alla puleggia nella parte assemblata 1.3.2 e fissare l'altra estremità della cinghia al collegamento X_slider_belt utilizzando il secondo blocco cinghia e altre due viti (M2x8). Assicurarsi che la cintura sia ben tesa per ottenere il movimento corretto.
      NOTA: Durante questa fase, il X_slider deve essere spostato verso un'estremità della struttura dell'asse X per evitare interferenze.
   8. Avvitare la X_slider_belt_connection al X_slider con una vite (M6x20).
   9. Collegare l'estrusore al X_slider e fissarlo con quattro viti (M5x10).
4. Assemblare l'asse Y (Figura 3).
   1. Posizionare la staffa di fissaggio sulla parte posteriore della bioprinter utilizzando quattro viti (M3x10) e quattro dadi.
      NOTA: La posizione della staffa di fissaggio può essere adattata per ottenere la corretta tensione della cinghia e consentire l'inserimento del motore passo-passo.
   2. Inserire il motore passo-passo nella staffa di fissaggio e avvitarlo con quattro viti (M3x8). Quindi, posizionare una puleggia (foro 5 mm) sull'albero motore e fissarla con le viti di fermo.
      NOTA: La puleggia può essere fissata all'albero motore prima di inserire il motore nella staffa di fissaggio per evitare interferenze tra i componenti.
   3. Posizionare due pulegge (diametro interno 8 mm) sull'asta anteriore da 8 mm e bloccarle sulle due aste (a 2,5 cm dall'estremità). Ripetere questa operazione per l'asta posteriore e aggiungere un'altra puleggia, a 5 cm di distanza dall'estremità destra.
   4. Fissare 12 cuscinetti a flangia autoallineanti (diametro 8 mm) alle parti superiori interne della biostampante.
   5. Collegare le due parti anteriori della bioprinter e le due parti posteriori della bioprinter (direzione sinistra/destra) utilizzando le aste assemblate al punto 1.4.3 e bloccarle ai cuscinetti della flangia autoallineante (diametro 8 mm). Fissare le due parti assemblate a tutte le giunzioni con le viti (M3x8).
      NOTA: Quando si posiziona l'asta posteriore, posizionare una cinghia chiusa che collega la puleggia sul motore passo-passo con la puleggia interna sull'asta.
      NOTA: Fissare il motore passo-passo serrando i dadi per garantire l'assenza di movimento del motore e la corretta tensione della cinghia.
   6. Collegare le due parti assemblate al punto 1.4.5 utilizzando quattro aste da 8 mm. Far passare le aste attraverso i cuscinetti lineari a sfere presenti nella parte assemblata 1.3 e bloccarle ai cuscinetti a flangia autoallineanti (diametro 8 mm). Fissare le due parti assemblate a tutte le giunzioni con le viti (M3x8).
   7. Fissare un'estremità della cinghia aperta sulla parte superiore del X_block_1 utilizzando il blocco della cinghia e ripetere questa operazione per la X_block_2. Far passare la cinghia attorno alle pulegge posteriori a sinistra, quindi attorno alla puleggia anteriore e fissare nuovamente l'altra estremità della cinghia alla X_block_1 con un altro blocco cinghia. Ripetere questa operazione per la seconda cinghia.
      NOTA: Le cinghie devono essere adeguatamente tese per ottenere il movimento corretto e della stessa lunghezza per evitare piegamenti o interferenze nei movimenti Y.
5. Assemblare l'asse Z (Figura 4).
   1. Avvitare insieme le parti inferiori della custodia della biostampante (M4x8).
   2. Fissare un cuscinetto a flangia autoallineante (diametro 8 mm) al pavimento della parte inferiore della parte assemblata al passaggio 1.5.2.
   3. Fissare con viti due cuscinetti lineari a sfere flangiati (LMH8UU) ai fori esterni presenti nel Z_slider e una madrevite nel foro centrale (M3x8).
   4. Fissare un finecorsa al lato sinistro Z_plane con due viti (M3x8).
   5. Fissare il motore passo-passo a un giunto rigido dell'albero. Fissare un motore passo-passo al Z_block con quattro viti (M3x20) e un'asta filettata al giunto rigido dell'albero. Assicurarsi che ogni blocco sia fissato correttamente con le viti di fermo.
