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요약

수용성 기저막 추출물은 암 연구에서 가장 널리 사용되는 생물학적 매트릭스이지만, 복잡한 유변학적 거동으로 인해 상업적으로 이용 가능한 바이오프린팅 시스템으로는 바이오프린팅이 어렵습니다. 이 작업은 단일 및 다중 레이어 모두에서 우수한 형상 충실도를 가진 순수한 매트릭스 구조를 생산하기 위한 맞춤형 바이오프린팅 전략을 제시합니다.

초록

중개 연구에서 3D 체외 모델은 과학적 이해와 치료 개발을 진전시키는 데 필수적입니다. 이를 위해 쥐 육종 세포에서 유래한 SBM(Soluble Basement Membrane Extracts)은 in vivo 미세환경의 기계적 및 생화학적 특성을 복제하는 데 중요한 역할을 합니다. 그들은 조직 공학에서 약물 테스트에 이르기까지 다양한 연구 분야에서 특히 가치가 있습니다. 특히, 이 분야에서 널리 사용되는 전통적인 2D 세포 배양은 3차원(3D) 구조와 종양 미세환경을 포착하지 못하기 때문에 오해의 소지가 있는 정보를 제공할 수 있기 때문에 암 연구의 기초가 되었습니다.

암 연구에서 효과적인 3D 체외 모델은 암의 진화를 더 잘 이해하고 약물 내성 메커니즘과 같은 문제를 예측하는 데 매우 중요합니다. 오가노이드는 유망한 3D 체외 모델로 부상하여 종양 생물학을 보다 정확하게 표현할 수 있습니다. 그들은 세포가 성장하고 3D 구조로 자체 조직화될 수 있는 환경을 조성하면서 SBM에서 성장합니다. 그러나 SBMe는 낮은 기계적 특성과 복잡한 유변학적 거동을 포함하여 상업적으로 이용 가능한 공압 압출 바이오프린팅 시스템과 함께 사용할 수 없다는 등 중요한 문제를 안고 있습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 당사는 저비용의 체적 제어 바이오프린팅 시스템과 SBMe를 사용한 프린팅 구조를 위한 특정 프로토콜을 개발했습니다. 이 시스템은 체적 압출기를 기반으로 하며 기존 공압 구동 접근 방식의 한계를 극복합니다. 특정 g-code로 조립 및 프로그래밍이 완료되면 시스템은 순수 및 희석된 SBMe를 모두 바이오프린트하여 단층 및 다층 구조를 모두 얻을 수 있습니다. 이 접근 방식은 3D 세포 배양 모델을 생성하기 위한 보다 안정적이고 확장 가능한 방법을 제공하여 새로운 치료법 및 약물 테스트에 대한 보다 효과적인 연구를 위한 길을 열어줍니다.

서문

중개 연구에서 생체 내 환경을 밀접하게 복제하는 3D 체외 모델을 만드는 것은 과학적 이해와 치료 개발을 진전시키는 데 필수적입니다1. 이를 구축하는 데 있어 핵심 구성 요소는 자연 조직의 복잡성을 더 잘 반영하는 SBM(Soluble Basement Membrane Extracts)과 같은 세포외 기질(ECM) 유사체를 사용하는 것입니다. SBM은 조직 공학에서 약물 테스트에 이르기까지 다양한 연구 분야에서 특히 가치가 있습니다 2,3. 특히, 종양 미세환경의 기계적, 생화학적 특징을 복제하여 종양의 성장, 전이 및 치료 반응을 더 잘 반영하는 모델을 개발할 수 있기 때문에 암 연구의 근간이 되었습니다.

실제로, 지난 수십 년 동안 상당한 발전에도 불구하고 많은 치료법이 계속해서 실패하고 있어 임상 환경에서 잦은 치료 실패로 이어지고 있습니다. 이러한 실패는 종종 높은 수준의 세포 이질성으로 인한 약물 내성 메커니즘에 기인합니다 4,5. 인간 종양의 복잡성을 정확하게 재현할 수 있는 효과적인 체외 모델은 암 진화를 더 잘 이해하고 이러한 현상을 예측하는 데 매우 중요합니다.

전통적인 2D 세포 배양은 암 연구의 기초가 되어 왔지만 실제 종양의 3D 구조와 미세환경을 포착하지 못하기 때문에 약물 효능 및 종양 작용에 대한 잘못된 정보로 이어질 수 있습니다 6,7,8. 이와는 대조적으로, 3D 체외 모델은 3D 복잡성을 모방하여 종양 미세환경 및 생물학적 거동을 보다 정확하게 표현할 수 있는 유망한 대안으로 부상했습니다 9,10.

암 연구에서 오가노이드는 인간 조직 및 장기에 대한 보다 정확하고 관련성 있는 모델을 제공하기 때문에 질병 및 약물 효능을 연구하기 위한 3D 모델로 널리 사용됩니다. Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포에서 유래한 SBMe의 사용은 암 연구를 발전시키는 데 중추적인 역할을 했습니다11,12. 이는 세포가 성장, 증식 및 오가노이드 구조로 자가 조직화할 수 있는 젤과 같은 기질을 제공하여 적절한 발달과 성장을 보장합니다13,14.

