Design und Validierung eines volumetrischen Extrusions-Bioprinters für das Bioprinting von löslichem Basalmembranextrakt für die translationale Forschung

Zusammenfassung

Lösliche Basalmembranextrakte sind die am weitesten verbreiteten biologischen Matrices in der Krebsforschung, aber ihr komplexes rheologisches Verhalten erschwert ihr Bioprinting mit kommerziell erhältlichen Bioprinting-Systemen. In dieser Arbeit wird eine maßgeschneiderte Bioprinting-Strategie vorgestellt, um reine Matrixkonstrukte mit guter Formtreue sowohl in Einzel- als auch in mehreren Schichten herzustellen.

Zusammenfassung

In der translationalen Forschung sind 3D-In-vitro-Modelle unerlässlich, um das wissenschaftliche Verständnis und die therapeutische Entwicklung voranzutreiben. Zu diesem Zweck spielen lösliche Basalmembranextrakte (SBMes), die aus Sarkomzellen der Maus gewonnen werden, eine Schlüsselrolle bei der Replikation mechanischer und biochemischer Eigenschaften der In-vivo-Mikroumgebung . Sie sind besonders wertvoll in einer Vielzahl von Forschungsbereichen, vom Tissue Engineering bis hin zu Medikamententests. Insbesondere sind sie in der Krebsforschung von grundlegender Bedeutung, da traditionelle 2D-Zellkulturen, die in diesem Bereich weit verbreitet sind, irreführende Informationen liefern können, da sie die dreidimensionale (3D) Struktur und die Mikroumgebung des Tumors nicht erfassen.

In der Krebsforschung sind effektive 3D-In-vitro-Modelle entscheidend, um die Krebsentwicklung besser zu verstehen und Herausforderungen, wie z. B. Resistenzmechanismen, zu antizipieren. Organoide haben sich als vielversprechende 3D-In-vitro-Modelle herausgestellt, die eine genauere Darstellung der Tumorbiologie bieten. Sie wachsen in SBMes, da sie eine Umgebung schaffen, in der Zellen wachsen und sich selbst zu 3D-Strukturen organisieren können. SBMe stellt jedoch erhebliche Herausforderungen dar, darunter geringe mechanische Eigenschaften und komplexes rheologisches Verhalten, die seinen Einsatz in kommerziell erhältlichen pneumatischen Extrusions-Bioprinting-Systemen verhindern.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein kostengünstiges, volumetrisch kontrolliertes Bioprinting-System und ein spezifisches Protokoll für den Druck von Strukturen mit SBMe entwickelt. Dieses System basiert auf einem volumetrischen Extruder und überwindet die Grenzen traditioneller pneumatisch angetriebener Ansätze. Einmal zusammengebaut und mit einem spezifischen G-Code programmiert, kann das System sowohl reines als auch verdünntes SBMe biodrucken, um sowohl ein- als auch mehrschichtige Konstrukte zu erhalten. Dieser Ansatz bietet eine zuverlässigere und skalierbarere Methode zur Herstellung von 3D-Zellkulturmodellen und ebnet den Weg für eine effektivere Erforschung neuartiger Behandlungen und Medikamententests.

Einleitung

In der translationalen Forschung ist die Erstellung von 3D-In-vitro-Modellen, die die In-vivo-Umgebung genau nachbilden, unerlässlich, um das wissenschaftliche Verständnis und die therapeutische Entwicklung voranzutreiben¹. Eine Schlüsselkomponente bei ihrer Herstellung ist die Verwendung von extrazellulären Matrix-Analoga (ECM), wie z. B. lösliche Basalmembranextrakte (SBMes), die die Komplexität des natürlichen Gewebes besser widerspiegeln. SBMes sind in einer Vielzahl von Forschungsbereichen besonders wertvoll, vom Tissue Engineering bis hin zu Wirkstofftests ^2,3. Insbesondere sind sie in der Krebsforschung von grundlegender Bedeutung, da sie mechanische und biochemische Eigenschaften der Tumormikroumgebung replizieren und so die Entwicklung von Modellen ermöglichen, die das Tumorwachstum, die Metastasierung und das Ansprechen auf die Behandlung besser widerspiegeln.

Trotz erheblicher Fortschritte in den letzten Jahrzehnten versagen viele Therapien weiterhin, was zu häufigem Versagen der Behandlung im klinischen Umfeld führt. Dieses Versagen wird häufig auf Arzneimittelresistenzmechanismen zurückgeführt, die durch ein hohes Maß an Zellheterogenität verursacht werden ^4,5. Effektive In-vitro-Modelle, die in der Lage sind, die Komplexität menschlicher Tumore genau zu rekapitulieren, sind entscheidend, um die Krebsentwicklung besser zu verstehen und dieses Phänomen zu antizipieren.

Traditionelle 2D-Zellkulturen waren grundlegend in der Krebsforschung, können aber zu irreführenden Informationen über die Wirksamkeit von Medikamenten und das Tumorverhalten führen, da sie die 3D-Struktur und Mikroumgebung tatsächlicher Tumore nicht erfassen ^6,7,8. Im Gegensatz dazu haben sich 3D-In-vitro-Modelle als vielversprechende Alternativen herausgestellt, die eine genauere Darstellung der Mikroumgebung und des biologischen Verhaltens von Tumoren bieten, indem sie die 3D-Komplexität nachahmen ^9,10.

In der Krebsforschung werden Organoide häufig als 3D-Modelle zur Untersuchung von Krankheiten und der Wirksamkeit von Medikamenten verwendet, da sie genauere und relevantere Modelle von menschlichen Geweben und Organen liefern. Die Verwendung von SBMe, das aus Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkomzellen gewonnen wird, war entscheidend für die Weiterentwicklung der Krebsforschung^11,12. Es bietet ein gelartiges Substrat, in dem Zellen wachsen, sich vermehren und sich selbst zu organoiden Strukturen organisieren können, um eine ordnungsgemäße Entwicklung und ein ordnungsgemäßes Wachstum zu gewährleisten^13,14.

SBMe stellt jedoch aufgrund seiner einzigartigen und komplexen Eigenschaften eine Reihe von Herausforderungen dar. Als nicht-newtonsches Fluid weist SBMe scherverdünnende Eigenschaften auf, was bedeutet, dass seine Viskosität mit zunehmender Scherspannung abnimmt, was seine Handhabung und Anwendung bei variablen Kräften inkonsistent macht. Darüber hinaus trägt sein thixotropes Verhalten zur Komplexität bei, da es seine Viskosität im Laufe der Zeit wiederherstellen kann, wenn die Scherspannung entfernt wird^15,16. Diese Eigenschaften, zusammen mit der geringen mechanischen Festigkeit (mit Werten des Speichermoduls zwischen 10 Pa und 5.000 Pa je nach Proteinkonzentration) und dem wärmesensitiven Verhalten, verschlimmern diese Herausforderungen und erfordern eine sorgfältige Kontrolle während der Herstellung und Verwendung sowie den Biodruck in reiner Form.