   6. Collegare la parte assemblata al punto 1.5.5 alla base della biostampante utilizzando due aste da 8 mm. Lasciarli passare attraverso la parte assemblata al punto 1.5.3.
   7. Fissare la Z_block al pannello posteriore utilizzando due viti (M5x8).
   8. Collegare Z_plane a Z_slider utilizzando quattro viti (M3x25). Inseriteli nei fori di Z_plane dall'alto verso il basso, passate la molla tra Z_plane e Z_slider e fissateli con i dadi. Regolare la tensione della molla per livellare il piano.
   9. Fissare quattro piedini regolabili sotto la struttura della biostampante nell'apposita cavità. Livellare la bioprinter regolando i piedini.
   10. Collegare la parte assemblata alla parte assemblata al punto 1.4.6 con otto viti (M4x12).
   11. Fissare con le viti due cerniere sulla parte frontale della struttura nelle apposite sedi e un magnete sulla parte destra nell'apposito punto (M2x8). Avvitare l'intera struttura a lastre di plexiglass trasparente da 2 mm per chiudere le aperture.
       NOTA: Avvitare il pannello frontale in plexiglass alle cerniere e inserire un'altra vite in corrispondenza del magnete per ottenere una porta anteriore.
6. Visualizzare l'assieme (Figura 5A).
   1. Far passare i cavi, collegati al display, attraverso il foro inferiore e fissare il display all'alloggiamento del display con quattro viti (M3x3).
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito senza il coperchio della manopola LCD. Potrebbe essere posizionato sulla manopola preinstallata dopo il fissaggio all'alloggiamento del display.
   2. Chiudere l'alloggiamento con il coperchio utilizzando quattro viti (M2x6).
   3. Inserisci la scheda SD nello slot sinistro.
   4. Lascia che i fili passino attraverso il foro sulla parte superiore della struttura. Avvitare la parte assemblata nella parte superiore del bioprinter con due viti (M3x8).
      NOTA: Tutti i cavi (motori, finecorsa e display) scorreranno vicino al muro e usciranno dal foro in basso a sinistra. Sono fissati con fermacavi per evitare interferenze con le parti meccaniche.
7. Assemblaggio dell'elettronica (Figura 5B)
   1. Fissare la presa alla parte esterna della custodia elettronica con due viti (M3x10).
   2. Fissare la scheda madre alla parte interna del case elettronico con quattro viti (M3x10).
   3. Fissare la parte inferiore dell'alimentatore alla parte interna della custodia elettronica con quattro viti (M3x8).
   4. Passare i fili attraverso il foro circolare sul coperchio e collegarli alla scheda madre. Chiudere la custodia elettronica con il suo coperchio utilizzando quattro viti (M3x10).
      NOTA: E' possibile collegare la custodia dell'elettronica alla struttura della biostampante o lasciarla sulla scrivania in caso di spazi di lavoro ridotti.
      La Figura 6 mostra tutti i collegamenti dei cavi elettronici. Possono essere leggermente diversi a seconda della scheda madre della stampante 3D in uso.

2. Impostazione del software e processo di generazione del gcode

1. Preparazione delle impostazioni del software di slicing
   1. Aprire il software di affettamento.
      NOTA: Le istruzioni possono variare a seconda del software utilizzato o della versione.
   2. Accedi alla piattaforma.
   3. Vai alle opzioni Impostazioni . Selezionare la stampante, quindi Aggiungi una stampante non in rete. Seleziona la stampante FFF personalizzata e nella casella Nome stampante, digita il nome della stampante. Fare clic su Aggiungi.
      NOTA: Se si tratta della prima installazione del software, il pannello Aggiungi stampante si aprirà automaticamente dopo l'accesso.
   4. Nella finestra Impostazioni macchina , modificare le impostazioni predefinite x, y, z a 176, 120, 45 mm.
   5. Deselezionare l'opzione Letto riscaldato se non è già deselezionata.
   6. Inserire nei pannelli G-code iniziale e G-code finale le righe di testo riportate nei file intitolati 'JoVE_Starting_G-code.txt' e 'JoVE_Ending_G-code.txt' nel File supplementare 2.
      1. Modificare il valore 150 nella riga 'M92 E150' nel file g-code iniziale in base alla portata da applicare. Stimare il valore corretto utilizzando la seguente formula:
         
         Dove Q è la portata desiderata [μL/min].
