Diseño y validación de una bioimpresora de extrusión volumétrica para la bioimpresión de extracto soluble de membrana basal para investigación traslacional

Resumen

Los extractos solubles de membrana basal son las matrices biológicas más utilizadas en la investigación del cáncer, pero su complejo comportamiento reológico dificulta su bioimpresión con los sistemas de bioimpresión disponibles en el mercado. Este trabajo presenta una estrategia de bioimpresión personalizada para producir construcciones de matriz pura con buena fidelidad de forma tanto en una sola capa como en múltiples capas.

Resumen

En la investigación traslacional, los modelos 3D in vitro son esenciales para avanzar en la comprensión científica y el desarrollo terapéutico. Con este objetivo, los extractos solubles de membrana basal (SBMes), derivados de células de sarcoma de ratón, desempeñan el papel clave de replicar las características mecánicas y bioquímicas del microambiente in vivo . Son particularmente valiosos en una variedad de campos de investigación, desde la ingeniería de tejidos hasta las pruebas de medicamentos. En particular, se han vuelto fundamentales en la investigación del cáncer, ya que los cultivos celulares 2D tradicionales, ampliamente utilizados en el campo, pueden proporcionar información engañosa, ya que no capturan la estructura tridimensional (3D) y el microambiente tumoral.

En la investigación del cáncer, los modelos 3D in vitro eficaces son cruciales para comprender mejor la evolución del cáncer y anticipar los desafíos, como los mecanismos de resistencia a los fármacos. Los organoides se han convertido en prometedores modelos 3D in vitro , que ofrecen una representación más precisa de la biología tumoral. Crecen en SBMes a medida que crean un entorno donde las células pueden crecer y autoorganizarse en estructuras 3D. Sin embargo, SBMe presenta desafíos significativos, incluidas las bajas propiedades mecánicas y el comportamiento reológico complejo, lo que impide su uso con los sistemas de bioimpresión de extrusión neumática disponibles en el mercado.

Para hacer frente a estas limitaciones, desarrollamos un sistema de bioimpresión volumétrico controlado de bajo coste y un protocolo específico para la impresión de estructuras con SBMe. Este sistema se basa en una extrusora volumétrica y supera las limitaciones de los enfoques tradicionales accionados por neumáticos. Una vez ensamblado y programado con un código g específico, el sistema puede bioimprimir SBMe tanto puro como diluido para obtener construcciones de una o varias capas. Este enfoque ofrece un método más fiable y escalable para producir modelos de cultivo celular en 3D, allanando el camino para una investigación más eficaz de nuevos tratamientos y pruebas de fármacos.

Introducción

En la investigación traslacional, la creación de modelos in vitro en 3D que reproduzcan fielmente el entorno in vivo es esencial para avanzar en la comprensión científica y el desarrollo terapéutico¹. Un componente clave en su construcción es el uso de análogos de la matriz extracelular (ECM), como los extractos solubles de membrana basal (SBM), que reflejan mejor las complejidades de los tejidos naturales. Los SBMes son particularmente valiosos en una variedad de campos de investigación, desde la ingeniería de tejidos hasta las pruebas de drogas ^2,3. En particular, se han vuelto fundamentales en la investigación del cáncer, ya que replican las características mecánicas y bioquímicas del microambiente tumoral, lo que permite el desarrollo de modelos que reflejan mejor el crecimiento tumoral, la metástasis y las respuestas al tratamiento.

De hecho, a pesar de los considerables avances logrados en las últimas décadas, muchas terapias siguen fracasando, lo que conduce a frecuentes fracasos del tratamiento en entornos clínicos. Este fracaso se atribuye a menudo a mecanismos de resistencia a fármacos causados por altos niveles de heterogeneidad celular ^4,5. Los modelos in vitro eficaces, capaces de recapitular con precisión las complejidades de los tumores humanos, son cruciales para comprender mejor la evolución del cáncer y anticipar este fenómeno.

Los cultivos celulares 2D tradicionales han sido fundamentales en la investigación del cáncer, pero pueden conducir a información engañosa sobre la eficacia de los fármacos y el comportamiento tumoral, ya que no logran capturar la estructura 3D y el microambiente de los tumores reales ^6,7,8. Por el contrario, los modelos 3D in vitro han surgido como alternativas prometedoras, ya que ofrecen una representación más precisa del microambiente tumoral y del comportamiento biológico al imitar la complejidad 3D ^9,10.

En la investigación del cáncer, los organoides se utilizan ampliamente como modelos 3D para estudiar la eficacia de las enfermedades y los fármacos, ya que proporcionan modelos más precisos y relevantes de los tejidos y órganos humanos. El uso de SBMe, derivado de las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm, ha sido fundamental para el avance de la investigación del cáncer^11,12. Proporciona un sustrato gelatinoso en el que las células pueden crecer, proliferar y autoorganizarse en estructuras organoides, lo que garantiza un desarrollo y crecimiento adecuados^13,14.

Sin embargo, SBMe plantea una serie de desafíos debido a sus características únicas y complejas. Como fluido no newtoniano, SBMe exhibe propiedades de adelgazamiento por cizallamiento, lo que significa que su viscosidad disminuye con el aumento del esfuerzo por cizallamiento, lo que hace que su manejo y aplicación sean inconsistentes bajo fuerzas variables. Además, su comportamiento tixotrópico se suma a la complejidad, ya que puede recuperar su viscosidad con el tiempo cuando se elimina el esfuerzo cortante^15,16. Estas propiedades, junto con la baja resistencia mecánica (con valores de módulo de almacenamiento que oscilan entre 10 Pa y 5.000 Pa dependiendo de la concentración de proteínas) y el comportamiento termosensible, empeoran estos desafíos, requiriendo un control meticuloso durante la preparación y el uso, así como la bioimpresión pura.