Standardmäßige pneumatisch betriebene Bioprinting-Systeme sind nicht in der Lage, die SBMe-Abgabe richtig zu steuern, da die Anwendung von Druck ein unkontrollierbares Verhalten nach dem Auswurf aus der Spritze verursacht. Er wird von einem Phänomen beeinflusst, das dem für polymere Schmelzen beschriebenen "Spurt"-Effekt ähnelt, bei dem die Durchflussrate abrupt über einen bestimmten kritischen Druckwert 17,18,19 ansteigt. Wie in unserer vorherigen Arbeit¹⁶ berichtet, ermöglicht die volumetrische Dosierstrategie die Entkopplung der SBMe-Extrusion von dem im Dispenser erzeugten Druck, der von den rheologischen Eigenschaften der Matrix, den Arbeitsbedingungen und der Düsengeometrie abhängt. In den letzten Jahren wurden auf dem Markt mehrere Versuche unternommen, das gleiche Prinzip auszunutzen, wobei der Matribot von Corning den Weg weist. Es ermöglicht die Handhabung und Abscheidung von SBMe und anderen temperaturempfindlichen Biotinten dank kontrollierter Temperaturbedingungen. Es kann jedoch teuer sein, was die Zugänglichkeit für kleinere Labore einschränkt.

In unserer vorherigen Arbeit haben wir eine kostengünstige kundenspezifische Alternative vorgestellt - ein volumetrisch angetriebenes Bioprinting-System¹⁶. Diese Version basierte auf einem modifizierten 3D-Drucker der Einstiegsklasse mit einem benutzerdefinierten 3D-gedruckten Extruder. Trotz seiner Wirksamkeit im Bioprinting wies es einige Einschränkungen bei der Wiederholbarkeit des Drucks auf. Da er von einem Einsteiger-3D-Drucker abgeleitet war, hatte er einige Probleme mit den Z-Bewegungen und dem Auto-Homing. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, haben wir eine weiterentwickelte Version unseres kundenspezifischen, kostengünstigen volumetrischen Dosiersystems und ein spezifisches Protokoll für das Bioprinting von Strukturen mit SBMe entwickelt.

Hier stellen wir Protokolle für den Aufbau und die Nutzung dieses Systems zur Verfügung. Es besteht aus einem kundenspezifischen volumetrisch gesteuerten Extruder, der auf unserer vorherigen Studie¹⁶ basiert, einem Bioprinter-Gehäuse und einem Steuerungssystem. Produktion und Montage erfolgen für jedes Modul. Wenn das System mit einer speziellen gcode-Datei zusammengesetzt und programmiert wird, die der Protokollbeschreibung für die Matrixhandhabung folgt, ist es in der Lage, reine oder verdünnte Konstrukte mit dem SBMe mit guter Formtreue sowohl in Einzel- als auch in mehreren Schichten zu drucken.