         NOTA: Questa formula è stata ottenuta sperimentalmente con il sistema descritto. Potrebbe essere diverso se ci sono modifiche ai componenti meccanici o elettrici. Una possibile alternativa potrebbe essere quella di fissare il valore in base al sistema in uso e creare un codice MATLAB personalizzato per generare il file gcode desiderato.
   7. Modificare il valore Diametro materiale compatibile nel pannello Estrusore 1 a 1,75 e quindi chiudere.
   8. Vai su Marketplace, seleziona il plug-in Z Offset Setting e installalo. Al termine del processo, riavvia il software per finalizzare. Una volta riaperto, seleziona Impostazioni | Stampante | Gestisci stampanti sulla barra degli strumenti. Nella finestra Preferenze , fai clic su Impostazioni e attiva tutte le opzioni selezionando l'opzione Controlla tutto e chiudila.
   9. Configurare la configurazione facendo clic su Impostazioni di stampa (terzo pulsante) nel menu stage , che contiene il pannello di configurazione . Immettere la percentuale di riempimento nel profilo di stampa corrente nel pannello di configurazione . Selezionare il pulsante Personalizzato per modificare le impostazioni di stampa correnti e il profilo Fine nel menu a discesa. Impostare la velocità di stampa su 10 mm/s.
2. Preparazione del gcode
   1. Scarica il file *. File di progettazione STL, intitolato 'JoVE_Square', dal file supplementare 2 di questo documento.
   2. Carico. STL nel software di slicing.
   3. Posiziona il pezzo sulla superficie piana e spostalo alle coordinate 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Creare due copie facendo clic sul pulsante . Nome del file STL nell'elenco degli oggetti e selezionando l'opzione Moltiplica selezionati. Spostali alle seguenti coordinate: 16, 42,5, 0 mm e -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      NOTA: Non è possibile definire automaticamente l'ordine di stampa a meno che non venga modificato manualmente direttamente nel file gcode finale. Le coordinate sono definite per una piastra a 6 pozzetti multipli.
   4. Vai alle Impostazioni di stampa nel menu stage . Nella sezione Muri , metti 0 come conteggio delle linee del muro. Metti 0 come valore di spessore superiore/inferiore nella sezione superiore/inferiore . Nel pannello Riempimento , inserire i seguenti valori: Motivo di riempimento: Griglia, Distanza linea di riempimento: 5 mm, Direzioni linea di riempimento: [0].
      NOTA: È possibile ridurre la velocità di traslazione nella sezione Velocità di stampa per migliorare la precisione dell'asse X.
   5. Disabilitare la retrazione nella sezione Corsa e il raffreddamento della stampa nella sezione Raffreddamento .
   6. Nella sezione Adesione piastra di stampa , selezionare Nessuno come Tipo di adesione piastra di stampa, mentre nella sezione Modalità speciali , selezionare l'opzione Uno alla volta come Sequenza di stampa.
   7. Fare clic sul pulsante Slice per generare il g-code.
   8. Apri il file g-code con l'applicazione Blocco note e rimuovi le righe "M104 S200", "M105" e "M109 S200" nella riga 12 dopo la frase "; Generato con Cura_SteamEngine 4.9.0".
   9. Aggiungere "G1 Z25" prima della riga successiva"; MAGLIA: JoVE_Square_rev. STL(6)" e dividere il successivo in due: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 e (2) G1 Z0.3.
      NOTA: Le coordinate X e Y sono solo esempi.
   10. Modificare il valore Z in Z25 in ogni riga presente dopo "; TIME_ELAPSED" commenta ogni ultima istruzione di strato di ogni pezzo.
       NOTA: Per la stampa di un solo pezzo, il passaggio 2.3.10 non è necessario.

3. Test di rigonfiamento/degradazione

1. Fasi preparatorie
   1. Assumere una siringa di vetro sterile da 1 ml (terminale TLL) e un ugello conico sterile da 25 G. Assemblali e metti la siringa assemblata in frigorifero.
   2. Mettere i puntali delle pipette e la fiala della matrice SBMe in frigorifero per una notte il giorno prima dell'esperimento.
   3. Stampa tre griglie in PLA (Φ = 20 mm) con pori circolari di 1 mm x 1 mm e un pilastro verticale laterale per afferrarle.
2. Costrutti di stampa
   1. Prendere la siringa assemblata e il flaconcino della matrice SBMe dal frigorifero. Aspirare 500 μL della matrice SBMe e metterla nell'incubatore per 15 minuti per consentire la gelificazione.