Los sistemas de bioimpresión estándar accionados por neumáticos no controlan adecuadamente la dispensación de SBMe, ya que la aplicación de presión provoca un comportamiento incontrolable después de su expulsión de la jeringa. Se ve afectado por un fenómeno similar al "efecto chorro" descrito para las fundiciones poliméricas, en el que el caudal aumenta bruscamente por encima de un cierto valor de presión crítica 17,18,19. Como se informó en nuestro trabajo anterior¹⁶, la estrategia de dosificación de control volumétrico permite desacoplar la extrusión de SBMe de la presión generada en el dispensador, lo cual depende de las propiedades reológicas de la matriz, las condiciones de trabajo y la geometría de la boquilla. En los últimos años, se han realizado varios intentos en el mercado para explotar el mismo principio, con el Matribot de Corning a la cabeza. Permite la manipulación y deposición de SBMe y otras biotintas sensibles a la temperatura gracias a condiciones de temperatura controladas. Sin embargo, puede ser costoso y limitar la accesibilidad para los laboratorios más pequeños.

En nuestro artículo anterior, hemos presentado una alternativa personalizada de bajo costo: un sistema de bioimpresión volumétrico¹⁶. Esta versión se basó en una impresora 3D básica modificada con un extrusor impreso en 3D personalizado. A pesar de su eficacia en la bioimpresión, presentaba algunas limitaciones en la repetibilidad de la impresión. Al derivarse de una impresora 3D de nivel de entrada, tenía algunos problemas con los movimientos Z y el auto-homing. Para dar respuesta a estas necesidades, hemos desarrollado una versión avanzada de nuestro sistema de dosificación volumétrica personalizado y de bajo coste y un protocolo específico para la bioimpresión de estructuras mediante SBMe.

Aquí, proporcionamos protocolos para la construcción y el uso de este sistema. Está compuesto por un extrusor volumétrico controlado a medida, basado en nuestro estudio previo¹⁶, una caja de bioimpresora y un sistema de control. La producción y el montaje se realizan para cada módulo. Cuando se ensambla y programa con un archivo gcode específico, siguiendo la descripción del protocolo para el manejo de matrices, el sistema es capaz de bioimprimir construcciones puras o diluidas utilizando el SBMe con buena fidelidad de forma tanto en una sola capa como en varias capas.