그러나 SBMe는 독특하고 복잡한 특성으로 인해 많은 문제를 제기합니다. 비뉴턴 유체인 SBMe는 전단 박화 특성을 나타내는데, 이는 전단 응력이 증가함에 따라 점도가 감소하여 다양한 힘에서 핸들링 및 적용이 일관되지 않음을 의미합니다. 또한, 요변성 거동은 전단 응력이 제거되면 시간이 지남에 따라 점도를 회복할 수 있기 때문에 복잡성을 가중시킵니다 15,16. 이러한 특성은 낮은 기계적 강도(단백질 농도에 따라 10Pa에서 5,000Pa 범위의 저장 탄성률 값) 및 열에 민감한 거동과 함께 이러한 문제를 악화시켜 준비 및 사용 중 세심한 제어와 순수하게 바이오프린팅해야 합니다.

표준 공압 구동 바이오프린팅 시스템은 주사기에서 배출된 후 압력이 가해지면 제어할 수 없는 동작이 발생하기 때문에 SBMe 디스펜싱을 적절하게 제어하지 못합니다. 이는 고분자 용융물에 대해 설명된 "스퍼트" 효과와 유사한 현상의 영향을 받으며, 이 경우 유속이 특정 임계 압력 값 17,18,19 이상으로 갑자기 증가합니다. 이전 연구에서 보고된 바와 같이16, 체적 제어 디스펜싱 전략을 사용하면 디스펜서에서 생성된 압력에서 SBMe 압출을 분리할 수 있으며, 이는 매트릭스의 유변학적 특성, 작업 조건 및 노즐 형상에 따라 달라집니다. 최근 몇 년 동안 시장에서는 동일한 원리를 활용하려는 여러 시도가 있었고 코닝의 Matribot이 선두를 달리고 있습니다. 제어된 온도 조건 덕분에 SBMe 및 기타 온도에 민감한 바이오잉크의 취급 및 증착이 가능합니다. 그러나 비용이 많이 들 수 있어 소규모 실험실의 접근성이 제한될 수 있습니다.

이전 논문에서는 저비용 맞춤형 대안인 체적 기반 바이오프린팅 시스템16을 제시했습니다. 이 버전은 맞춤형 3D 프린팅 압출기가 있는 수정된 보급형 3D 프린터를 기반으로 했습니다. 바이오프린팅에서의 효과에도 불구하고 프린팅 반복성에는 몇 가지 한계가 있었습니다. 보급형 3D 프린터에서 파생되었기 때문에 Z-움직임 및 자동 원점 복귀에 몇 가지 문제가 있었습니다. 이러한 요구 사항을 해결하기 위해 당사는 맞춤형 저비용 체적 디스펜싱 시스템의 고급 버전과 SBMe를 사용하는 바이오프린팅 구조를 위한 특정 프로토콜을 개발했습니다.

여기에서는 이 시스템의 구성 및 사용에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이전 연구16을 기반으로 하는 맞춤형 체적 제어 압출기, 바이오프린터 케이스 및 제어 시스템으로 구성됩니다. 생산 및 조립은 각 모듈에 대해 이루어집니다. 매트릭스 처리에 대한 프로토콜 설명에 따라 특정 gcode 파일로 조립 및 프로그래밍할 때 시스템은 단일 및 다중 레이어 모두에서 우수한 형상 충실도로 SBMe를 사용하여 순수 또는 희석된 구조를 바이오프린팅할 수 있습니다.

프로토콜

1. 3D Printing and Assembly of Volumetric Bioprinter(체적 바이오프린터의 프린팅 및 조립)