Protokoll

1. 3D Druck und Montage von volumetrischen Biodruckern

1. Bereiten Sie die Komponenten des Bioprinters vor und drucken Sie sie in 3D.
   1. Laden Sie die *. STL-Designdateien aus der Zusatzdatei 1.
   2. Last*. STL-Datei in der proprietären Slicing-Software, um die Ausrichtung der Teile auf der Druckplatte und alle für den 3D-Drucker erforderlichen Optionen zu definieren. Drucken Sie die Teile mit Polymilchsäure (PLA) mit Optionen mittlerer Qualität (0,4 mm Düsengröße, 1,75 mm Filamentdurchmesser, 220 °C Extrudertemperatur, 50 °C Druckbettplattentemperatur, 0,2 mm Schichthöhe, 300 mm/s Druckgeschwindigkeit).
      HINWEIS: Die Optionen für mittlere Qualität können je nach dem Drucker, der zum Drucken der Teile verwendet wird, unterschiedlich sein.
   3. Löse die gedruckten Teile vom 3D-Druckerbett. Entfernen Sie die gedruckten Stützstrukturen, falls vorhanden, und polieren Sie die Oberflächen, falls erforderlich.
2. Montieren Sie den Extruder (Abbildung 1).
   1. Setzen Sie zwei Linearkugellager (LM4UU) in die vertikalen Löcher des Schiebeblocks ein. Setzen Sie ebenfalls eine Gewindemutter T8 in das hintere Mittelloch ein und befestigen Sie diese mit vier Schrauben (M3x10).
   2. Befestigen Sie eine starre Wellenkupplung am Schrittmotor und befestigen Sie diese dann mit vier Schrauben (M3x6) am Motorgehäuse des Extruders.
      HINWEIS: Richten Sie den Schrittmotor entsprechend der Nut im Extrudermotorgehäuse aus, um die richtige Positionierung der Buchse für Kabel zu ermöglichen.
   3. Befestigen Sie den in Schritt 1.2.2 montierten Schrittmotor mit der zuvor eingeschobenen starren Wellenkupplung an einer Leitspindel T8 (150 mm). Stellen Sie sicher, dass jeder Block mit den Stellschrauben richtig befestigt ist.
   4. Befestigen Sie ein Pendelflanschlager (8 mm Innendurchmesser) mit zwei Schrauben (M4x8) an der Unterseite des Extruderbodens.
   5. Setzen Sie zwei Kugellager (4 x 9 x 4 mm) in die dafür vorgesehenen Löcher oben auf dem Extruderboden und die anderen beiden in die Löcher im unteren Bereich ein.
   6. Führen Sie das zusammengebaute Teil (Schritt 1.2.1) durch den Hohlraum im oberen Teil der Struktur in den Extruderboden ein. Verbinden Sie die vier Kugellager (Schritt 1.2.5) mit zwei 4-mm-Stangen, eine für jede Seite. Lassen Sie die Stangen durch die beiden Linearkugellager im montierten Teil in Schritt 1.2.1 laufen.
      HINWEIS: Es ist auch möglich, die Stangen zuerst auf die oberen beiden Kugellager zu setzen und dann in den Extruderboden zu stecken, bis sie das untere Kugellager erreichen und alles in den definierten Schlitzen gesichert ist.
   7. Führen Sie das in Schritt 1.2.3 aufgebaute Teil in das mittlere Loch des Extruderbodens ein. Drehen Sie die Leitspindel, um die Gewindemutter zu passieren und das selbstausrichtende Flanschlager zu erreichen. Verwenden Sie die Stellschrauben im Bauteil, um die Leitspindel zu verriegeln, und zwei Schrauben (M3x8), um das Extrudermotorgehäuse oben auf dem Extrudersockel zu befestigen.
   8. Verwenden Sie zwei weitere Schrauben (M3x40) und M3-Muttern, um den Flanschhalter des Spritzenzylinders am unteren Teil des Extruderbodens zu befestigen, um den Flansch des Spritzenzylinders zu verriegeln (Einführrichtung von oben nach unten). Verwenden Sie zwei weitere Schrauben (M3x30) und M3-Muttern, um den Spritzenkolbenhalter an den oberen Löchern des Schieberblocks zu befestigen (Einsteckrichtung von unten nach oben), um den Kolbenflansch zu verriegeln.
   9. Setzen Sie zwei Schrauben (M4x80) in zwei Federn ein und lassen Sie sie durch die Löcher im unteren Teil des Extruderbodens und des Spritzenblocks gleiten. Schrauben Sie die Muttern so fest, dass der Platz für die Spritze frei bleibt, um ein Verrutschen des Spritzenblocks zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Schrauben müssen von hinten nach vorne gehen.
3. Montieren Sie die X-Achse (Abbildung 2).
   1. Setzen Sie vier Linearkugellager (LM8UU x 24 mm) in das X_Left_Block ein und X_Right_Block Teile in die oberen und unteren Löcher, jeweils zwei. Befestigen Sie auch zwei Gurtblöcke mit Schrauben (M2x10) an den Blöcken X rechts und X, so dass Platz für den Gurt bleibt.
   2. Setzen Sie zwei Kugellager (5 x 16 x 5 mm) in die mittleren Löcher X_Right_Block ein, eines auf jeder Seite. Setzen Sie eine Riemenscheibe (Bohrung 5 mm) in den inneren Hohlraum X_Right_Block und verbinden Sie die beiden Kugellager mit einer 5-mm-Stange (35 mm Länge), so dass sie durch die Riemenscheibe geführt wird.
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Montage eine längere Stange, um eine bessere Handhabung zu ermöglichen. Nachdem Sie die Stücke an Ort und Stelle positioniert haben, schneiden Sie den Stab in der gewünschten Länge ab.
   3. Befestigen Sie einen Endschalter mit zwei Schrauben (M3x8) am X_motor_housing. Setzen Sie den NEMA 17-Motor in das Motorgehäuse ein und befestigen Sie die X_block_1 Abdeckung mit vier Schrauben (M3x8) am Motorgehäuse und am Motor.
   4. Befestigen Sie eine Riemenscheibe (Bohrung 5 mm) am Motor und arretieren Sie diese mit Stellschrauben und schrauben Sie dann das montierte Teil in Schritt 1.3.3 mit vier Schrauben (M5x8) zu X_block_1 zusammen. Befestigen Sie auch einen Endschalter an der Unterseite des X_Left_Block mit zwei Schrauben (M3x8).
      HINWEIS: Der Außendurchmesser der Riemenscheiben in den Schritten 1.3.2 und 1.3.4 muss gleich sein.
   5. Setzen Sie zwei Linearkugellager (LM8UU x 45 mm) in die Löcher oben und unten am X_slider ein.
   6. Verbinden Sie die montierten Teile in den Schritten 1.3.2 und 1.3.4 mit zwei 8 mm Stangen (200 mm Länge) und lassen Sie sie in Schritt 1.3.5 durch das montierte Teil laufen.
      HINWEIS: Schneiden Sie die Stangen vor dem Zusammenbau in die gewünschte Länge ab.
   7. Ein Gurtende mit dem Gurtblock und zwei Schrauben (M2x8) am X_slider_belt_connection verriegeln. Den Riemen im montierten Teil 1.3.4 um die Riemenscheibe führen, dann im montierten Teil 1.3.2 um die Riemenscheibe führen und das andere Riemenende mit dem zweiten Riemenblock und zwei weiteren Schrauben (M2x8) an der X_slider_belt Verbindung befestigen. Stellen Sie sicher, dass der Riemen richtig angezogen ist, um die richtige Bewegung zu erhalten.
      HINWEIS: Während dieses Schritts muss die X_slider in Richtung eines Endes der X-Achsenstruktur verschoben werden, um Interferenzen zu vermeiden.
   8. Schrauben Sie den X_slider_belt_connection mit einer Schraube (M6x20) an den X_slider.
   9. Verbinden Sie den Extruder mit dem X_slider und befestigen Sie ihn mit vier Schrauben (M5x10).
4. Montieren Sie die Y-Achse (Abbildung 3).