Protocolo

1. 3D impresión y montaje de bioimpresora volumétrica

1. Prepare e imprima en 3D los componentes de la bioimpresora.
   1. Descargue el archivo *. Archivos de diseño STL del Archivo Suplementario 1.
   2. Carga*. STL en el software de corte propietario para definir la orientación de las piezas en la placa de impresión y todas las opciones requeridas para la impresora 3D. Imprime las piezas utilizando ácido poliláctico (PLA) con opciones de calidad media (tamaño de boquilla de 0,4 mm, diámetro de filamento de 1,75 mm, temperatura del extrusor de 220 °C, temperatura de la placa de la cama de impresión de 50 °C, altura de capa de 0,2 mm, velocidad de impresión de 300 mm/s).
      NOTA: Las opciones de calidad media pueden diferir según la impresora utilizada para imprimir las piezas.
   3. Separe las piezas impresas de la cama de la impresora 3D. Retire las estructuras de soporte impresas, si las hay, y pula las superficies donde sea necesario.
2. Ensamble el extrusor (Figura 1).
   1. Inserte dos rodamientos de bolas lineales (LM4UU) en los orificios verticales del bloque de empuje. Inserte también una tuerca de husillo T8 en el orificio central trasero y asegúrela con cuatro tornillos (M3x10).
   2. Fije un acoplamiento de eje rígido al motor paso a paso y luego fíjelo a la carcasa del motor de la extrusora con cuatro tornillos (M3x6).
      NOTA: Oriente el motor paso a paso de acuerdo con la ranura de la carcasa del motor del extrusor para permitir el posicionamiento adecuado del conector para los cables.
   3. Fije el motor paso a paso, montado en el paso 1.2.2, a un husillo T8 (150 mm) utilizando el acoplamiento de eje rígido insertado anteriormente. Asegúrese de que cada bloque esté correctamente asegurado con los tornillos de fijación.
   4. Fije un cojinete de brida autoalineable (diámetro interior de 8 mm) en la parte inferior de la base del extrusor con dos tornillos (M4x8).
   5. Inserte dos rodamientos de bolas (4 x 9 x 4 mm) en los orificios específicos en la parte superior de la base del extrusor y los otros dos en los orificios de la sección inferior.
   6. Inserte la pieza ensamblada (paso 1.2.1) en la base del extrusor a través de la cavidad en la parte superior de la estructura. Conecte los cuatro rodamientos de bolas (paso 1.2.5) con dos varillas de 4 mm, una para cada lado. Deje que las varillas pasen a través de los dos rodamientos de bolas lineales en la pieza ensamblada en el paso 1.2.1.
      NOTA: También es posible insertar primero las barras en los dos rodamientos de bolas superiores y luego colocarlas en la base del extrusor hasta que lleguen al rodamiento de bolas inferior y todo esté asegurado en las ranuras definidas.
   7. Inserte la pieza ensamblada en el paso 1.2.3 en el orificio central de la base del extrusor. Gire el husillo para pasar la tuerca del husillo y llegar al cojinete de la brida autoalineable. Utilice los tornillos de fijación del componente para bloquear el husillo y dos tornillos (M3x8) para fijar la carcasa del motor del extrusor en la parte superior de la base del extrusor.
   8. Utilice otros dos tornillos (M3x40) y tuercas M3 para fijar el retenedor de la brida del cilindro de la jeringa a la parte inferior de la base de la extrusora, para bloquear la brida del cilindro de la jeringa (dirección de la inserción de arriba a abajo). Utilice otros dos tornillos (M3x30) y tuercas M3 para fijar el retenedor del pistón de la jeringa a los orificios superiores del bloque de empuje (dirección de la inserción de abajo hacia arriba) para bloquear la brida del émbolo.
   9. Inserte dos tornillos (M4x80) en dos resortes y déjelos pasar a través de los orificios presentes en la parte inferior de la base del extrusor y el bloque de jeringa. Atornille las tuercas dejando espacio para la jeringa para evitar el deslizamiento del bloque de la jeringa.
      NOTA: Los tornillos deben ir de atrás hacia adelante.
3. Ensamble el eje X (Figura 2).
   1. Inserte cuatro rodamientos de bolas lineales (LM8UU x 24 mm) en las piezas de X_Left_Block y X_Right_Block en los orificios superior e inferior, dos para cada uno. Fije también dos bloques de correa encima de los bloques X derecho y X izquierdo con tornillos (M2x10) dejando espacio para la correa.
   2. Inserte dos rodamientos de bolas (5 x 16 x 5 mm) en los orificios centrales de X_Right_Block, uno a cada lado. Coloque una polea (diámetro de 5 mm) en la cavidad interior de X_Right_Block y conecte los dos rodamientos de bolas con una varilla de 5 mm (35 mm de longitud), dejándola pasar a través de la polea.
      NOTA: Utilice una varilla más larga para que el ensamblaje tenga un mejor manejo. Después de colocar las piezas en su lugar, corte la varilla de la longitud deseada.
   3. Fije un interruptor de límite a la X_motor_housing con dos tornillos (M3x8). Inserte el motor NEMA 17 en la carcasa del motor y use cuatro tornillos (M3x8) para fijar la cubierta del X_block_1 a la carcasa del motor y al motor.
   4. Fije una polea (diámetro de 5 mm) al motor y bloquéelo con tornillos de fijación y luego atornille la pieza ensamblada en el paso 1.3.3 para X_block_1 con cuatro tornillos (M5x8). Fije también un interruptor de límite en la parte inferior de X_Left_Block con dos tornillos (M3x8).
      NOTA: El diámetro exterior de las poleas en los pasos 1.3.2 y 1.3.4 debe ser el mismo.
   5. Coloque dos rodamientos de bolas lineales (LM8UU x 45 mm) en los orificios de la parte superior e inferior de la X_slider.
   6. Conecte las piezas ensambladas en los pasos 1.3.2 y 1.3.4 con dos varillas de 8 mm (200 mm de longitud) y déjelas pasar a través de la pieza ensamblada en el paso 1.3.5.
      NOTA: Corte las varillas de la longitud deseada antes de ensamblar.
   7. Bloquee un extremo de la correa a la X_slider_belt_connection con el bloque de correa y dos tornillos (M2x8). Pase la correa alrededor de la polea en la pieza ensamblada 1.3.4, luego alrededor de la polea en la parte ensamblada 1.3.2 y fije el otro extremo de la correa a la conexión X_slider_belt usando el segundo bloque de correa y otros dos tornillos (M2x8). Asegúrese de que el cinturón esté bien apretado para obtener el movimiento correcto.
      NOTA: Durante este paso, el X_slider debe moverse hacia un extremo de la estructura del eje X para evitar interferencias.
   8. Atornille el X_slider_belt_connection al X_slider con un tornillo (M6x20).