  1. 바이오프린터 구성 요소를 준비하고 3D 프린팅합니다.
    1. *를 다운로드합니다. 보충 파일 1의 STL 설계 파일.
    2. 부하*. STL 파일을 사용하여 인쇄판에 있는 조각의 방향과 3D 프린터에 필요한 모든 옵션을 정의할 수 있습니다. 중간 품질 옵션(0.4mm 노즐 크기, 1.75mm 필라멘트 직경, 220°C 압출기 온도, 50°C 인쇄 베드 플레이트 온도, 0.2mm 층 높이, 300mm/s 인쇄 속도)의 폴리락트산(PLA)을 사용하여 조각을 인쇄합니다.
      참고: 중간 품질 옵션은 조각을 인쇄하는 데 사용되는 프린터에 따라 다를 수 있습니다.
    3. 3D 프린터 베드에서 인쇄된 조각을 분리합니다. 인쇄된 지지 구조(있는 경우)를 제거하고 필요한 경우 표면을 연마합니다.
  2. 압출기를 조립합니다(그림 1).
    1. 푸셔 블록의 수직 구멍에 두 개의 선형 볼 베어링(LM4UU)을 삽입합니다. 또한 후면 중앙 구멍에 리드 스크류 너트 T8을 삽입하고 4개의 나사(M3x10)로 고정합니다.
    2. 스테퍼 모터에 견고한 샤프트 커플링을 부착한 다음 4개의 나사(M3x6)를 사용하여 압출기 모터 하우징에 고정합니다.
      알림: 케이블용 잭을 적절하게 배치할 수 있도록 압출기 모터 하우징의 홈에 따라 스테퍼 모터의 방향을 지정합니다.
    3. 1.2.2단계에서 조립한 스테퍼 모터를 이전에 삽입한 견고한 샤프트 커플링을 사용하여 T8 리드 나사(150mm)에 고정합니다. 모든 블록이 고정 나사로 제대로 고정되었는지 확인하십시오.
    4. 압출기 베이스 바닥에 하나의 자동 정렬 플랜지 베어링(8mm 내경)을 두 개의 나사(M4x8)로 부착합니다.
    5. 두 개의 볼 베어링(4 x 9 x 4mm)을 압출기 베이스 상단의 특정 구멍에 삽입하고 다른 두 개는 아래쪽 부분의 구멍에 삽입합니다.
    6. 조립된 부품(단계 1.2.1)을 구조물 상부의 캐비티를 통해 압출기 베이스에 삽입합니다. 4개의 볼 베어링(1.2.5단계)을 양쪽에 하나씩 2개의 4mm 로드로 연결합니다. 막대가 1.2.1단계에서 조립된 부품에 있는 두 개의 선형 볼 베어링을 통과하도록 합니다.
      참고: 먼저 상단 두 개의 볼 베어링에 바를 삽입한 다음 하단 볼 베어링에 도달하고 모든 것이 정의된 슬롯에 고정될 때까지 압출기 베이스에 넣을 수도 있습니다.
    7. 1.2.3단계에서 조립된 부품을 압출기 베이스의 중앙 구멍에 삽입합니다. 리드 스크류를 회전하여 리드 스크류 너트를 통과하고 자동 정렬 플랜지 베어링에 도달합니다. 구성 요소의 고정 나사를 사용하여 리드 나사를 잠그고 두 개의 나사(M3x8)를 사용하여 압출기 베이스 상단에 압출기 모터 하우징을 고정합니다.
    8. 두 개의 다른 나사(M3x40)와 M3 너트를 사용하여 실린지 배럴 플랜지 리테이너를 압출기 베이스의 하단 부분에 부착하고 실린지 배럴 플랜지를 잠급니다(삽입 방향이 위에서 아래로). 두 개의 다른 나사(M3x30)와 M3 너트를 사용하여 실린지 피스톤 리테이너를 푸셔 블록의 위쪽 구멍(삽입 방향이 아래에서 위로)에 부착하여 플런저 플랜지를 잠급니다.
    9. 두 개의 나사(M4x80)를 두 개의 스프링에 삽입하고 압출기 베이스와 주사기 블록의 바닥 부분에 있는 구멍을 통과하도록 합니다. 주사기 블록이 미끄러지지 않도록 주사기를 위한 공간을 남겨두고 너트를 조입니다.
      알림: 나사는 뒤에서 앞으로 가야 합니다.
  3. X축을 조립합니다(그림 2).
    1. 4개의 선형 볼 베어링(LM8UU x 24mm)을 상단 및 하단 구멍의 X_Left_Block 및 X_Right_Block 부품에 각각 2개씩 삽입합니다. 또한 X 오른쪽 및 X 왼쪽 블록 위에 두 개의 벨트 블록을 나사(M2x10)로 부착하여 벨트를 위한 공간을 남겨둡니다.
    2. X_Right_Block의 중앙 구멍에 두 개의 볼 베어링(5 x 16 x 5mm)을 양쪽에 하나씩 삽입합니다. X_Right_Block의 내부 캐비티에 풀리(보어 5mm)를 놓고 두 개의 볼 베어링을 5mm 로드(길이 35mm)로 연결하여 풀리를 통과하도록 합니다.