   2. Prendere la siringa dall'incubatrice e inserirla nella testina di stampa del bioprinter. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa sia correttamente a contatto con il blocco spintore.
   3. Fissare lo stantuffo di fissaggio della siringa e la flangia del cilindro della siringa con i fermi del pistone della siringa e il cilindro della siringa con il morsetto della siringa.
   4. Calibrare il sistema utilizzando l'impostazione Auto-home nel menu della biostampante per rilevare automaticamente l'origine degli assi.
   5. Spostare l'estrusore utilizzando il comando Sposta assi fino a quando la punta dell'ago tocca la griglia PLA per definire manualmente Z0.
   6. Avviare la stampa selezionando il file g-code da stampare nel menu della biostampante.
   7. Mettere la piastra multipozzetto nell'incubatore per 2 minuti per consentire all'SBMe di stabilizzarsi dopo l'estrusione.
   8. Prendere la piastra multipozzetto e inserire 2 mL di terreno di coltura cellulare nei tre pozzetti contenenti le griglie biostampate. Inserire la piastra multipozzetto nell'incubatore.
   9. Ad ogni punto temporale (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 e 14 giorni), prelevare ogni griglia dalla lastra e asciugarla con carta pulita per rimuovere l'eccesso di fluido e peso su una bilancia. Rimetti la griglia nella piastra e poi nell'incubatrice per continuare l'esperimento. Stimare il rapporto di rigonfiamento e il tasso di degradazione utilizzando le seguenti formule:
      
      Dove W_t è il peso dei costrutti in ogni punto temporale e W_t0 il peso dei costrutti essiccati.
      
      Dove W_i è il peso alla fine della prova di rigonfiamento.

4. Bioprinting di costrutti SBMe

1. Fasi preparatorie
   1. Prendere una siringa di vetro sterile da 1 ml (terminale TLL) e un ugello conico sterile da 25 G e assemblarli sotto la cappa di biosicurezza. Mettili in una scatola sterile in frigorifero.
   2. Mettere i puntali della pipetta e il flaconcino della matrice SBMe in frigorifero per una notte (4 °C con ghiaccio) il giorno prima dell'esperimento.
   3. Aggiungere 20 μl di blu di tripano in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
   4. Impostare la centrifuga a 345 × g, 4 °C e lasciarla raffreddare (~3-4 h).
   5. Assumere 5 mL di acqua in una provetta da centrifuga da 15 mL come bilancia per la centrifuga.
   6. Soluzione tampone fosfato calda (PBS) e terreno a bagnomaria.
      NOTA: Il terreno di coltura cellulare è costituito da un terreno di Eagle's modificato con Dulbecco (DMEM) completo integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina-streptomicina e L-glutammina.
   7. Posizionare il bioprinter sotto la cabina di sicurezza biologica. Sterilizzare sotto luce UV per 20 min.
      NOTA: Per garantire il corretto funzionamento della biostampante, eseguire la funzione Auto-home e verificare i movimenti corretti di ciascun asse e il funzionamento dei finecorsa.
2. Preparazione Bioink
   1. Prendi il pallone nell'incubatrice contenente cellule di cancro alla prostata murino in commercio e mettilo sotto la cabina di biosicurezza.
   2. Estrarre il terreno di coltura cellulare dal pallone.
      NOTA: I volumi riportati in questo protocollo si applicano ai matracci per colture cellulari T25.
   3. Lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS e poi aspirarle.
   4. Aggiungere 500 μl di tripsina e mettere il pallone nell'incubatore per 5 minuti per consentire il distacco delle cellule dalla piastra.
   5. Controllare la tripsinizzazione delle celle e, se necessario, picchiettare delicatamente il fondo del pallone.
   6. Aggiungere 4,5 ml di terreno al pallone. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule staccate galleggino nel terreno di coltura cellulare.
   7. Aspirare il terreno e aggiungerlo a una provetta da centrifuga da 15 mL.
   8. Prelevare un'aliquota da 20 μL e mescolarla con l'aliquota del blu di tripano. Quindi, mettere 10 μl di questa miscela nella camera di conteggio delle cellule per contare le cellule vive utilizzando la seguente formula:
      
      dove f è il fattore di diluizione per la sospensione di blu di tripano (rapporto 1:1); V è il volume di sospensione cellulare [mL].