   9. Conecte el extrusor al X_slider y fíjelo con cuatro tornillos (M5x10).
4. Ensamble el eje Y (Figura 3).
   1. Coloque el soporte de fijación en la parte trasera de la bioimpresora con cuatro tornillos (M3x10) y cuatro tuercas.
      NOTA: La posición del soporte de fijación se puede adaptar para obtener la tensión adecuada de la correa y permitir la inserción del motor paso a paso.
   2. Inserte el motor paso a paso en el soporte de fijación y atorníllelo con cuatro tornillos (M3x8). A continuación, coloque una polea (diámetro de 5 mm) en el cigüeñal y fíjela con tornillos de fijación.
      NOTA: La polea se puede conectar al cigüeñal antes de colocar el motor en el soporte de fijación para evitar alguna interferencia entre los componentes.
   3. Ubique dos poleas (8 mm de diámetro interior) en la varilla delantera de 8 mm y bloquéelas en las dos varillas (2,5 cm lejos del extremo). Repita esta operación para la varilla trasera y agregue otra polea, a 5 cm del extremo derecho.
   4. Fije 12 cojinetes de brida autoalineables (8 mm de diámetro) a las partes superiores internas de la bioimpresora.
   5. Conecte las dos piezas de la bioimpresora delanteras y las dos piezas traseras de la bioimpresora (dirección izquierda/derecha) utilizando las varillas ensambladas en el paso 1.4.3 y bloquéelas a los cojinetes de brida autoalineables (8 mm de diámetro). Fije las dos piezas ensambladas en todas las uniones con tornillos (M3x8).
      NOTA: Al colocar la varilla trasera, coloque una correa cerrada que conecte la polea del motor paso a paso con la polea interior de la varilla.
      NOTA: Asegure el motor paso a paso apretando las tuercas para garantizar que no se mueva el motor y que la tensión sea la adecuada de la correa.
   6. Conecte las dos piezas ensambladas en el paso 1.4.5 usando cuatro varillas de 8 mm. Deje que las varillas pasen a través de los rodamientos de bolas lineales presentes en la pieza ensamblada 1.3 y asegúrelas a los rodamientos de brida autoalineables (8 mm de diámetro). Fije las dos piezas ensambladas en todas las uniones con tornillos (M3x8).
   7. Fije un extremo de correa abierto en la parte superior de la X_block_1 usando el bloque de correa y repita esta operación para el X_block_2. Pase la correa alrededor de las poleas traseras de la izquierda, luego alrededor de la polea delantera y fije el otro extremo de la correa nuevamente al X_block_1 con otro bloque de correa. Repita esta operación para la segunda correa.
      NOTA: Las correas deben estar debidamente ajustadas para obtener el movimiento correcto y de la misma longitud para evitar flexiones o interferencias en los movimientos en Y.
5. Ensamble el eje Z (Figura 4).
   1. Atornille las piezas inferiores de la carcasa de la bioimpresora (M4x8).
   2. Fije un cojinete de brida autoalineable (8 mm de diámetro) al suelo de la parte inferior de la pieza ensamblada en el paso 1.5.2.
   3. Fije dos rodamientos lineales de bolas con brida (LMH8UU) a los orificios externos presentes en el Z_slider y una tuerca de husillo en el orificio central con tornillos (M3x8).
   4. Fije un interruptor de límite al Z_plane lado izquierdo con dos tornillos (M3x8).
   5. Fije el motor paso a paso a un acoplamiento de eje rígido. Fije un motor paso a paso al Z_block con cuatro tornillos (M3x20) y una varilla roscada al acoplamiento de eje rígido. Asegúrese de que cada bloque esté correctamente asegurado con los tornillos de fijación.
   6. Conecte la pieza ensamblada en el paso 1.5.5 a la base de la bioimpresora usando dos varillas de 8 mm. Déjelos pasar a través de la pieza ensamblada en el paso 1.5.3.
   7. Fije el Z_block al panel trasero con dos tornillos (M5x8).
   8. Conecte Z_plane a Z_slider con cuatro tornillos (M3x25). Insértelos en los orificios de Z_plane de arriba a abajo, pase el resorte entre Z_plane y Z_slider y asegúrelos con tuercas. Ajuste la tensión del resorte para nivelar el avión.
   9. Coloque cuatro pies ajustables debajo de la estructura de la bioimpresora en la cavidad específica. Nivele la bioimpresora ajustando los pies.
   10. Conecte la pieza ensamblada a la pieza ensamblada en el paso 1.4.6 con ocho tornillos (M4x12).
   11. Fije dos bisagras en la parte delantera de la estructura en las ubicaciones específicas y un imán en la parte derecha en el lugar relativo con tornillos (M2x8). Atornille la estructura general a láminas de plexiglás transparente de 2 mm para cerrar las aberturas.
       NOTA: Atornille el panel frontal de plexiglás a las bisagras y coloque otro tornillo en correspondencia con el imán para obtener una puerta frontal.
6. Muestre el ensamblaje (Figura 5A).
   1. Deje que los cables, conectados a la pantalla, pasen a través del orificio inferior y fije la pantalla a la carcasa de la pantalla con cuatro tornillos (M3x3).
      NOTA: Este pasaje debe realizarse sin la tapa de la perilla LCD. Podría ubicarse en la perilla preinstalada después de la conexión a la carcasa de la pantalla.
   2. Cierre la carcasa con la tapa con cuatro tornillos (M2x6).
   3. Inserta la tarjeta SD en la ranura izquierda.
   4. Deje que los cables pasen a través del orificio en la parte superior de la estructura. Atornille la pieza ensamblada en la parte superior de la bioimpresora con dos tornillos (M3x8).
      NOTA: Todos los cables (motores, interruptores de límite y pantalla) correrán cerca de la pared y saldrán por el orificio inferior izquierdo. Se fijan con clips de cable para evitar interferencias con las partes mecánicas.
7. Montaje de componentes electrónicos (Figura 5B)
   1. Fije el casquillo a la parte exterior de la caja electrónica con dos tornillos (M3x10).
   2. Fije la placa base a la parte interior de la carcasa electrónica con cuatro tornillos (M3x10).
   3. Fije la parte inferior de la fuente de alimentación a la parte interior de la carcasa electrónica con cuatro tornillos (M3x8).
   4. Pase los cables a través del orificio circular de la tapa y conéctelos a la placa base. Cierre la caja electrónica con su tapa con cuatro tornillos (M3x10).
      NOTA: Es posible conectar la caja electrónica a la estructura de la bioimpresora o dejarla en el escritorio en caso de espacios de trabajo pequeños.
      La figura 6 muestra todas las conexiones de cables electrónicos. Pueden ser ligeramente diferentes según la placa base de la impresora 3D que se utilice.