      알림: 더 나은 핸들링을 위해 어셈블리에 더 긴 막대를 사용하십시오. 조각을 제자리에 배치한 후 원하는 길이의 막대를 자릅니다.
    3. 두 개의 나사(M3x8)로 X_motor_housing에 리미트 스위치를 부착합니다. NEMA 17 모터를 모터 하우징에 삽입하고 4개의 나사(M3x8)를 사용하여 X_block_1 커버를 모터 하우징과 모터에 고정합니다.
    4. 풀리(보어 5mm)를 모터에 부착하고 고정 나사로 잠근 다음 1.3.3단계에서 조립된 부품을 4개의 나사(M5x8)로 X_block_1 조립합니다. 두 개의 나사(M3x8)로 X_Left_Block 하단에 리미트 스위치도 부착합니다.
      참고: 1.3.2 및 1.3.4 단계에서 풀리의 외경은 동일해야 합니다.
    5. 두 개의 선형 볼 베어링(LM8UU x 45mm)을 X_slider의 상단과 하단에 있는 구멍에 놓습니다.
    6. 1.3.2 및 1.3.4 단계에서 조립된 부품을 두 개의 8mm 로드(길이 200mm)로 연결하고 1.3.5단계에서 조립된 부품을 통과하도록 합니다.
      알림: 조립하기 전에 원하는 길이의 막대를 자릅니다.
    7. 벨트 블록과 두 개의 나사(M2x8)를 사용하여 한쪽 벨트 끝을 X_slider_belt_connection에 잠급니다. 조립된 부품 1.3.4에서 풀리 주위로 벨트를 연결한 다음 조립된 부품 1.3.2에서 풀리 주위를 실행하고 두 번째 벨트 블록과 두 개의 다른 나사(M2x8)를 사용하여 다른 벨트 끝을 X_slider_belt 연결부에 고정합니다. 올바른 움직임을 얻기 위해 벨트가 적절하게 조여졌는지 확인하십시오.
      참고: 이 단계에서는 간섭을 피하기 위해 X_slider X축 구조의 한쪽 끝으로 이동해야 합니다.
    8. 하나의 나사(M6x20)로 X_slider_belt_connection를 X_slider에 나사로 고정합니다.
    9. 압출기를 X_slider에 연결하고 4개의 나사(M5x10)로 고정합니다.
  4. Y축을 조립합니다(그림 3).
    1. 4개의 나사(M3x10)와 4개의 너트를 사용하여 고정 브래킷을 위쪽 후면 바이오프린터 부분에 놓습니다.
      알림: 고정 브래킷의 위치는 벨트의 적절한 장력을 얻고 스테퍼 모터를 삽입할 수 있도록 조정할 수 있습니다.
    2. 스테퍼 모터를 고정 브래킷에 삽입하고 4개의 나사(M3x8)로 조입니다. 그런 다음 크랭크 샤프트에 풀리(보어 5mm)를 놓고 고정 나사로 고정합니다.
      알림: 풀리는 구성 요소 간의 간섭을 피하기 위해 모터를 고정 브래킷에 넣기 전에 크랭크 샤프트에 부착할 수 있습니다.
    3. 전면 8mm 막대에서 두 개의 풀리(내경 8mm)를 찾아 두 개의 막대(끝에서 2.5cm 거리)에 잠급니다. 리어 로드에 대해 이 작업을 반복하고 오른쪽 끝에서 5cm 떨어진 곳에 다른 풀리를 추가합니다.
    4. 12개의 자동 정렬 플랜지 베어링(직경 8mm)을 바이오프린터의 내부 상부에 부착합니다.
    5. 1.4.3단계에서 조립된 막대를 사용하여 두 개의 상향 전면 바이오프린터 부품과 두 개의 상향 후면 바이오프린터 부품(왼쪽/오른쪽 방향)을 연결하고 자동 정렬 플랜지 베어링(직경 8mm)에 잠급니다. 모든 접합부에서 조립된 두 부품을 나사(M3x8)로 고정합니다.
      알림: 리어 로드를 배치할 때 스테퍼 모터의 풀리와 로드의 내부 풀리를 연결하는 닫힌 벨트를 배치하십시오.
      알림: 스테퍼 모터를 고정하고 너트를 조여 모터가 움직이지 않고 벨트가 적절하게 장력을 가하지 않도록 합니다.
    6. 4개의 8mm 막대를 사용하여 1.4.5단계에서 조립된 두 개의 부품을 연결합니다. 로드가 조립된 부품 1.3에 있는 선형 볼 베어링을 통과하도록 하고 자동 정렬 플랜지 베어링(직경 8mm)에 고정합니다. 모든 접합부에서 조립된 두 부품을 나사(M3x8)로 고정합니다.