   9. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente per 5 minuti (345 × g, 4 °C).
   10. Rimuovere il surnatante e risospendere nella matrice SBMe fredda alla densità cellulare desiderata (10,⁶ cellule/mL)
   11. Aspirare 800 μl della sospensione della matrice contenente le cellule con la siringa fredda.
   12. Rimuovere le bolle d'aria che potrebbero essere intrappolate nella siringa e metterla in una scatola sterile. Quindi, metterlo nell'incubatrice per 15 minuti per consentire la gelificazione.
3. Processo di bioprinting
   1. Prendere la siringa dall'incubatrice e inserirla nella testina di stampa del bioprinter. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa sia correttamente a contatto con il blocco spintore.
      NOTA: Il modello e il volume devono essere gli stessi della siringa utilizzata per l'esperimento.
   2. Fissare lo stantuffo di fissaggio della siringa e la flangia del cilindro della siringa con i fermi del pistone della siringa e il cilindro della siringa con il morsetto della siringa.
   3. Utilizzare i dadi M4 nella parte inferiore dell'estrusore per regolare la pressione della molla e bloccare la siringa in posizione.
      NOTA: I passaggi da 4.3.1 a 4.3.4 sono mostrati nella Figura 7.
   4. Calibrare il sistema utilizzando l'impostazione Auto-home nel menu della biostampante per rilevare automaticamente l'origine degli assi.
      NOTA: Questo passaggio garantisce sempre le corrette impostazioni iniziali indipendentemente dal tipo di supporto che utilizziamo per la stampa.
   5. Posizionare una piastra a 6 pozzetti sul piano di stampa.
   6. Spostare l'estrusore utilizzando il comando Sposta assi fino a quando la punta dell'ago tocca il fondo del pozzetto per definire manualmente Z0.
   7. Seleziona il file gcode nell'opzione di menu del menu bioprinter e avvia la stampa. In ogni pozzetto verrà stampata una griglia quadrata a sei strati (lato 2,6 cm).
   8. Dopo il processo di bioprinting, utilizzare un microscopio invertito per assicurarsi che il processo di stampa sia andato a buon fine e mettere la piastra multipozzetto nell'incubatore per 2 minuti per consentire all'SBMe di stabilizzarsi dopo l'estrusione.
   9. Mettere 2 mL di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto.
      NOTA: Il volume deve coprire completamente i costrutti.

Risultati

In questo articolo, presentiamo un protocollo per i costrutti di bioprinting realizzati in SBMe utilizzando una biostampante volumetrica a basso costo, personalizzata e personalizzata. Forniamo una descrizione dettagliata e la stampa 3D*. STL per costruire il sistema e dimostriamo il suo potenziale utilizzo nella ricerca sul cancro stampando strutture a strato singolo e multistrato. Ogni componente stampato in 3D è stato adeguatamente pulito dalla struttura di supporto o dai residui di ...

Discussione

Nella ricerca traslazionale, le SBMe sono particolarmente preziose in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test farmacologici ^2,3. In particolare, sono diventati fondamentali nella ricerca sul cancro, in quanto replicano le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente tumorale, consentendo lo sviluppo di modelli che riflettono meglio la crescita tumorale, le metastasi e le risposte al tratt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-multiwell plate	Sigma-Aldrich	CLS351143
3D FDM printer	Flashforge	Adventurer 5M Pro
3D printer Motherboard	GEETECH	GT2560 REV A+
6-multiwell plate	Sigma-Aldrich	M8687