   1. Befestigen Sie die Befestigungshalterung mit vier Schrauben (M3x10) und vier Muttern an der oberen Rückseite des Bioprinters.
      HINWEIS: Die Position der Befestigungshalterung kann angepasst werden, um die richtige Spannung des Riemens zu erreichen und das Einsetzen des Schrittmotors zu ermöglichen.
   2. Setzen Sie den Schrittmotor in den Befestigungswinkel ein und verschrauben Sie ihn mit vier Schrauben (M3x8). Als nächstes setzen Sie eine Riemenscheibe (Bohrung 5 mm) auf die Kurbelwelle und fixieren diese mit Stellschrauben.
      HINWEIS: Die Riemenscheibe kann an der Kurbelwelle befestigt werden, bevor der Motor in die Befestigungshalterung eingesetzt wird, um Interferenzen zwischen den Komponenten zu vermeiden.
   3. Platzieren Sie zwei Schaltrollen (8 mm Innendurchmesser) an der vorderen 8 mm Stange und verriegeln Sie sie an den beiden Stangen (2,5 cm vom Ende entfernt). Wiederholen Sie diesen Vorgang für die hintere Stange und fügen Sie eine weitere Riemenscheibe hinzu, die 5 cm vom rechten Ende entfernt ist.
   4. Befestigen Sie 12 selbstausrichtende Flanschlager (8 mm Durchmesser) an den inneren oberen Teilen des Biodruckers.
   5. Verbinden Sie die beiden vorderen Biodruckerteile und die beiden oberen hinteren Biodruckerteile (Richtung links/rechts) mit den in Schritt 1.4.3 montierten Stangen und verriegeln Sie sie mit den Pendelflanschlagern (8 mm Durchmesser). Befestigen Sie die beiden zusammengebauten Teile an allen Verbindungsstellen mit Schrauben (M3x8).
      HINWEIS: Wenn Sie die hintere Stange positionieren, platzieren Sie einen geschlossenen Riemen, der die Riemenscheibe am Schrittmotor mit der inneren Riemenscheibe an der Stange verbindet.
      HINWEIS: Befestigen Sie den Schrittmotor, indem Sie die Muttern festziehen, um sicherzustellen, dass sich der Motor nicht bewegt und der Riemen richtig gespannt wird.
   6. Verbinden Sie die beiden montierten Teile in Schritt 1.4.5 mit vier 8-mm-Stangen. Lassen Sie die Stangen durch die im Bauteil 1.3 vorhandenen Linearkugellager gleiten und verriegeln Sie sie mit den Pendelflanschlagern (8 mm Durchmesser). Befestigen Sie die beiden zusammengebauten Teile an allen Verbindungsstellen mit Schrauben (M3x8).
   7. Befestigen Sie ein offenes Bandende mit dem Gurtblock am oberen Teil des X_block_1 und wiederholen Sie diesen Vorgang zum X_block_2. Führen Sie den Riemen links um die hinteren Riemenscheiben, dann um die vordere Riemenscheibe und befestigen Sie das andere Riemenende wieder mit einem weiteren Riemenblock an der X_block_1. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das zweite Band.
      HINWEIS: Die Gurte müssen richtig angezogen werden, um die richtige Bewegung zu erhalten, und sie müssen die gleiche Länge haben, um ein Verbiegen oder Interferenzen bei Y-Bewegungen zu vermeiden.
5. Montieren Sie die Z-Achse (Abbildung 4).
   1. Schrauben Sie die unteren Gehäuseteile des Bioprinters (M4x8) zusammen.
   2. Befestigen Sie ein Pendelflanschlager (8 mm Durchmesser) am Boden der Unterseite des montierten Teils in Schritt 1.5.2.
   3. Befestigen Sie zwei Flansch-Linearkugellager (LMH8UU) mit Schrauben (M3x8) an den äußeren Löchern im Z_slider und eine Gewindemutter in der mittleren Bohrung.
   4. Befestigen Sie einen Endschalter mit zwei Schrauben (M3x8) an der Z_plane linken Seite.
   5. Befestigen Sie den Schrittmotor an einer starren Wellenkupplung. Befestigen Sie einen Schrittmotor mit vier Schrauben (M3x20) am Z_block und eine Gewindestange an der starren Wellenkupplung. Stellen Sie sicher, dass jeder Block mit den Stellschrauben richtig befestigt ist.
   6. Verbinden Sie das in Schritt 1.5.5 montierte Teil mit zwei 8-mm-Stäben mit der Bioprinter-Basis. Lassen Sie sie in Schritt 1.5.3 durch das zusammengebaute Teil laufen.
   7. Befestigen Sie den Z_block mit zwei Schrauben (M5x8) an der Rückwand.
   8. Verbinden Sie Z_plane mit vier Schrauben (M3x25) mit Z_slider. Führen Sie sie von oben nach unten in die Z_plane Löcher ein, führen Sie die Feder zwischen Z_plane und Z_slider und befestigen Sie sie mit Muttern. Passen Sie die Federspannung an, um die Ebene zu nivellieren.
   9. Befestigen Sie vier verstellbare Füße unter der Biodruckerstruktur in der jeweiligen Kavität. Nivellieren Sie den Biodrucker, indem Sie die Füße anpassen.
   10. Verbinden Sie das montierte Teil mit dem montierten Teil in Schritt 1.4.6 mit acht Schrauben (M4x12).
   11. Befestigen Sie zwei Scharniere an der Vorderseite der Struktur an den entsprechenden Stellen und einen Magneten am rechten Teil an der entsprechenden Stelle mit Schrauben (M2x8). Verschrauben Sie die Gesamtstruktur mit 2 mm transparenten Plexiglasplatten, um die Öffnungen zu verschließen.
       HINWEIS: Schrauben Sie die vordere Plexiglasscheibe an die Scharniere und setzen Sie eine weitere Schraube in Übereinstimmung mit dem Magneten ein, um eine Haustür zu erhalten.
6. Zeigen Sie die Baugruppe an (Abbildung 5A).
   1. Lassen Sie die mit dem Display verbundenen Drähte durch das untere Loch führen und befestigen Sie das Display mit vier Schrauben (M3x3) am Displaygehäuse.
      HINWEIS: Dieser Durchgang muss ohne die Abdeckung des LCD-Knopfes erfolgen. Er könnte sich nach der Befestigung am Displaygehäuse auf dem vorinstallierten Drehknopf befinden.
   2. Verschließen Sie das Gehäuse mit dem Deckel mit vier Schrauben (M2x6).
   3. Setzen Sie die SD-Karte in den linken Steckplatz ein.
   4. Lassen Sie die Drähte durch das Loch an der Oberseite der Struktur führen. Schrauben Sie das zusammengebaute Teil mit zwei Schrauben (M3x8) an der Oberseite des Biodruckers fest.
      HINWEIS: Alle Drähte (Motoren, Endschalter und Anzeige) verlaufen nahe der Wand und treten aus dem unteren linken Loch aus. Sie werden mit Kabelklemmen befestigt, um Eingriffe in die mechanischen Teile zu vermeiden.
7. Elektronik-Baugruppe (Abbildung 5B)
   1. Befestigen Sie die Buchse mit zwei Schrauben (M3x10) am äußeren Teil des Elektronikgehäuses.
   2. Befestigen Sie das Mainboard mit vier Schrauben (M3x10) am Innenteil des Elektronikgehäuses.
   3. Befestigen Sie den unteren Teil des Netzteils mit vier Schrauben (M3x8) am Innenteil des Elektronikgehäuses.
   4. Führen Sie die Drähte durch das kreisförmige Loch an der Abdeckung und verbinden Sie sie mit dem Motherboard. Verschließen Sie das Elektronikgehäuse mit seiner Abdeckung mit vier Schrauben (M3x10).
      HINWEIS: Es ist möglich, das Elektronikgehäuse an die Struktur des Biodruckers anzuschließen oder es bei kleinen Arbeitsräumen auf dem Schreibtisch zu lassen.
      Abbildung 6 zeigt alle elektronischen Kabelverbindungen. Sie können je nach verwendetem 3D-Drucker-Motherboard leicht unterschiedlich sein.