2. Configuración de software y proceso de generación de gcode

1. Preparación de la configuración del software de corte
   1. Abra el software de corte.
      NOTA: Las instrucciones pueden diferir según el software utilizado o la versión.
   2. Inicie sesión en la plataforma.
   3. Vaya a las opciones de Configuración . Seleccione la impresora y, a continuación, Agregar una impresora no conectada a la red. Seleccione Impresora FFF personalizada y, en el cuadro Nombre de la impresora, escriba el nombre de la impresora. Haga clic en Agregar.
      NOTA: Si es la primera instalación de software, el panel Agregar impresora se abrirá automáticamente después de iniciar sesión.
   4. En la ventana Configuración de la máquina , cambie la configuración predeterminada x, y, z a 176, 120, 45 mm.
   5. Anule la selección de la opción Cama calefactada si aún no se ha deseleccionado.
   6. Inserte en los paneles Código g inicial y Código g final las líneas de texto indicadas en los archivos titulados 'JoVE_Starting_G-code.txt' y 'JoVE_Ending_G-code.txt' en el archivo complementario 2.
      1. Modifique el valor 150 en la línea 'M92 E150' en el archivo de código g de inicio según el caudal a aplicar. Calcule el valor adecuado utilizando la siguiente fórmula:
         
         Donde Q es el caudal deseado [μL/min].
         NOTA: Esta fórmula se obtuvo experimentalmente con el sistema descrito. Puede ser diferente si hay cambios en los componentes mecánicos o eléctricos. Una posible alternativa podría ser fijar el valor de acuerdo con el sistema en uso y crear un código MATLAB personalizado para generar el archivo gcode deseado.
   7. Cambie el valor de Diámetro de material compatible en el panel Extrusora 1 a 1,75 y luego cierre.
   8. Ve a Marketplace, selecciona el plugin Z Offset Setting e instálalo. Al final del proceso, reinicie el software para finalizar. Una vez que se vuelva a abrir, seleccione Configuración | Impresora | Administrar impresoras en la barra de herramientas. En la ventana Preferencias , haga clic en Configuración y active todas las opciones seleccionando la opción Verificar todo y ciérrela.
   9. Configure la configuración haciendo clic en Configuración de impresión (tercer botón) en el menú de la etapa , que contiene el panel de configuración . Introduzca el porcentaje de relleno en el perfil de impresión actual en el panel de configuración . Seleccione el botón Personalizado para modificar la configuración de impresión actual y el perfil Fine en el menú desplegable. Establezca la velocidad de impresión en 10 mm/s.
2. Preparación de GCODE
   1. Descargue el archivo *. Archivo de diseño STL, titulado 'JoVE_Square', del Archivo Suplementario 2 de este documento.
   2. Carga. STL en el software de corte.
   3. Localiza la pieza en la superficie plana y muévela a las coordenadas 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Cree dos copias haciendo clic en el botón . STL en la lista de objetos y seleccionando la opción multiplicar seleccionado. Muévalos a las siguientes coordenadas: 16, 42,5, 0 mm y -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      NOTA: No es posible definir automáticamente el orden de impresión a menos que se modifique manualmente directamente en el archivo gcode final. Se definen las coordenadas para una placa de 6 pocillos múltiples.
   4. Vaya a Configuración de impresión en el menú del escenario . En la sección Muros , escriba 0 como Recuento de líneas de muro. Ponga 0 como valor de grosor superior/inferior en la sección Superior/Inferior . En el panel Relleno , inserte los siguientes valores: Patrón de relleno: Rejilla, Distancia de la línea de relleno: 5 mm, Direcciones de la línea de relleno: [0].
      NOTA: Es posible reducir la velocidad de desplazamiento en la sección Velocidad de impresión para mejorar la precisión del eje X.
   5. Deshabilite la retracción en la sección Recorrido y el enfriamiento de impresión en la sección Refrigeración .
   6. En la sección Adhesión de la placa de construcción, seleccione Ninguno como Tipo de adhesión de la placa de construcción, mientras que en la sección Modos especiales , seleccione la opción Uno a la vez como Secuencia de impresión.
   7. Haga clic en el botón Slice para generar el código g.
   8. Abra el archivo de código g con la aplicación Bloc de notas y elimine las líneas "M104 S200", "M105" y "M109 S200" en la línea 12 después de la frase "; Generado con Cura_SteamEngine 4.9.0".
   9. Añádase "G1 Z25" antes de la línea siguiente "; MALLADA: JoVE_Square_rev. STL(6)" y dividir el siguiente en dos: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 y (2) G1 Z0.3.
      NOTA: Las coordenadas X e Y son solo ejemplos.
   10. Modifique el valor Z a Z25 en cada línea presente después de "; TIME_ELAPSED" comenta hasta la última capa de instrucciones de cada pieza.
       NOTA: Para imprimir una sola pieza, no se requiere el paso 2.3.10.

3. Prueba de hinchamiento/degradación

1. Pasos preparatorios
   1. Tome una jeringa de vidrio estéril de 1 mL (terminal TLL) y una boquilla cónica estéril de 25 G. Móntelos y coloque la jeringa ensamblada en el refrigerador.
   2. Coloque las puntas de pipeta y el vial de matriz SBMe en el refrigerador durante la noche del día anterior al experimento.
   3. Imprime tres cuadrículas de PLA (Φ = 20 mm) con un tamaño de poro circular de 1 mm x 1 mm y un pilar vertical lateral para agarrarlas.
2. Construcciones de impresión
   1. Tome la jeringa ensamblada y el vial de matriz SBMe del refrigerador. Aspirar 500 μL de la matriz SBMe y ponerla en la incubadora durante 15 min para permitir la gelificación.
   2. Tome la jeringa de la incubadora y colóquela en el cabezal de impresión de la bioimpresora. Asegúrese de que el émbolo de la jeringa esté correctamente en contacto con el bloque de empuje.
   3. Asegure el émbolo de fijación de la jeringa y la brida del cilindro de la jeringa con los retenedores del pistón de la jeringa y el cilindro de la jeringa con la abrazadera de la jeringa.
   4. Calibre el sistema utilizando la configuración de inicio automático en el menú de la bioimpresora para detectar automáticamente el origen de los ejes.
   5. Mueva el extrusor con el comando Mover ejes hasta que la punta de la aguja toque la rejilla PLA para definir manualmente Z0.
   6. Comience a imprimir seleccionando el archivo de código g para imprimir en el menú de la bioimpresora.
   7. Coloque la placa de pocillos múltiples en la incubadora durante 2 minutos para permitir que el SBMe se asiente después de la extrusión.
   8. Tome la placa de pocillos múltiples y coloque 2 mL de medio de cultivo celular en los tres pocillos que contienen las rejillas bioimpresas. Coloque la placa de pocillos múltiples en la incubadora.
   9. En cada punto de tiempo (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 y 14 días), tome cada rejilla del plato y séquela con papel limpio para eliminar el exceso de medio y peso en una balanza. Vuelva a colocar la rejilla en el plato y luego en la incubadora para continuar con el experimento. Calcule la tasa de hinchamiento y la tasa de degradación utilizando las siguientes fórmulas:
      
      Donde W_t es el peso de los constructos en cada punto de tiempo y W_t0 el peso de los constructos secos.
      
      Donde W_i es el peso al final de la prueba de hinchamiento.

4. Bioimpresión de construcciones SBMe

1. Pasos preparatorios
   1. Tome una jeringa de vidrio estéril de 1 ml (terminal TLL) y una boquilla cónica estéril de 25 G y móntelas debajo del gabinete de bioseguridad. Colóquelos en una caja estéril en el refrigerador.
   2. Coloque las puntas de pipeta y el vial de matriz SBMe en el refrigerador durante la noche (4 °C en hielo) el día antes del experimento.
   3. Agregue 20 μL de azul de tripán a un tubo de centrífuga de 1,5 mL.
   4. Ajuste la centrífuga a 345 × g, 4 °C y deje que se enfríe (~3-4 h).
   5. Tome 5 mL de agua en un tubo de centrífuga de 15 mL como equilibrio para la centrífuga.
   6. Caliente la solución tampón de fosfato (PBS) y los medios en un baño de agua.
      NOTA: El medio de cultivo celular está hecho de medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) complementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina y L-glutamina.
   7. Coloque la bioimpresora debajo del armario de seguridad biológica. Esterilizar bajo luz ultravioleta durante 20 min.
      NOTA: Para garantizar el correcto funcionamiento de la bioimpresora, ejecute la función Auto-home y verifique los movimientos adecuados de cada eje y el funcionamiento de los finales de carrera.
2. Preparación de biotintas
   1. Tome el matraz de la incubadora que contiene células comerciales de cáncer de próstata murino y colóquelo debajo del gabinete de bioseguridad.
   2. Retire el medio de cultivo celular del matraz.
      NOTA: Los volúmenes informados en este protocolo se aplican a los matraces de cultivo celular T25.
   3. Lave las células una vez con 2 mL de PBS y luego aspire.
   4. Añadir 500 μL de tripsina y poner el matraz en la incubadora durante 5 min para permitir el desprendimiento celular de la placa.
   5. Compruebe si las células están tripsinizadas y, si es necesario, golpee suavemente el fondo del matraz.
   6. Añadir 4,5 mL de medio al matraz. Lave cuidadosamente la placa para asegurarse de que todas las células desprendidas estén flotando en el medio de cultivo celular.
   7. Aspire el medio y agréguelo a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   8. Toma una alícuota de 20 μL y mézclala con la alícuota azul de tripán. A continuación, coloque 10 μL de esta mezcla en la cámara de recuento de células para contar las células vivas utilizando la siguiente fórmula:
      