AC socket	HiLetgo	https://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket -Holder-Switch/dp/B0814PT3YG/ref=sr_1_1?__ mk_it_IT=%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=2TRIBP34VJ61A &dib=eyJ2IjoiMSJ9.zW6_VmeiudR I4yMpjJqJm7OdeoctTKW2mrEzml BAyJVa1hkM4PiJT3pLY0mXdxm1 AZQxa2_f5J4q4d5v3vUeqLkjJ6BM kWHAoeEfbEQJNuZaQ3NjmUlqWy _1AfQpnRp4VqJ2m3bkWsChztCa Ok-ZdQJlobGxJaMKg7WbV352 Hyo.0tEw2GYoPQJ4SdNYXO1XM Jrl2yXMvRey55Hj7GhISkk&dib_ tag=se&keywords=AC+socket+HiLetgo&nsdOpt OutParam=true&qid=1734702097&sprefix=ac+ socket+hiletgo%2Caps%2C173&sr=8-1	15 A 250 V
Adjustable feet	EXIN DEHCEN	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CPLTSNQB/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Height 27-40 mm
Ball bearing 4 mm	QUARKZMAN	684ZZ	Dimensions 4 x 9 x 4 mm
Ball bearing 5 mm	XiKe	625-2RS	Dimensions 5 x 16 x 5 mm
Belt closed	Turmberg3D	https://www.amazon.it/gp/product/ B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Width 6 mm
Belt open	Fajoeda	https://www.amazon.it/gp/product/ B09QCTVPTH/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Width 6 mm
Bioprinting nozzle	Fisher Scientific	17780789	Corning Standard Conical Bioprinting Nozzles
Bürker Cell Counting chamber	GLASWARENFABRIK KARL HECHT	40443001
Centrifuge	Eppendorf	5702 R
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	CLS431470	15 mL
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	EP0030120086	1.5 mL
Display	Sigma-Aldrich	BR718905
DMEM	Gibco Thermofisher	11965092
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Flanged linear ball bearing	Sourcing map	https://www.amazon.it/gp/product/ B07S6LZHM7/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	LMF8UU
Glass syringe	Fisher Scientific	11520062	Hamilton GasTight 1 mL (TLL terminal)
Hinges	YASQZ	https://www.amazon.it/gp/product/ B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Incubator	Fisher Scientific	15481374	Eppendorf Galaxy 48 R CO2 Incubator, 48 L, Stainless Steel
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti2-U
Jumper wires	Iverntech	https://www.amazon.it/Iverntech-XH2 -54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/ B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_ mcx_views_0_image?pd_rd_w=cb2r J&content-id=amzn1.sym.57a351cf- ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209%3 Aamzn1.symc.ca948091-a64d-450e- 86d7-c161ca33337b&pf_rd_p=57a3 51cf-ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209 &pf_rd_r=YHY9RFYZJK7PYAY2RXX D&pd_rd_wg=7WkXB&pd_rd_r=8239 66cb-4977-48ce-b095-0dcedf8c372f& pd_rd_i=B07Q12B6K5&th=1
LCD unit	Paradisetronic.com	https://www.amazon.it/Display-controller -conduttori-adattatore-stampante/dp/B01 DUR4064/ref=sr_1_9?__mk_it_IT=%C3 %85M%C3%85%C5%BD%C3%95%C3 %91&crid=1OAHVIIRA16X3&dib=eyJ2Ij oiMSJ9.07V2Jf7RzJjTUlIuFobUJFjUzG4 8633KkdcMXSEfnWLRX41d5vAF7xPBJ maniVxDoXecfihZzzOXlP3v-e29cUjoGLf GDyv5DoDVwp7ndohNTYvYzoi3gWkF- Hsd2YbT7tjb1Dra1afqSn26CbFdEvJ84y qyX7Gi3-7DHh8yMwdd6_7quiuW_mjsm w1nu0YQG68GZ0XM7unOsvyddQ__R_ 3dndxb3mOjgGjklEgu_KEbZJPOZDIdSo oU3nrrKHj56hCfk9ACwYpB80QGCbTPK 0p-fE0g9h02WPmtHV38UU3m5AdZsTQ HqvnVlJg703qGT-8ze8fQItw2rtbgl_J86H RMReJOhVLQBkqNwxh57CQ.yNbeFmZ ZBEUhadz2dQa8NxpZD9g4P6ighRU_97 yxgnw&dib_tag=se&keywords=display% 2B3D%2Bprinter%2Bprusa%2Bi3&nsdO ptOutParam=true&qid=1734714093&s= industrial&sprefix=display%2B3d%2B printer%2Bprusa%2Bi3%2Cindustrial% 2C143&sr=1-9&th=1	Old Prusa i3 LCD unit. Link to commercially available alternative
Leadscrew M8	RS PRO	280-408
Leadscrew nut M8	Comioke	https://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4? ref=ppx_yo2ov_dt_b_fed_asin_title&th=1	Nut for M8 screws
Leadscrew nut T8	Aipaide	https://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Nut for T8 screws
Leadscrew T8	VBESTLIFE	https://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Length 15 mm
L-Glutammine	Sigma-Aldrich	G7513
Limit switch	CESFONJER	https://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Linear ball bearing (LM4UU)	A ABSOPRO	https://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 4 x 8 x 12 mm