2. Softwareeinstellung und Gcode-Generierungsprozess

1. Vorbereitung der Einstellungen der Slicing-Software
   1. Öffnen Sie die Slicing-Software.
      HINWEIS: Die Anweisungen können je nach verwendeter Software oder Version unterschiedlich sein.
   2. Melden Sie sich bei der Plattform an.
   3. Gehen Sie zu den Einstellungsoptionen . Wählen Sie den Drucker aus, und fügen Sie dann einen nicht vernetzten Drucker hinzu. Wählen Sie einen benutzerdefinierten FFF-Drucker aus und geben Sie im Feld Druckername den Namen für den Drucker ein. Klicken Sie auf Hinzufügen.
      HINWEIS: Wenn es sich um die erste Softwareinstallation handelt, wird das Fenster Drucker hinzufügen nach der Anmeldung automatisch geöffnet.
   4. Ändern Sie im Fenster Maschineneinstellungen die Standardeinstellungen x, y, z auf 176, 120, 45 mm.
   5. Deaktivieren Sie die Option Beheiztes Bett, wenn sie nicht bereits deaktiviert ist.
   6. Fügen Sie in den Bereichen "Start-G-Code" und " End-G-Code" die Textzeilen ein, die in den Dateien mit den Titeln "JoVE_Starting_G-code.txt" und "JoVE_Ending_G-code.txt" in der Zusatzdatei 2 gemeldet sind.
      1. Den Wert 150 in der Zeile 'M92 E150' in der Start-G-Code-Datei entsprechend der anzuwendenden Durchflussmenge ändern. Schätzen Sie den richtigen Wert mit der folgenden Formel:
         