      Donde f es el factor de dilución de la suspensión de azul de tripano (relación 1:1); V es el volumen de suspensión celular [mL].
   9. Centrifugar la suspensión celular restante durante 5 min (345 × g, 4 °C).
   10. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en la matriz SBMe fría a la densidad celular deseada (10⁶ células/mL)
   11. Aspire 800 μL de la suspensión de la matriz que contiene células con la jeringa fría.
   12. Retire las burbujas de aire que puedan quedar atrapadas en la jeringa y colóquela en una caja estéril. Luego, colóquelo en la incubadora durante 15 minutos para permitir la gelificación.
3. Proceso de bioimpresión
   1. Tome la jeringa de la incubadora y colóquela en el cabezal de impresión de la bioimpresora. Asegúrese de que el émbolo de la jeringa esté correctamente en contacto con el bloque de empuje.
      NOTA: El modelo y el volumen deben ser los mismos que los de la jeringa utilizada para el experimento.
   2. Asegure el émbolo de fijación de la jeringa y la brida del cilindro de la jeringa con los retenedores del pistón de la jeringa y el cilindro de la jeringa con la abrazadera de la jeringa.
   3. Use tuercas M4 en la parte inferior del extrusor para ajustar la presión del resorte y bloquear la jeringa en su lugar.
      NOTA: Los pasos 4.3.1 a 4.3.4 se muestran en la Figura 7.
   4. Calibre el sistema utilizando la configuración de inicio automático en el menú de la bioimpresora para detectar automáticamente el origen de los ejes.
      NOTA: Este pasaje siempre garantiza los ajustes iniciales adecuados, independientemente del tipo de soporte que utilicemos para imprimir.
   5. Coloque una plancha de 6 pocillos múltiples en el plano de impresión.
   6. Mueva el extrusor con el comando Mover ejes hasta que la punta de la aguja toque el fondo del pozo para definir manualmente Z0.
   7. Seleccione el archivo gcode en la opción de menú del menú de la bioimpresora y comience a imprimir. Se imprimirá una cuadrícula cuadrada de seis capas (2,6 cm de lado) en cada pocillo.
   8. Después del proceso de bioimpresión, utilice un microscopio invertido para asegurarse de que el proceso de impresión ha sido exitoso y coloque la placa multipocillo en la incubadora durante 2 minutos para permitir que el SBMe se asiente después de la extrusión.
   9. Coloque 2 mL de medio de cultivo celular en cada pocillo.
      NOTA: El volumen debe cubrir completamente las construcciones.

Resultados

En este artículo, presentamos un protocolo para la bioimpresión de construcciones hechas de SBMe utilizando una bioimpresora volumétrica de bajo costo, hecha a medida. Proporcionamos una descripción detallada e impresión 3D*. STL para construir el sistema y demostramos su uso potencial en la investigación del cáncer mediante la impresión de estructuras de una o varias capas. Cada componente impreso en 3D se ha limpiado adecuadamente de la estructura de soporte o de los residuos d...