    7. 벨트 블록을 사용하여 X_block_1 상단의 열린 벨트 끝을 고정하고 X_block_2에 대해 이 작업을 반복합니다. 왼쪽의 뒤쪽 풀리 주위에 벨트를 감은 다음 앞쪽 풀리 주위를 감고 다른 벨트 블록을 사용하여 다른 벨트 끝을 X_block_1에 다시 고정합니다. 두 번째 벨트에 대해 이 작업을 반복합니다.
      알림: 벨트는 올바른 움직임을 얻기 위해 적절하게 조여야 하며 Y 움직임에서 구부러지거나 간섭을 피하기 위해 동일한 길이여야 합니다.
  5. Z축을 조립합니다(그림 4).
    1. 하단 바이오프린터 케이스 부품(M4x8)을 함께 조입니다.
    2. 8단계에서 조립된 부품의 바닥 바닥에 하나의 자동 정렬 플랜지 베어링(직경 1.5.2mm)을 부착합니다.
    3. 2개의 플랜지 선형 볼 베어링(LMH8UU)을 Z_slider에 있는 외부 구멍에 고정하고 1개의 리드 스크류 너트를 나사(M3x8)로 중앙 구멍에 고정합니다.
    4. 두 개의 나사(M3x8)로 리미트 스위치를 Z_plane 왼쪽으로 고정합니다.
    5. 스테퍼 모터를 견고한 샤프트 커플링에 고정합니다. 4개의 나사(M3x20)와 나사산 막대를 사용하여 스테퍼 모터를 Z_block에 견고한 샤프트 커플링에 부착합니다. 모든 블록이 고정 나사로 제대로 고정되었는지 확인하십시오.
    6. 1.5.5단계에서 조립된 부품을 두 개의 8mm 막대를 사용하여 바이오프린터 베이스에 연결합니다. 1.5.3단계에서 조립된 부품을 통과하도록 합니다.
    7. 두 개의 나사(M5x8)를 사용하여 Z_block 후면 패널에 고정합니다.
    8. 4개의 나사(M3x25)를 사용하여 Z_plane Z_slider 연결합니다. Z_plane 구멍에 위에서 아래로 삽입하고 Z_plane과 Z_slider 사이에 스프링을 통과시킨 다음 너트로 고정합니다. 스프링 장력을 조정하여 평면을 수평으로 만듭니다.
    9. 특정 캐비티의 바이오프린터 구조 아래에 4개의 조정 가능한 다리를 부착합니다. 다리를 조정하여 바이오프린터의 수평을 맞춥니다.
    10. 1.4.6단계에서 조립된 부품을 8개의 나사(M4x12)를 사용하여 조립된 부품에 연결합니다.
    11. 특정 위치의 구조물 전면에 있는 두 개의 경첩을 부착하고 나사(M2x8)를 사용하여 상대 지점의 오른쪽 부분에 하나의 자석을 부착합니다. 개구부를 막기 위해 전체 구조를 2mm 투명 플렉시 유리 시트로 나사로 고정합니다.
      알림: 전면 플렉시 유리 패널을 경첩에 나사로 고정하고 자석에 따라 다른 나사를 끼워 전면 도어를 얻습니다.
  6. 어셈블리를 표시합니다(그림 5A).
    1. 디스플레이에 연결된 전선이 하단 구멍을 통과하도록 하고 4개의 나사(M3x3)로 디스플레이를 디스플레이 하우징에 부착합니다.
      알림: 이 통로는 LCD 손잡이 덮개 없이 수행해야 합니다. 디스플레이 하우징에 부착한 후 사전 설치된 손잡이에 위치할 수 있습니다.
    2. 4개의 나사(M2x6)를 사용하여 덮개가 있는 하우징을 닫습니다.
    3. SD 카드를 왼쪽 슬롯에 삽입합니다.
    4. 전선이 구조물 상단의 구멍을 통과하도록 합니다. 바이오프린터 상단의 조립된 부품을 두 개의 나사(M3x8)로 조입니다.
      알림: 모든 전선(모터, 리미트 스위치 및 디스플레이)은 벽 가까이에서 실행되어 왼쪽 하단 구멍에서 나옵니다. 기계 부품과의 간섭을 피하기 위해 케이블 클립으로 고정됩니다.
  7. 전자 장치 조립(그림 5B)
    1. 두 개의 나사(M3x10)로 소켓을 전자 케이스 외부에 고정합니다.
    2. 4개의 나사(M3x10)로 마더보드를 전자 케이스 내부에 부착합니다.
    3. 전원 공급 장치의 하단 부분을 4개의 나사(M3x8)로 전자 케이스 내부에 부착합니다.
    4. 덮개의 원형 구멍을 통해 전선을 통과시키고 마더보드에 연결합니다. 네 개의 나사(M3x10)를 사용하여 덮개가 있는 전자 케이스를 닫습니다.
      참고: 전자 케이스를 바이오프린터 구조에 연결하거나 작업 공간이 협소한 경우 책상 위에 두는 것이 가능합니다.
      그림 6 은 모든 전자 케이블 연결을 보여줍니다. 사용 중인 3D 프린터 마더보드에 따라 약간 다를 수 있습니다.