         Dabei ist Q die gewünschte Durchflussrate [μL/min].
         HINWEIS: Diese Formel wurde experimentell mit dem beschriebenen System erhalten. Anders kann es sein, wenn es Änderungen an den mechanischen oder elektrischen Komponenten gibt. Eine mögliche Alternative könnte darin bestehen, den Wert entsprechend dem verwendeten System zu fixieren und einen benutzerdefinierten MATLAB-Code zu erstellen, um die gewünschte gcode-Datei zu generieren.
   7. Ändern Sie den Wert für Kompatibler Materialdurchmesser im Bereich Extruder 1 auf 1,75 und schließen Sie dann.
   8. Gehen Sie zum Marktplatz, wählen Sie das Plugin für die Z-Offset-Einstellung aus und installieren Sie es. Starten Sie am Ende des Vorgangs die Software neu, um den Vorgang abzuschließen. Wählen Sie nach dem erneuten Öffnen Einstellungen | Drucker | Drucker verwalten in der Symbolleiste. Klicken Sie im Fenster "Einstellungen " auf "Einstellungen " und aktivieren Sie alle Optionen, indem Sie die Option "Alle markieren" auswählen und die Option "Schließen" auswählen.
   9. Konfigurieren Sie das Setup, indem Sie im Bühnenmenü, das das Konfigurationsfenster enthält, auf die Druckeinstellungen (dritte Schaltfläche) klicken. Geben Sie den Prozentsatz der Füllung im aktuellen Druckprofil im Konfigurationsfenster ein. Wählen Sie die Schaltfläche Benutzerdefiniert, um die aktuellen Druckeinstellungen und das Profil Fein im Dropdown-Menü zu ändern. Stellen Sie die Druckgeschwindigkeit auf 10 mm/s ein.
2. GCode-Vorbereitung
   1. Laden Sie die *. STL-Designdatei mit dem Titel "JoVE_Square" aus der ergänzenden Datei 2 dieses Papiers.
   2. Last. STL-Datei in die Slicing-Software.
   3. Positionieren Sie das Werkstück auf der ebenen Fläche und bewegen Sie es zu den Koordinaten 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Erstellen Sie zwei Kopien, indem Sie auf das Symbol klicken. STL-Dateiname in der Objektliste und Auswahl der Option Ausgewählte multiplizieren. Verschieben Sie sie auf die folgenden Koordinaten: 16, 42,5, 0 mm und -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      HINWEIS: Es ist nicht möglich, die Druckreihenfolge automatisch zu definieren, es sei denn, sie wird direkt in der endgültigen Gcode-Datei manuell geändert. Für eine 6-Multiwell-Platte sind Koordinaten definiert.
   4. Gehen Sie im Bühnenmenü zu den Druckeinstellungen. Geben Sie im Abschnitt Wände den Wert 0 als Anzahl der Wandlinien ein. Geben Sie 0 als Wert für die Dicke von Obere/Untere im Abschnitt Oben/Unten ein. Geben Sie im Füllungsbedienfeld die folgenden Werte ein: Füllmuster: Raster, Abstand der Fülllinie: 5 mm, Richtungen der Fülllinien: [0].
      HINWEIS: Es ist möglich, die Verfahrgeschwindigkeit im Abschnitt Druckgeschwindigkeit zu reduzieren, um die Genauigkeit der X-Achse zu verbessern.
   5. Deaktivieren Sie das Zurückziehen im Abschnitt "Reisen" und drucken Sie die Kühlung im Abschnitt "Kühlung ".
   6. Wählen Sie im Abschnitt "Plattenhaftung erstellen " die Option "Keine " als "Plattenhaftungstyp erstellen" aus, während Sie im Abschnitt "Spezialmodi " die Option "Einzeln oder einzeln " als Drucksequenz auswählen.
   7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Slice, um den G-Code zu generieren.
   8. Öffnen Sie die G-Code-Datei mit der Notepad-Anwendung und entfernen Sie die Zeilen "M104 S200", "M105" und "M109 S200" in Zeile 12 nach dem Satz "; Generiert mit Cura_SteamEngine 4.9.0".
   9. Fügen Sie "G1 Z25" vor der folgenden Zeile "; NETZ: JoVE_Square_rev. STL(6)" und teilen Sie den nächsten in zwei Teile auf: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 und (2) G1 Z0.3.
      HINWEIS: X- und Y-Koordinaten sind nur Beispiele.
   10. Ändern Sie den Z-Wert in jeder Zeile nach " auf Z25 . TIME_ELAPSED" kommentieren jede noch so kleine Schichtanweisung jedes Stücks.
       HINWEIS: Um nur ein einzelnes Stück zu drucken, ist Schritt 2.3.10 nicht erforderlich.

3. Quell-/Abbautest

1. Vorbereitende Schritte
   1. Nehmen Sie eine sterile 1-ml-Glasspritze (TLL-Terminal) und eine sterile konische 25-G-Düse. Montieren Sie sie und stellen Sie die zusammengebaute Spritze in den Kühlschrank.
   2. Legen Sie die Pipettenspitzen und das SBMe-Matrizenfläschchen am Tag vor dem Experiment über Nacht in den Kühlschrank.
   3. Drucken Sie drei PLA-Gitter (Φ = 20 mm) mit einer kreisförmigen Porengröße von 1 mm x 1 mm und einer seitlichen vertikalen Säule, um sie zu greifen.
2. Drucken von Konstrukten
   1. Nehmen Sie die zusammengebaute Spritze und das SBMe-Matrixfläschchen aus dem Kühlschrank. Aspirieren Sie 500 μl der SBMe-Matrix und legen Sie sie für 15 Minuten in den Inkubator, um die Gelierung zu ermöglichen.
   2. Nehmen Sie die Spritze aus dem Inkubator und legen Sie sie in den Druckkopf des Bioprinters. Stellen Sie sicher, dass der Spritzenkolben richtig mit dem Schubblock in Kontakt steht.
   3. Befestigen Sie den Spritzenbefestigungskolben und den Flansch des Spritzenzylinders mit den Kolbenhalterungen der Spritze und den Spritzenzylinder mit der Spritzenklemme.
   4. Kalibrieren Sie das System mit der Auto-Home-Einstellung im Bioprinter-Menü, um den Ursprung der Achsen automatisch zu erkennen.
   5. Bewegen Sie den Extruder mit dem Befehl Achsen verschieben , bis die Nadelspitze das PLA-Gitter berührt, um Z0 manuell zu definieren.
   6. Starten Sie den Druck, indem Sie die zu druckende G-Code-Datei im Bioprinter-Menü auswählen.
   7. Legen Sie die Multiwell-Platte für 2 Minuten in den Inkubator, damit sich der SBMe nach der Extrusion absetzen kann.
   8. Nehmen Sie die Multiwell-Platte und geben Sie 2 ml Zellkulturmedium in die drei Vertiefungen, die die biogedruckten Gitter enthalten. Legen Sie die Multiwell-Platte in den Inkubator.
   9. Nehmen Sie zu jedem Zeitpunkt (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 und 14 Tage) jedes Gitter von der Platte und trocknen Sie es mit sauberem Papier, um das überschüssige Medium und Gewicht auf einer Waage zu entfernen. Setzen Sie das Gitter wieder in die Platte und dann in den Inkubator ein, um das Experiment fortzusetzen. Schätzen Sie das Quellverhältnis und die Abbaurate mit den folgenden Formeln:
      
      Dabei ist W_t das Gewicht der Konstrukte zu jedem Zeitpunkt und W_t0 das Gewicht der getrockneten Konstrukte.
      