Discusión

En la investigación traslacional, los SBMes son particularmente valiosos en una variedad de campos de investigación, desde la ingeniería de tejidos hasta las pruebas de fármacos ^2,3. En particular, se han vuelto fundamentales en la investigación del cáncer, ya que replican las características mecánicas y bioquímicas del microambiente tumoral, lo que permite el desarrollo de modelos que reflejan mejor el crecimiento tumor...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-multiwell plate	Sigma-Aldrich	CLS351143
3D FDM printer	Flashforge	Adventurer 5M Pro
3D printer Motherboard	GEETECH	GT2560 REV A+
6-multiwell plate	Sigma-Aldrich	M8687
AC socket	HiLetgo	https://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket -Holder-Switch/dp/B0814PT3YG/ref=sr_1_1?__ mk_it_IT=%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=2TRIBP34VJ61A &dib=eyJ2IjoiMSJ9.zW6_VmeiudR I4yMpjJqJm7OdeoctTKW2mrEzml BAyJVa1hkM4PiJT3pLY0mXdxm1 AZQxa2_f5J4q4d5v3vUeqLkjJ6BM kWHAoeEfbEQJNuZaQ3NjmUlqWy _1AfQpnRp4VqJ2m3bkWsChztCa Ok-ZdQJlobGxJaMKg7WbV352 Hyo.0tEw2GYoPQJ4SdNYXO1XM Jrl2yXMvRey55Hj7GhISkk&dib_ tag=se&keywords=AC+socket+HiLetgo&nsdOpt OutParam=true&qid=1734702097&sprefix=ac+ socket+hiletgo%2Caps%2C173&sr=8-1	15 A 250 V
Adjustable feet	EXIN DEHCEN	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CPLTSNQB/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Height 27-40 mm
Ball bearing 4 mm	QUARKZMAN	684ZZ	Dimensions 4 x 9 x 4 mm
Ball bearing 5 mm	XiKe	625-2RS	Dimensions 5 x 16 x 5 mm
Belt closed	Turmberg3D	https://www.amazon.it/gp/product/ B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Width 6 mm
Belt open	Fajoeda	https://www.amazon.it/gp/product/ B09QCTVPTH/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Width 6 mm
Bioprinting nozzle	Fisher Scientific	17780789	Corning Standard Conical Bioprinting Nozzles
Bürker Cell Counting chamber	GLASWARENFABRIK KARL HECHT	40443001
Centrifuge	Eppendorf	5702 R
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	CLS431470	15 mL
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	EP0030120086	1.5 mL
Display	Sigma-Aldrich	BR718905
DMEM	Gibco Thermofisher	11965092
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Flanged linear ball bearing	Sourcing map	https://www.amazon.it/gp/product/ B07S6LZHM7/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	LMF8UU
Glass syringe	Fisher Scientific	11520062	Hamilton GasTight 1 mL (TLL terminal)
Hinges	YASQZ	https://www.amazon.it/gp/product/ B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Incubator	Fisher Scientific	15481374	Eppendorf Galaxy 48 R CO2 Incubator, 48 L, Stainless Steel
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti2-U
Jumper wires	Iverntech	https://www.amazon.it/Iverntech-XH2 -54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/ B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_ mcx_views_0_image?pd_rd_w=cb2r J&content-id=amzn1.sym.57a351cf- ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209%3 Aamzn1.symc.ca948091-a64d-450e- 86d7-c161ca33337b&pf_rd_p=57a3 51cf-ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209 &pf_rd_r=YHY9RFYZJK7PYAY2RXX D&pd_rd_wg=7WkXB&pd_rd_r=8239 66cb-4977-48ce-b095-0dcedf8c372f& pd_rd_i=B07Q12B6K5&th=1
LCD unit	Paradisetronic.com	https://www.amazon.it/Display-controller -conduttori-adattatore-stampante/dp/B01 DUR4064/ref=sr_1_9?__mk_it_IT=%C3 %85M%C3%85%C5%BD%C3%95%C3 %91&crid=1OAHVIIRA16X3&dib=eyJ2Ij oiMSJ9.07V2Jf7RzJjTUlIuFobUJFjUzG4 8633KkdcMXSEfnWLRX41d5vAF7xPBJ maniVxDoXecfihZzzOXlP3v-e29cUjoGLf GDyv5DoDVwp7ndohNTYvYzoi3gWkF- Hsd2YbT7tjb1Dra1afqSn26CbFdEvJ84y qyX7Gi3-7DHh8yMwdd6_7quiuW_mjsm w1nu0YQG68GZ0XM7unOsvyddQ__R_ 3dndxb3mOjgGjklEgu_KEbZJPOZDIdSo oU3nrrKHj56hCfk9ACwYpB80QGCbTPK 0p-fE0g9h02WPmtHV38UU3m5AdZsTQ HqvnVlJg703qGT-8ze8fQItw2rtbgl_J86H RMReJOhVLQBkqNwxh57CQ.yNbeFmZ ZBEUhadz2dQa8NxpZD9g4P6ighRU_97 yxgnw&dib_tag=se&keywords=display% 2B3D%2Bprinter%2Bprusa%2Bi3&nsdO ptOutParam=true&qid=1734714093&s= industrial&sprefix=display%2B3d%2B printer%2Bprusa%2Bi3%2Cindustrial% 2C143&sr=1-9&th=1	Old Prusa i3 LCD unit. Link to commercially available alternative
Leadscrew M8	RS PRO	280-408
Leadscrew nut M8	Comioke	https://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4? ref=ppx_yo2ov_dt_b_fed_asin_title&th=1	Nut for M8 screws
Leadscrew nut T8	Aipaide	https://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Nut for T8 screws
Leadscrew T8	VBESTLIFE	https://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Length 15 mm
L-Glutammine	Sigma-Aldrich	G7513
Limit switch	CESFONJER	https://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Linear ball bearing (LM4UU)	A ABSOPRO	https://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 4 x 8 x 12 mm
Linear ball bearing (LM8LUU)	Fdit	https://www.amazon.it/LM8LUU-Linear -Motion-cuscinetti-stampante/dp/B07N 58W3GZ/ref=sr_1_1_sspa?__mk_it_IT =%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=33VNCCCSIFJRP& dib=eyJ2IjoiMSJ9._JJ2doXI33C2JagX 8x6E2Bz2ILo10852tBi1erWqGn363ku zbcvknbMtsK6wm5jdR1P5XwC6Ovui at3kGIJPpYFOG_FiIBYT8xLkkbiphhR 4ncR6R9tPPyeN--_3RxFgKMh5tMO_ jesAcu7Anp87Qb91ruM85CKqduV-y6 HQJtAvVSXmfG4yE4N7d4_dDVKsR7 UkEmDIznJE0HIhvvI2R6vX2tMN5yMc _ZrUbUB0gPF6SgXHVJmKRizCRqL7J 64WRD-XnMSpVHY_LUVJ7gn9kJQ35 _zQw8vLD-_kRyvxwvE.4IVMdKzF1Ax mQHQhWEi6LH12UI4CmMgi288_g3zG CPY&dib_tag=se&keywords=LM8LUU+ Fdit&nsdOptOutParam=true&qid=17347 04494&s=industrial&sprefix=lm8luu+fdit+ %2Cindustrial%2C136&sr=1-1-spons&sp _csd=d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 45 mm
Linear ball bearing (LM8UU)	ARCELI	https://www.amazon.it/gp/product/ B07BV3YBP2/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 24 mm
Magnets	OCEUMAOA	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CB6C2RF4/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	8 x 3 mm
Matrigel	Gibco Thermofisher	LOT 0202003	SBMe
Motor driver	Longruner	https://www.amazon.it/gp/product/ B071P41ZBW/ref=ppx_yo_dt_b_search _asin_title?ie=UTF8&psc=1	Driver A4988
PBS	MicroGem, VWR	TL1006-500ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco Thermofisher	15070063