2. 소프트웨어 설정 및 gcode 생성 프로세스

  1. 슬라이싱 소프트웨어 설정 준비
    1. 슬라이싱 소프트웨어를 엽니다.
      참고: 지침은 사용하는 소프트웨어 또는 버전에 따라 다를 수 있습니다.
    2. 플랫폼에 로그인합니다.
    3. 설정 옵션으로 이동합니다. 프린터를 선택한 다음 네트워크에 연결되지 않은 프린터를 추가합니다. 사용자 지정 FFF 프린터를 선택하고 프린터 이름 상자에 프린터 이름을 입력합니다. 추가를 클릭합니다.
      참고: 첫 번째 소프트웨어 설치인 경우 로그인 후 프린터 추가 패널 이 자동으로 열립니다.
    4. 기기 설정 창에서 기본 설정 x, y, z를 176, 120, 45mm로 변경합니다.
    5. 가열된 침대 옵션이 아직 선택 취소되지 않은 경우 선택을 취소합니다.
    6. 시작 g-코드 및 끝 g-코드 패널에 추가 파일 2의 'JoVE_Starting_G-code.txt' 및 'JoVE_Ending_G-code.txt'이라는 제목의 파일에 보고된 텍스트 줄을 삽입합니다.
      1. 적용할 유량에 따라 시작 g-code 파일의 'M92 E150' 라인에 있는 값 150을 수정합니다. 다음 공식을 사용하여 적절한 값을 추정합니다.
        figure-protocol-7707
        여기서 Q는 원하는 유속[μL/min]입니다.
        참고: 이 공식은 설명된 시스템에서 실험적으로 얻었습니다. 기계 또는 전기 구성 요소에 변경 사항이 있는 경우 다를 수 있습니다. 가능한 대안은 사용 중인 시스템에 따라 값을 수정하고 원하는 gcode 파일을 생성하는 사용자 지정 MATLAB 코드를 만드는 것입니다.
    7. Extruder 1 패널에서 Compatible material diameter 값을 1,75로 변경한 다음 닫습니다.
    8. Marketplace로 이동하여 Z Offset Setting 플러그인을 선택하고 설치합니다. 프로세스가 끝나면 소프트웨어를 다시 시작하여 완료하십시오. 다시 열리면 설정 | 프린터 | 도구 모음에서 Manage Printers(프린터 관리)를 클릭합니다. Preferences 창에서 Settings(설정)를 클릭하고 Check all option(모든 옵션 확인)을 선택하여 모든 옵션을 활성화한 다음 닫습니다.
    9. 구성 패널이 포함된 스테이지 메뉴에서 Print Settings(인쇄 설정)(세 번째 버튼)를 클릭하여 설정을 구성합니다. 구성 패널에서 현재 인쇄 프로파일의 채우기 백분율을 입력합니다. 사용자 지정 버튼을 선택하여 현재 인쇄 설정을 수정하고 드롭다운 메뉴에서 프로필 Fine을 수정합니다. 인쇄 속도를 10mm/s로 설정합니다.
  2. GCODE 준비
    1. *를 다운로드합니다. 'JoVE_Square'이라는 제목의 STL 설계 파일, 이 문서의 보충 파일 2 에서 발췌.
    2. 부하. STL 파일을 슬라이싱 소프트웨어로 변환합니다.
    3. 평평한 표면에서 조각을 찾고 좌표 65, 42.5, 0(X, Y, Z) mm로 이동합니다. 를 클릭하여 두 개의 복사본을 만듭니다. STL 파일 이름을 선택하고 선택한 항목 곱하기 옵션을 선택합니다. 16, 42.5, 0mm 및 -33, 42.5, 0mm(X, Y, Z) 좌표로 이동합니다.
      참고: 최종 gcode 파일에서 직접 수동으로 수정하지 않는 한 인쇄 순서를 자동으로 정의할 수 없습니다. 좌표는 6-멀티웰 플레이트에 대해 정의됩니다.
    4. 스테이지 메뉴의 Print Settings(인쇄 설정)로 이동합니다. Walls(벽) 섹션에서 Wall line count(벽 라인 수)로 0을 입력합니다. Top/Bottom 섹션에서 Top/Bottom 두께 값으로 0을 입력합니다. 채우기 패널에서 채우기 패턴: 그리드, 채우기 선 거리: 5mm, 채우기 선 방향: [0] 값을 삽입합니다.
      참고: X축 정확도를 향상시키기 위해 인쇄 속도 섹션에서 이동 속도를 줄일 수 있습니다.
    5. Travel 섹션에서 retract를 비활성화하고 Cooling 섹션에서 냉각을 인쇄합니다.
    6. Build Plate Adhesion (빌드 플레이트 접착) 섹션에서 None (없음)을 Build Plate Adhesion Type(빌드 플레이트 접착 유형)으로 선택하고, Special Modes(특수 모드) 섹션에서 One at a Time (한 번에 하나) 옵션을 Print Sequence(인쇄 시퀀스)로 선택합니다.
    7. 슬라이스 버튼을 클릭하여 g-code를 생성합니다.
    8. 메모장 응용 프로그램으로 g 코드 파일을 열고 "104 S200", "M105" 및 "M109 S200" 줄을 12번째 줄 뒤에 있는 "M12 S"를 제거합니다. Cura_SteamEngine 4.9.0"으로 생성되었습니다.
    9. 다음 줄 앞에 "G1 Z25"를 추가하십시오. 망사: JoVE_Square_rev. STL(6)"을 입력하고 다음 항목을 (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 및 (2) G1 Z0.3의 두 개로 나눕니다.
      참고: X 및 Y 좌표는 예시일 뿐입니다.
    10. "; 뒤에 있는 모든 줄에서 Z 값을 Z25로 수정합니다. TIME_ELAPSED"는 각 조각의 모든 마지막 레이어 지시에 대해 설명합니다.
      참고: 한 장만 인쇄하는 경우 2.3.10단계가 필요하지 않습니다.