Linear ball bearing (LM8LUU)	Fdit	https://www.amazon.it/LM8LUU-Linear -Motion-cuscinetti-stampante/dp/B07N 58W3GZ/ref=sr_1_1_sspa?__mk_it_IT =%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=33VNCCCSIFJRP& dib=eyJ2IjoiMSJ9._JJ2doXI33C2JagX 8x6E2Bz2ILo10852tBi1erWqGn363ku zbcvknbMtsK6wm5jdR1P5XwC6Ovui at3kGIJPpYFOG_FiIBYT8xLkkbiphhR 4ncR6R9tPPyeN--_3RxFgKMh5tMO_ jesAcu7Anp87Qb91ruM85CKqduV-y6 HQJtAvVSXmfG4yE4N7d4_dDVKsR7 UkEmDIznJE0HIhvvI2R6vX2tMN5yMc _ZrUbUB0gPF6SgXHVJmKRizCRqL7J 64WRD-XnMSpVHY_LUVJ7gn9kJQ35 _zQw8vLD-_kRyvxwvE.4IVMdKzF1Ax mQHQhWEi6LH12UI4CmMgi288_g3zG CPY&dib_tag=se&keywords=LM8LUU+ Fdit&nsdOptOutParam=true&qid=17347 04494&s=industrial&sprefix=lm8luu+fdit+ %2Cindustrial%2C136&sr=1-1-spons&sp _csd=d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 45 mm
Linear ball bearing (LM8UU)	ARCELI	https://www.amazon.it/gp/product/ B07BV3YBP2/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 24 mm
Magnets	OCEUMAOA	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CB6C2RF4/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	8 x 3 mm
Matrigel	Gibco Thermofisher	LOT 0202003	SBMe
Motor driver	Longruner	https://www.amazon.it/gp/product/ B071P41ZBW/ref=ppx_yo_dt_b_search _asin_title?ie=UTF8&psc=1	Driver A4988
PBS	MicroGem, VWR	TL1006-500ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco Thermofisher	15070063
Pipette tips	Sigma-Aldrich	Z740058	BRAND filter tips, racked, TipBox (volume 50-1000 μL)
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti- plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0CF Q4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.bf7 Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_NuF ZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZgdzI 356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfklAYrb rXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPcLF2f2E EcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0sLPnM0ts wdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpVNMA4Kwh 0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9LLj1uMID2E Gi_ScmYqY5LahbYOmKVVPPiPIgCVdLjaM8 yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ 88x9GkX7EWuOwYO0dEUYSzHCdGONWo eZLfSJOR3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3A H53BtIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO 6upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq8 MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_ E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexiglass+ 2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-14	2 mm thickness, transparent sheet, 21 x 32.5 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.b f7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_N uFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZ gdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfk lAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPc LF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0s LPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpV NMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9 LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYOmKVVPP iPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHx mMeaQUqGkoQ88x9GkX7EWuOwYO0dE UYSzHCdGONWoeZLfSJOR3C6-knjzKrO Q0ziouJfo-ktbak7v3AH53BtIOiXbT57cKqh- uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6upc61MoydZujux nfLG7hwytqHQG2.ApKq8MVs8Xihn_zcA3 9nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_E&dib_tag=se &keywords=lastra+plexiglass+2+mm&nsd OptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-15	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 20 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9. bf7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_ NuFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHB tZgdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG- kfklAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJ PcLF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA 0sLPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh 4fpVNMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYft Xvvz9LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYO mKVVPPiPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge 2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ88x9GkX7E WuOwYO0dEUYSzHCdGONWoeZLfSJO R3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3AH53B tIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6 upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq 8MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJ N_E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexigl ass+2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1 734702823&sr=8-16	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 30 cm
Polylactic acid (PLA) filament	Flashforge	Black 100102
Power supply	SQUADO	https://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore -stabilizzato-dissipatore-efficienza /dp/B0DMTG6SJD/ref=sr_1_6?dib =eyJ2IjoiMSJ9.1vVze6Zt6fhKCvFb eAOSiRe57N6a1mlBnkLdHiEym4 ugHzueF6_FdOodb3sftCXb5raTg eerMMUbL5KcaI_SDa_2j7s2XohI B01QMJDyq0xQ5Gp3KLIZozDHV fGBdSrvwgyOl-BXSDy_ocZlj2TL5 e21p3K6qpvSaT5yo8WA5tngS93 Eqe8s8D6mjpnnPFrb9RpQpj299Y nNRYgr_YF3NCt3mH0r0FocKcCa LNpKtfGLCbnz_yB-360tp5SAi7A7 cgBf5I4NzQ5iQTTXAG727x0Hml mG-eaFBSJv6M1LPooZiT2aT7dx o_7tzyU6MQ9vAEozXkLTaTTMX RA_svPp96sxp93NRLReI64xpFd S3Zh1y_JPQijbMAIuvuYflhh6JlPB W6-fpW6QXl9v5wNEs_YwjzP9Sf RKxRmchzZhgsK-34XJeaEmjbRq H3piM0Zx.MfPYUNvCEhDBqLDh C-iqBEu-vjIVgsrQmOjeLuGo9YQ& dib_tag=se&keywords=power+sup ply+AC+INPUT%3A+110-220V%2 C+DC+OUTPUT%3A+12V+15A&n sdOptOutParam=true&qid=173471 4722&sr=8-6	Old Prusa i3 power supply (AC INPUT: 110-220 V, DC OUTPUT: 12 V 15 A). Link to commercially available alternative
Pulley 5 mm	VooGenzek	https://www.amazon.it/gp/product/ B0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Bore 5 mm, Width belt space 6 mm
Pulley 8 mm	Yxtaii	https://www.amazon.it/gp/product/ B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Bore 8 mm, Width belt space 6 mm
Ribbon cables	QUARKZMAN	https://www.amazon.it/sspa/click?ie =UTF8&spc=MTo0NDgyNTkwNzU wNjM5NzM5OjE3MzQ3MTQ1OTE6 c3BfbXRmOjMwMDEyMjk4NTMzN TYzMjo6MDo6&url=%2FQUARKZM AN-connettore-Lunghezza-Comput er-confezione%2Fdp%2FB0CQRM DQNG%2Fref%3Dsr_1_15_sspa% 3F__mk_it_IT%3D%25C3%2585M %25C3%2585%25C5%25BD%25 C3%2595%25C3%2591%26crid%3 D3BZ8Q05YA50TX%26dib%3Dey J2IjoiMSJ9.zoYnL2ViiarlDS_7165D ldxu-TTbVbWUVAP3pCybFB-bjGl wSgrpnkMhhsJj3NRo8Mvht8ev5H vGQ-UUpPom12OcOcwyRVXLAR UvMyTm8mpAdZSaOritwHRgwu2 JuW9UoS4jlCbA-gzP2FEAAH47K fFOWN6FEhc5r0YGBcSIsA6_QV6 _LA1k_ifj3c2BFm2Fj8YjW-auz7Yiy ULfZusvGX28S1K5kJdTa_YOwJY YC0Y__s-CCchHKiZgDhFjtFogUz0 Tonob4HQZiO_hkrnm3ixpNj9rgE- hvVq1FK1uD9M.kkP89x1SJ0SLxZ sv3YomYEfmkhpvP4WQf2TtC76K YAE%26dib_tag%3Dse%26keywords %3DCavo%2Bflessibile%2Ba%2Bna stro%2Bpiatto%2Bper%2Bstampant e%2B3D%2Ba%2B10%2Bpin%26n sdOptOutParam%3Dtrue%26qid% 3D1734714591%26s%3Dindustrial %26sprefix%3Dcavo%2Bflessibile %2Ba%2Bnastro%2Bpiatto%2Bper %2Bstampante%2B3d%2Ba%2B10 %2Bpin%252Cindustrial%252C170 %26sr%3D1-15-spons%26sp_csd% 3Dd2lkZ2V0TmFtZT1zcF9tdGY%26psc%3D1	ribbon cable 2651 28AWG 10 pins
Rigid shaft coupling	Gwolf	https://www.amazon.it/gp/product/ B088R8CW5Z/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Coupling from 5 to 8 mm
Rods 4 mm	RS-components	682-810	Diameter 4 mm
Rods 5 mm	Sourcingmap	a14010200ux0214	Diameter 5 mm
Rods 8 mm	RS-components	682-078	Diameter 8 mm
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