      Dabei ist W_i das Gewicht am Ende des Quelltests.

4. Bioprinting von SBMe-Konstrukten

1. Vorbereitende Schritte
   1. Nehmen Sie eine sterile 1 mL Glasspritze (TLL-Terminal) und eine sterile konische 25 G Düse und montieren Sie sie unter der Biosicherheitswerkbank. Lege sie in eine sterile Box im Kühlschrank.
   2. Legen Sie die Pipettenspitzen und das SBMe-Matrizenfläschchen am Tag vor dem Experiment über Nacht (4 °C auf Eis) in den Kühlschrank.
   3. Geben Sie 20 μl Trypanblau in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
   4. Stellen Sie die Zentrifuge auf 345 × g, 4 °C ein und lassen Sie sie abkühlen (~3-4 h).
   5. Nehmen Sie 5 mL Wasser in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen als Waage für die Zentrifuge.
   6. Phosphatpufferlösung (PBS) und Medien in einem Wasserbad erwärmen.
      HINWEIS: Das Zellkulturmedium besteht aus vollständigem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), Penicillin-Streptomycin und L-Glutamin ergänzt wird.
   7. Stellen Sie den Biodrucker unter die biologische Sicherheitswerkbank. Unter UV-Licht 20 min sterilisieren.
      HINWEIS: Um das ordnungsgemäße Funktionieren des Biodruckers zu gewährleisten, führen Sie die Auto-Home-Funktion aus und überprüfen Sie die korrekten Bewegungen jeder Achse und die Funktion der Endschalter.
2. Bioink-Vorbereitung
   1. Nehmen Sie den Kolben in den Inkubator mit handelsüblichen murinen Prostatakrebszellen und stellen Sie ihn unter die Biosicherheitswerkbank.
   2. Nehmen Sie das Zellkulturmedium aus dem Kolben.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll angegebenen Volumina gelten für T25-Zellkulturflaschen.
   3. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 mL PBS und aspirieren Sie es dann.
   4. Fügen Sie 500 μl Trypsin hinzu und stellen Sie den Kolben für 5 Minuten in den Inkubator, damit sich die Zellen von der Platte lösen können.
   5. Überprüfen Sie die Zellen auf Trypsinisierung und klopfen Sie gegebenenfalls vorsichtig auf den Kolbenboden.
   6. 4,5 ml Medium in den Kolben geben. Waschen Sie die Platte sorgfältig, um sicherzustellen, dass alle abgelösten Zellen im Zellkulturmedium schwimmen.
   7. Saugen Sie das Medium an und geben Sie es in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
   8. Nehmen Sie ein 20 μL Aliquot und mischen Sie es mit dem Trypanblau-Aliquot. Geben Sie dann 10 μl dieser Mischung in die Zellzählkammer, um die lebenden Zellen nach der folgenden Formel zu zählen:
      
      wobei f der Verdünnungsfaktor für Trypanblau-Suspension (Verhältnis 1:1) ist; V ist das Zellsuspensionsvolumen [ml].
   9. Die restliche Zellsuspension wird 5 min lang (345 × g, 4 °C) zentrifugiert.
   10. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in der kalten SBMe-Matrix mit der gewünschten Zelldichte (10,⁶ Zellen/ml)
   11. 800 μl der Matrixsuspension, die Zellen enthält, mit der kalten Spritze aspirieren.
   12. Entfernen Sie die Luftblasen, die in der Spritze eingeschlossen sein könnten, und legen Sie sie in eine sterile Schachtel. Legen Sie es dann für 15 Minuten in den Inkubator, um die Gelierung zu ermöglichen.
3. Bioprinting-Verfahren
   1. Nehmen Sie die Spritze aus dem Inkubator und stecken Sie sie in den Druckkopf des Bioprinters. Stellen Sie sicher, dass der Spritzenkolben richtig mit dem Schubblock in Kontakt steht.
      HINWEIS: Das Modell und das Volumen müssen mit der für den Versuch verwendeten Spritze übereinstimmen.
   2. Befestigen Sie den Spritzenbefestigungskolben und den Flansch des Spritzenzylinders mit den Kolbenhalterungen der Spritze und den Spritzenzylinder mit der Spritzenklemme.
   3. Verwenden Sie M4-Muttern am unteren Teil des Extruders, um den Federdruck einzustellen und die Spritze zu verriegeln.
      HINWEIS: Die Schritte 4.3.1 bis 4.3.4 sind in Abbildung 7 dargestellt.
   4. Kalibrieren Sie das System mit der Auto-Home-Einstellung im Bioprinter-Menü, um den Ursprung der Achsen automatisch zu erkennen.
      HINWEIS: Dieser Abschnitt gewährleistet immer die richtigen Anfangseinstellungen, unabhängig von der Art des Trägers, den wir für den Druck verwenden.
   5. Platzieren Sie eine 6-Multiwell-Platte auf der Druckebene.
   6. Bewegen Sie den Extruder mit dem Befehl Achsen verschieben , bis die Nadelspitze den Boden der Vertiefung berührt, um Z0 manuell zu definieren.
   7. Wählen Sie die gcode-Datei im Menüpunkt des Bioprinter-Menüs aus und starten Sie den Druck. In jede Vertiefung wird ein quadratisches Gitter mit sechs Schichten (2,6 cm Seite) gedruckt.
   8. Verwenden Sie nach dem Bioprinting-Prozess ein inverses Mikroskop, um sicherzustellen, dass der Druckprozess erfolgreich war, und legen Sie die Multiwell-Platte für 2 Minuten in den Inkubator, damit sich das SBMe nach der Extrusion absetzen kann.
   9. Geben Sie 2 ml Zellkulturmedium in jede Vertiefung.
      HINWEIS: Das Volumen muss die Konstrukte vollständig abdecken.

Ergebnisse

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für das Bioprinting von Konstrukten aus SBMe mit einem kostengünstigen, maßgeschneiderten, volumetrischen Bioprinter vor. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung und 3D-Druck * zur Verfügung. STL-Dateien zum Aufbau des Systems und wir demonstrieren den potenziellen Einsatz in der Krebsforschung, indem wir ein- und mehrschichtige Strukturen drucken. Jedes 3D-gedruckte Bauteil wurde vor dem Zusammenbau ordnungsgemäß von Stützstrukturen ...