3. 팽윤/열화 시험

  1. 준비 단계
    1. 멸균 1mL 유리 주사기(TLL 단자)와 멸균 25G 원추형 노즐을 사용합니다. 조립하고 조립된 주사기를 냉장고에 넣으십시오.
    2. 피펫 팁과 SBMe 매트릭스 바이알을 실험 전날 밤새 냉장고에 넣습니다.
    3. 1mm x 1mm 원형 기공 크기와 측면 수직 기둥이 있는 3개의 PLA 그리드(Φ = 20mm)를 인쇄하여 잡습니다.
  2. 인쇄 구문
    1. 조립된 주사기와 SBMe 매트릭스 바이알을 냉장고에서 꺼냅니다. SBMe 매트릭스 500μL를 흡인하고 겔화를 위해 15분 동안 인큐베이터에 넣습니다.
    2. 인큐베이터에서 주사기를 꺼내 바이오프린터 프린트 헤드에 넣습니다. 실린지 플런저가 푸셔 블록과 제대로 접촉했는지 확인하십시오.
    3. 실린지 고정 플런저와 실린지 배럴 플랜지를 실린지 피스톤 리테이너로 고정하고 실린지 CL을 실린지 클램프로 고정합니다.
    4. bioprinter 메뉴의 Auto-home 설정을 사용하여 축을 자동으로 감지하여 시스템을 보정합니다.
    5. 바늘 끝이 PLA 그리드에 닿을 때까지 Move Axes 명령을 사용하여 압출기를 이동하여 Z0을 수동으로 정의합니다.
    6. 바이오프린터 메뉴에서 인쇄할 g-code 파일을 선택하여 인쇄를 시작합니다.
    7. 멀티웰 플레이트를 인큐베이터에 2분 동안 넣어 압출 후 SBMe가 안정될 수 있도록 합니다.
    8. 멀티웰 플레이트를 가져와서 2mL의 세포 배양 배지를 바이오프린팅된 그리드가 포함된 3개의 웰에 넣습니다. 멀티웰 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.
    9. 각 시점(t0, 1h, 2h, 3h, 4h, 1, 3, 7, 10 및 14일)에서 플레이트에서 각 그리드를 가져와 깨끗한 종이로 건조시켜 저울의 초과된 매체 및 중량을 제거합니다. 그리드를 플레이트에 다시 넣은 다음 인큐베이터에 넣어 실험을 계속하십시오. 팽창 비율과 분해 속도를 다음 공식을 사용하여 추정합니다.
      figure-protocol-11885
      여기서, W, t 는 각 시점에서의 구축물의 중량, Wt0 는 건조된 구축물의 중량입니다.
      figure-protocol-12056
      여기서 Wi 는 팽창 테스트가 끝날 때의 무게입니다.

4. SBMe 구조체의 바이오프린팅

  1. 준비 단계
    1. 멸균 1mL 유리 주사기(TLL 단자)와 멸균 25G 원뿔형 노즐을 사용하여 생물 안전 작업대 아래에 조립합니다. 냉장고의 멸균 상자에 넣으십시오.
    2. 실험 전날 피펫 팁과 SBMe 매트릭스 바이알을 하룻밤(얼음 위에서 4°C) 냉장고에 넣습니다.
    3. 1.5mL 원심분리 튜브에 트리판 블루 20μL를 추가합니다.
    4. 원심분리기를 345× g, 4°C로 설정하고 식히십시오(~3-4시간).
    5. 원심분리기의 균형을 맞추기 위해 5mL 원심분리기 튜브에 물 15mL를 넣습니다.
    6. 수조에 따뜻한 인산염 완충 용액(PBS) 및 매체.
      참고: 세포 배양 배지는 10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린-스트렙토마이신 및 L-글루타민이 보충된 완전한 Dulbecco 변형 독수리 배지(DMEM)로 만들어집니다.
    7. 생물 안전 캐비닛 아래에 바이오프린터를 놓습니다. 자외선 아래에서 20분 동안 살균합니다.
      알림: 바이오프린터의 적절한 기능을 보장하기 위해 자동 홈 기능을 실행하고 각 축의 적절한 움직임과 리미트 스위치의 작동을 확인하십시오.
  2. 바이오잉크 준비
    1. 상업용 쥐 전립선암 세포가 들어있는 인큐베이터에서 플라스크를 가져 와서 생물 안전성 캐비닛 아래에 넣으십시오.
    2. 플라스크에서 세포 배양 배지를 제거합니다.
      참고: 이 프로토콜에서 보고된 부피는 T25 세포 배양 플라스크에 적용됩니다.
    3. PBS 2mL로 세포를 한 번 세척한 다음 흡인합니다.
    4. 트립신 500μL를 넣고 플라스크를 인큐베이터에 5분 동안 넣어 플레이트에서 세포를 분리할 수 있도록 합니다.
    5. 세포의 트립신화를 확인하고 필요한 경우 플라스크 바닥을 부드럽게 두드립니다.
    6. 플라스크에 배지 4.5mL를 추가합니다. 분리된 모든 세포가 세포 배양 배지에 떠 있는지 확인하기 위해 플레이트를 조심스럽게 세척합니다.
    7. 배지를 흡입하고 15mL 원심분리 튜브에 추가합니다.
    8. 20μL 분취액을 트리판 블루 분취액과 혼합합니다. 그런 다음 이 혼합물 10μL를 세포 계수 챔버에 넣고 다음 공식을 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다.
      figure-protocol-13486
      여기서 f 는 trypan blue 현탁액(1:1 비율)의 희석 계수입니다. V 는 세포 현탁액 부피[mL]입니다.
    9. 나머지 세포 현탁액을 5분(345 × g, 4°C) 동안 원심분리합니다.
    10. 상층액을 제거하고 원하는 세포 밀도(10,6 cells/mL)에서 저온 SBMe 매트릭스에 재현탁합니다.
    11. 세포를 포함하는 매트릭스 현탁액 800μL를 차가운 주사기로 흡입합니다.
    12. 주사기에 갇혔을 수 있는 기포를 제거하고 멸균 상자에 넣습니다. 그런 다음 겔화될 수 있도록 인큐베이터에 15분 동안 넣습니다.
  3. 바이오프린팅 공정
    1. 인큐베이터에서 주사기를 꺼내 바이오프린터 프린트 헤드에 넣습니다. 실린지 플런저가 푸셔 블록과 제대로 접촉했는지 확인하십시오.
      참고: 모델과 부피는 실험에 사용된 주사기와 동일해야 합니다.
    2. 실린지 고정 플런저와 실린지 배럴 플랜지를 실린지 피스톤 리테이너로 고정하고 실린지 CL을 실린지 클램프로 고정합니다.
    3. 압출기 하단 부분에 있는 M4 너트를 사용하여 스프링 압력을 조정하고 주사기를 제자리에 고정합니다.
      참고: 4.3.1-4.3.4단계는 그림 7에 나와 있습니다.
    4. bioprinter 메뉴의 Auto-home 설정을 사용하여 축을 자동으로 감지하여 시스템을 보정합니다.
      참고: 이 구절은 인쇄에 사용하는 지원 유형과 독립적으로 항상 적절한 초기 설정을 보장합니다.
    5. 인쇄면에 6-멀티웰 플레이트를 놓습니다.
    6. 바늘 끝이 웰의 바닥에 닿을 때까지 Move Axes 명령을 사용하여 압출기를 이동하여 Z0를 수동으로 정의합니다.
    7. 바이오프린터 메뉴의 메뉴 옵션에서 gcode 파일을 선택하고 인쇄를 시작합니다. 정사각형 6층 그리드(2.6cm 면)가 각 웰에 인쇄됩니다.
    8. 바이오프린팅 공정 후 도립 현미경을 사용하여 프린팅 공정이 성공적으로 진행되었는지 확인하고 멀티웰 플레이트를 인큐베이터에 2분 동안 넣어 압출 후 SBMe가 안정될 수 있도록 합니다.
    9. 각 웰에 2mL의 세포 배양 배지를 넣습니다.
      참고: 볼륨은 구성을 완전히 포함해야 합니다.