Pipette tips	Sigma-Aldrich	Z740058	BRAND filter tips, racked, TipBox (volume 50-1000 μL)
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti- plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0CF Q4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.bf7 Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_NuF ZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZgdzI 356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfklAYrb rXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPcLF2f2E EcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0sLPnM0ts wdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpVNMA4Kwh 0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9LLj1uMID2E Gi_ScmYqY5LahbYOmKVVPPiPIgCVdLjaM8 yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ 88x9GkX7EWuOwYO0dEUYSzHCdGONWo eZLfSJOR3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3A H53BtIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO 6upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq8 MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_ E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexiglass+ 2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-14	2 mm thickness, transparent sheet, 21 x 32.5 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.b f7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_N uFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZ gdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfk lAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPc LF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0s LPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpV NMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9 LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYOmKVVPP iPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHx mMeaQUqGkoQ88x9GkX7EWuOwYO0dE UYSzHCdGONWoeZLfSJOR3C6-knjzKrO Q0ziouJfo-ktbak7v3AH53BtIOiXbT57cKqh- uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6upc61MoydZujux nfLG7hwytqHQG2.ApKq8MVs8Xihn_zcA3 9nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_E&dib_tag=se &keywords=lastra+plexiglass+2+mm&nsd OptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-15	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 20 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9. bf7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_ NuFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHB tZgdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG- kfklAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJ PcLF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA 0sLPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh 4fpVNMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYft Xvvz9LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYO mKVVPPiPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge 2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ88x9GkX7E WuOwYO0dEUYSzHCdGONWoeZLfSJO R3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3AH53B tIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6 upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq 8MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJ N_E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexigl ass+2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1 734702823&sr=8-16	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 30 cm
Polylactic acid (PLA) filament	Flashforge	Black 100102
Power supply	SQUADO	https://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore -stabilizzato-dissipatore-efficienza /dp/B0DMTG6SJD/ref=sr_1_6?dib =eyJ2IjoiMSJ9.1vVze6Zt6fhKCvFb eAOSiRe57N6a1mlBnkLdHiEym4 ugHzueF6_FdOodb3sftCXb5raTg eerMMUbL5KcaI_SDa_2j7s2XohI B01QMJDyq0xQ5Gp3KLIZozDHV fGBdSrvwgyOl-BXSDy_ocZlj2TL5 e21p3K6qpvSaT5yo8WA5tngS93 Eqe8s8D6mjpnnPFrb9RpQpj299Y nNRYgr_YF3NCt3mH0r0FocKcCa LNpKtfGLCbnz_yB-360tp5SAi7A7 cgBf5I4NzQ5iQTTXAG727x0Hml mG-eaFBSJv6M1LPooZiT2aT7dx o_7tzyU6MQ9vAEozXkLTaTTMX RA_svPp96sxp93NRLReI64xpFd S3Zh1y_JPQijbMAIuvuYflhh6JlPB W6-fpW6QXl9v5wNEs_YwjzP9Sf RKxRmchzZhgsK-34XJeaEmjbRq H3piM0Zx.MfPYUNvCEhDBqLDh C-iqBEu-vjIVgsrQmOjeLuGo9YQ& dib_tag=se&keywords=power+sup ply+AC+INPUT%3A+110-220V%2 C+DC+OUTPUT%3A+12V+15A&n sdOptOutParam=true&qid=173471 4722&sr=8-6	Old Prusa i3 power supply (AC INPUT: 110-220 V, DC OUTPUT: 12 V 15 A). Link to commercially available alternative
Pulley 5 mm	VooGenzek	https://www.amazon.it/gp/product/ B0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Bore 5 mm, Width belt space 6 mm
Pulley 8 mm	Yxtaii	https://www.amazon.it/gp/product/ B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Bore 8 mm, Width belt space 6 mm
Ribbon cables	QUARKZMAN	https://www.amazon.it/sspa/click?ie =UTF8&spc=MTo0NDgyNTkwNzU wNjM5NzM5OjE3MzQ3MTQ1OTE6 c3BfbXRmOjMwMDEyMjk4NTMzN TYzMjo6MDo6&url=%2FQUARKZM AN-connettore-Lunghezza-Comput er-confezione%2Fdp%2FB0CQRM DQNG%2Fref%3Dsr_1_15_sspa% 3F__mk_it_IT%3D%25C3%2585M %25C3%2585%25C5%25BD%25 C3%2595%25C3%2591%26crid%3 D3BZ8Q05YA50TX%26dib%3Dey J2IjoiMSJ9.zoYnL2ViiarlDS_7165D ldxu-TTbVbWUVAP3pCybFB-bjGl wSgrpnkMhhsJj3NRo8Mvht8ev5H vGQ-UUpPom12OcOcwyRVXLAR UvMyTm8mpAdZSaOritwHRgwu2 JuW9UoS4jlCbA-gzP2FEAAH47K fFOWN6FEhc5r0YGBcSIsA6_QV6 _LA1k_ifj3c2BFm2Fj8YjW-auz7Yiy ULfZusvGX28S1K5kJdTa_YOwJY YC0Y__s-CCchHKiZgDhFjtFogUz0 Tonob4HQZiO_hkrnm3ixpNj9rgE- hvVq1FK1uD9M.kkP89x1SJ0SLxZ sv3YomYEfmkhpvP4WQf2TtC76K YAE%26dib_tag%3Dse%26keywords %3DCavo%2Bflessibile%2Ba%2Bna stro%2Bpiatto%2Bper%2Bstampant e%2B3D%2Ba%2B10%2Bpin%26n sdOptOutParam%3Dtrue%26qid% 3D1734714591%26s%3Dindustrial %26sprefix%3Dcavo%2Bflessibile %2Ba%2Bnastro%2Bpiatto%2Bper %2Bstampante%2B3d%2Ba%2B10 %2Bpin%252Cindustrial%252C170 %26sr%3D1-15-spons%26sp_csd% 3Dd2lkZ2V0TmFtZT1zcF9tdGY%26psc%3D1	ribbon cable 2651 28AWG 10 pins
Rigid shaft coupling	Gwolf	https://www.amazon.it/gp/product/ B088R8CW5Z/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Coupling from 5 to 8 mm
Rods 4 mm	RS-components	682-810	Diameter 4 mm
Rods 5 mm	Sourcingmap	a14010200ux0214	Diameter 5 mm
Rods 8 mm	RS-components	682-078	Diameter 8 mm
Screws	Bnnrjia	281-984	M2x6 - Flat head
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