Diskussion

In der translationalen Forschung sind SBMes in einer Vielzahl von Forschungsbereichen besonders wertvoll, vom Tissue Engineering bis zur Wirkstofftestung ^2,3. Insbesondere sind sie in der Krebsforschung von grundlegender Bedeutung, da sie mechanische und biochemische Eigenschaften der Tumormikroumgebung replizieren und so die Entwicklung von Modellen ermöglichen, die das Tumorwachstum, die Metastasierung und das Ansprechen auf d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-multiwell plate	Sigma-Aldrich	CLS351143
3D FDM printer	Flashforge	Adventurer 5M Pro
3D printer Motherboard	GEETECH	GT2560 REV A+
6-multiwell plate	Sigma-Aldrich	M8687
AC socket	HiLetgo	https://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket -Holder-Switch/dp/B0814PT3YG/ref=sr_1_1?__ mk_it_IT=%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=2TRIBP34VJ61A &dib=eyJ2IjoiMSJ9.zW6_VmeiudR I4yMpjJqJm7OdeoctTKW2mrEzml BAyJVa1hkM4PiJT3pLY0mXdxm1 AZQxa2_f5J4q4d5v3vUeqLkjJ6BM kWHAoeEfbEQJNuZaQ3NjmUlqWy _1AfQpnRp4VqJ2m3bkWsChztCa Ok-ZdQJlobGxJaMKg7WbV352 Hyo.0tEw2GYoPQJ4SdNYXO1XM Jrl2yXMvRey55Hj7GhISkk&dib_ tag=se&keywords=AC+socket+HiLetgo&nsdOpt OutParam=true&qid=1734702097&sprefix=ac+ socket+hiletgo%2Caps%2C173&sr=8-1	15 A 250 V
Adjustable feet	EXIN DEHCEN	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CPLTSNQB/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Height 27-40 mm
Ball bearing 4 mm	QUARKZMAN	684ZZ	Dimensions 4 x 9 x 4 mm
Ball bearing 5 mm	XiKe	625-2RS	Dimensions 5 x 16 x 5 mm
Belt closed	Turmberg3D	https://www.amazon.it/gp/product/ B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Width 6 mm
Belt open	Fajoeda	https://www.amazon.it/gp/product/ B09QCTVPTH/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Width 6 mm
Bioprinting nozzle	Fisher Scientific	17780789	Corning Standard Conical Bioprinting Nozzles
Bürker Cell Counting chamber	GLASWARENFABRIK KARL HECHT	40443001
Centrifuge	Eppendorf	5702 R
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	CLS431470	15 mL
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	EP0030120086	1.5 mL
Display	Sigma-Aldrich	BR718905
DMEM	Gibco Thermofisher	11965092
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Flanged linear ball bearing	Sourcing map	https://www.amazon.it/gp/product/ B07S6LZHM7/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	LMF8UU
Glass syringe	Fisher Scientific	11520062	Hamilton GasTight 1 mL (TLL terminal)
Hinges	YASQZ	https://www.amazon.it/gp/product/ B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Incubator	Fisher Scientific	15481374	Eppendorf Galaxy 48 R CO2 Incubator, 48 L, Stainless Steel
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti2-U
Jumper wires	Iverntech	https://www.amazon.it/Iverntech-XH2 -54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/ B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_ mcx_views_0_image?pd_rd_w=cb2r J&content-id=amzn1.sym.57a351cf- ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209%3 Aamzn1.symc.ca948091-a64d-450e- 86d7-c161ca33337b&pf_rd_p=57a3 51cf-ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209 &pf_rd_r=YHY9RFYZJK7PYAY2RXX D&pd_rd_wg=7WkXB&pd_rd_r=8239 66cb-4977-48ce-b095-0dcedf8c372f& pd_rd_i=B07Q12B6K5&th=1
LCD unit	Paradisetronic.com	https://www.amazon.it/Display-controller -conduttori-adattatore-stampante/dp/B01 DUR4064/ref=sr_1_9?__mk_it_IT=%C3 %85M%C3%85%C5%BD%C3%95%C3 %91&crid=1OAHVIIRA16X3&dib=eyJ2Ij oiMSJ9.07V2Jf7RzJjTUlIuFobUJFjUzG4 8633KkdcMXSEfnWLRX41d5vAF7xPBJ maniVxDoXecfihZzzOXlP3v-e29cUjoGLf GDyv5DoDVwp7ndohNTYvYzoi3gWkF- Hsd2YbT7tjb1Dra1afqSn26CbFdEvJ84y qyX7Gi3-7DHh8yMwdd6_7quiuW_mjsm w1nu0YQG68GZ0XM7unOsvyddQ__R_ 3dndxb3mOjgGjklEgu_KEbZJPOZDIdSo oU3nrrKHj56hCfk9ACwYpB80QGCbTPK 0p-fE0g9h02WPmtHV38UU3m5AdZsTQ HqvnVlJg703qGT-8ze8fQItw2rtbgl_J86H RMReJOhVLQBkqNwxh57CQ.yNbeFmZ ZBEUhadz2dQa8NxpZD9g4P6ighRU_97 yxgnw&dib_tag=se&keywords=display% 2B3D%2Bprinter%2Bprusa%2Bi3&nsdO ptOutParam=true&qid=1734714093&s= industrial&sprefix=display%2B3d%2B printer%2Bprusa%2Bi3%2Cindustrial% 2C143&sr=1-9&th=1	Old Prusa i3 LCD unit. Link to commercially available alternative
Leadscrew M8	RS PRO	280-408
Leadscrew nut M8	Comioke	https://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4? ref=ppx_yo2ov_dt_b_fed_asin_title&th=1	Nut for M8 screws
Leadscrew nut T8	Aipaide	https://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Nut for T8 screws
Leadscrew T8	VBESTLIFE	https://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Length 15 mm
L-Glutammine	Sigma-Aldrich	G7513
Limit switch	CESFONJER	https://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Linear ball bearing (LM4UU)	A ABSOPRO	https://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 4 x 8 x 12 mm
Linear ball bearing (LM8LUU)	Fdit	https://www.amazon.it/LM8LUU-Linear -Motion-cuscinetti-stampante/dp/B07N 58W3GZ/ref=sr_1_1_sspa?__mk_it_IT =%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=33VNCCCSIFJRP& dib=eyJ2IjoiMSJ9._JJ2doXI33C2JagX 8x6E2Bz2ILo10852tBi1erWqGn363ku zbcvknbMtsK6wm5jdR1P5XwC6Ovui at3kGIJPpYFOG_FiIBYT8xLkkbiphhR 4ncR6R9tPPyeN--_3RxFgKMh5tMO_ jesAcu7Anp87Qb91ruM85CKqduV-y6 HQJtAvVSXmfG4yE4N7d4_dDVKsR7 UkEmDIznJE0HIhvvI2R6vX2tMN5yMc _ZrUbUB0gPF6SgXHVJmKRizCRqL7J 64WRD-XnMSpVHY_LUVJ7gn9kJQ35 _zQw8vLD-_kRyvxwvE.4IVMdKzF1Ax mQHQhWEi6LH12UI4CmMgi288_g3zG CPY&dib_tag=se&keywords=LM8LUU+ Fdit&nsdOptOutParam=true&qid=17347 04494&s=industrial&sprefix=lm8luu+fdit+ %2Cindustrial%2C136&sr=1-1-spons&sp _csd=d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 45 mm
Linear ball bearing (LM8UU)	ARCELI	https://www.amazon.it/gp/product/ B07BV3YBP2/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 24 mm
Magnets	OCEUMAOA	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CB6C2RF4/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	8 x 3 mm
Matrigel	Gibco Thermofisher	LOT 0202003	SBMe
Motor driver	Longruner	https://www.amazon.it/gp/product/ B071P41ZBW/ref=ppx_yo_dt_b_search _asin_title?ie=UTF8&psc=1	Driver A4988
PBS	MicroGem, VWR	TL1006-500ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco Thermofisher	15070063
Pipette tips	Sigma-Aldrich	Z740058	BRAND filter tips, racked, TipBox (volume 50-1000 μL)
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti- plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0CF Q4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.bf7 Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_NuF ZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZgdzI 356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfklAYrb rXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPcLF2f2E EcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0sLPnM0ts wdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpVNMA4Kwh 0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9LLj1uMID2E Gi_ScmYqY5LahbYOmKVVPPiPIgCVdLjaM8 yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ 88x9GkX7EWuOwYO0dEUYSzHCdGONWo eZLfSJOR3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3A H53BtIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO 6upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq8 MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_ E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexiglass+ 2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-14	2 mm thickness, transparent sheet, 21 x 32.5 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.b f7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_N uFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZ gdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfk lAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPc LF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0s LPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpV NMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9 LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYOmKVVPP iPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHx mMeaQUqGkoQ88x9GkX7EWuOwYO0dE UYSzHCdGONWoeZLfSJOR3C6-knjzKrO Q0ziouJfo-ktbak7v3AH53BtIOiXbT57cKqh- uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6upc61MoydZujux nfLG7hwytqHQG2.ApKq8MVs8Xihn_zcA3 9nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_E&dib_tag=se &keywords=lastra+plexiglass+2+mm&nsd OptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-15	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 20 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9. bf7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_ NuFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHB tZgdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG- kfklAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJ PcLF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA 0sLPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh 4fpVNMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYft Xvvz9LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYO mKVVPPiPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge 2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ88x9GkX7E WuOwYO0dEUYSzHCdGONWoeZLfSJO R3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3AH53B tIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6 upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq 8MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJ N_E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexigl ass+2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1 734702823&sr=8-16	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 30 cm
Polylactic acid (PLA) filament	Flashforge	Black 100102
Power supply	SQUADO	https://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore -stabilizzato-dissipatore-efficienza /dp/B0DMTG6SJD/ref=sr_1_6?dib =eyJ2IjoiMSJ9.1vVze6Zt6fhKCvFb eAOSiRe57N6a1mlBnkLdHiEym4 ugHzueF6_FdOodb3sftCXb5raTg eerMMUbL5KcaI_SDa_2j7s2XohI B01QMJDyq0xQ5Gp3KLIZozDHV fGBdSrvwgyOl-BXSDy_ocZlj2TL5 e21p3K6qpvSaT5yo8WA5tngS93 Eqe8s8D6mjpnnPFrb9RpQpj299Y nNRYgr_YF3NCt3mH0r0FocKcCa LNpKtfGLCbnz_yB-360tp5SAi7A7 cgBf5I4NzQ5iQTTXAG727x0Hml mG-eaFBSJv6M1LPooZiT2aT7dx o_7tzyU6MQ9vAEozXkLTaTTMX RA_svPp96sxp93NRLReI64xpFd S3Zh1y_JPQijbMAIuvuYflhh6JlPB W6-fpW6QXl9v5wNEs_YwjzP9Sf RKxRmchzZhgsK-34XJeaEmjbRq H3piM0Zx.MfPYUNvCEhDBqLDh C-iqBEu-vjIVgsrQmOjeLuGo9YQ& dib_tag=se&keywords=power+sup ply+AC+INPUT%3A+110-220V%2 C+DC+OUTPUT%3A+12V+15A&n sdOptOutParam=true&qid=173471 4722&sr=8-6	Old Prusa i3 power supply (AC INPUT: 110-220 V, DC OUTPUT: 12 V 15 A). Link to commercially available alternative
Pulley 5 mm	VooGenzek	https://www.amazon.it/gp/product/ B0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Bore 5 mm, Width belt space 6 mm
Pulley 8 mm	Yxtaii	https://www.amazon.it/gp/product/ B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Bore 8 mm, Width belt space 6 mm
Ribbon cables	QUARKZMAN	https://www.amazon.it/sspa/click?ie =UTF8&spc=MTo0NDgyNTkwNzU wNjM5NzM5OjE3MzQ3MTQ1OTE6 c3BfbXRmOjMwMDEyMjk4NTMzN TYzMjo6MDo6&url=%2FQUARKZM AN-connettore-Lunghezza-Comput er-confezione%2Fdp%2FB0CQRM DQNG%2Fref%3Dsr_1_15_sspa% 3F__mk_it_IT%3D%25C3%2585M %25C3%2585%25C5%25BD%25 C3%2595%25C3%2591%26crid%3 D3BZ8Q05YA50TX%26dib%3Dey J2IjoiMSJ9.zoYnL2ViiarlDS_7165D ldxu-TTbVbWUVAP3pCybFB-bjGl wSgrpnkMhhsJj3NRo8Mvht8ev5H vGQ-UUpPom12OcOcwyRVXLAR UvMyTm8mpAdZSaOritwHRgwu2 JuW9UoS4jlCbA-gzP2FEAAH47K fFOWN6FEhc5r0YGBcSIsA6_QV6 _LA1k_ifj3c2BFm2Fj8YjW-auz7Yiy ULfZusvGX28S1K5kJdTa_YOwJY YC0Y__s-CCchHKiZgDhFjtFogUz0 Tonob4HQZiO_hkrnm3ixpNj9rgE- hvVq1FK1uD9M.kkP89x1SJ0SLxZ sv3YomYEfmkhpvP4WQf2TtC76K YAE%26dib_tag%3Dse%26keywords %3DCavo%2Bflessibile%2Ba%2Bna stro%2Bpiatto%2Bper%2Bstampant e%2B3D%2Ba%2B10%2Bpin%26n sdOptOutParam%3Dtrue%26qid% 3D1734714591%26s%3Dindustrial %26sprefix%3Dcavo%2Bflessibile %2Ba%2Bnastro%2Bpiatto%2Bper %2Bstampante%2B3d%2Ba%2B10 %2Bpin%252Cindustrial%252C170 %26sr%3D1-15-spons%26sp_csd% 3Dd2lkZ2V0TmFtZT1zcF9tdGY%26psc%3D1	ribbon cable 2651 28AWG 10 pins
Rigid shaft coupling	Gwolf	https://www.amazon.it/gp/product/ B088R8CW5Z/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Coupling from 5 to 8 mm
Rods 4 mm	RS-components	682-810	Diameter 4 mm
Rods 5 mm	Sourcingmap	a14010200ux0214	Diameter 5 mm
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