결과

이 기사에서는 저비용의 맞춤형 체적 바이오프린터를 사용하여 SBMe로 만든 바이오프린팅 구조체를 위한 프로토콜을 제시합니다. 자세한 설명과 3D 프린팅을 제공합니다 *. STL 파일을 사용하여 시스템을 구축하고 단일 및 다층 구조를 인쇄하여 암 연구에서의 잠재적 사용을 입증합니다. 각 3D 프린팅 구성 요소는 조립하기 전에 지지 구조 또는 원치 않는 프린팅 잔여물로부...

토론

중개 연구에서 SBM은 조직 공학에서 약물 테스트에 이르기까지 다양한 연구 분야에서 특히 가치가 있습니다 2,3. 특히, 종양 미세환경의 기계적, 생화학적 특징을 복제하여 종양의 성장, 전이 및 치료 반응을 더 잘 반영하는 모델을 개발할 수 있기 때문에 암 연구의 근간이 되었습니다. SBMe는 특히 3D 오가노이드에 가장 널리 사용?...

공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 Cancer Research UK와 Fondazione AIRC(n° 22790) 간의 파트너십을 통해 자금을 지원받은 Accelerator Award n° A26815 "Single-cell cancer evolution in the clinic"과 European Union - Next Generation EU, Mission 4, Component 1, CUP D53D23003310006에서 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

자료

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12-multiwell plateSigma-AldrichCLS351143
3D FDM printerFlashforgeAdventurer 5M Pro
3D printer MotherboardGEETECHGT2560 REV A+
6-multiwell plateSigma-AldrichM8687
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Ball bearing 4 mmQUARKZMAN684ZZDimensions 4 x 9 x 4 mm
Ball bearing 5 mmXiKe625-2RSDimensions 5 x 16 x 5 mm
Belt closedTurmberg3Dhttps://www.amazon.it/gp/product/
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Belt openFajoedahttps://www.amazon.it/gp/product/
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Bioprinting nozzleFisher Scientific17780789Corning Standard Conical Bioprinting Nozzles
Bürker Cell Counting chamberGLASWARENFABRIK KARL HECHT40443001
CentrifugeEppendorf5702 R
Centrifuge tubeSigma-AldrichCLS43147015 mL
Centrifuge tubeSigma-AldrichEP00301200861.5 mL
DisplaySigma-AldrichBR718905
DMEM Gibco Thermofisher11965092
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Glass syringeFisher Scientific11520062Hamilton GasTight 1 mL (TLL terminal)
HingesYASQZhttps://www.amazon.it/gp/product/
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IncubatorFisher Scientific15481374Eppendorf Galaxy 48 R CO2 Incubator, 48 L, Stainless Steel
Inverted microscopeNikonEclipse Ti2-U
Jumper wiresIverntechhttps://www.amazon.it/Iverntech-XH2
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Linear ball bearing (LM8UU)ARCELIhttps://www.amazon.it/gp/product/
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MagnetsOCEUMAOAhttps://www.amazon.it/gp/product/
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MatrigelGibco ThermofisherLOT 0202003SBMe
Motor driver Longrunerhttps://www.amazon.it/gp/product/
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PBSMicroGem, VWRTL1006-500ML
Penicillin-StreptomycinGibco Thermofisher15070063
Pipette tipsSigma-AldrichZ740058BRAND filter tips, racked, TipBox (volume 50-1000 μL)
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