Conception et validation d’une bio-imprimante à extrusion volumétrique pour la bio-impression d’extrait soluble de membrane basale pour la recherche translationnelle

Résumé

Les extraits solubles de membrane basale sont les matrices biologiques les plus largement utilisées dans la recherche sur le cancer, mais leur comportement rhéologique complexe rend leur bio-impression difficile avec les systèmes de bio-impression disponibles dans le commerce. Ce travail présente une stratégie de bio-impression personnalisée pour produire des constructions matricielles pures avec une bonne fidélité de forme en couches simples et multiples.

Résumé

Dans la recherche translationnelle, les modèles 3D in vitro sont essentiels pour faire progresser la compréhension scientifique et le développement thérapeutique. À cette fin, les extraits solubles de membrane basale (SBMes), dérivés de cellules de sarcome de souris, jouent un rôle clé dans la réplication des caractéristiques mécaniques et biochimiques du microenvironnement in vivo . Ils sont particulièrement précieux dans une variété de domaines de recherche, de l’ingénierie tissulaire aux tests de médicaments. En particulier, elles sont devenues fondamentales dans la recherche sur le cancer car les cultures cellulaires 2D traditionnelles, largement utilisées dans le domaine, peuvent fournir des informations trompeuses car elles ne capturent pas la structure tridimensionnelle (3D) et le microenvironnement tumoral.

Dans la recherche sur le cancer, des modèles 3D in vitro efficaces sont essentiels pour mieux comprendre l’évolution du cancer et anticiper les défis, tels que les mécanismes de résistance aux médicaments. Les organoïdes sont devenus des modèles 3D in vitro prometteurs, offrant une représentation plus précise de la biologie tumorale. Ils se développent dans les SBM car ils créent un environnement où les cellules peuvent se développer et s’auto-organiser en structures 3D. Cependant, le SBMe présente des défis importants, notamment de faibles propriétés mécaniques et un comportement rhéologique complexe, empêchant son utilisation avec les systèmes de bio-impression par extrusion pneumatique disponibles dans le commerce.

Pour remédier à ces limitations, nous avons développé un système de bio-impression à faible coût, contrôlé par volume, ainsi qu’un protocole spécifique pour l’impression de structures avec SBMe. Ce système est basé sur une extrudeuse volumétrique et surmonte les limites des approches pneumatiques traditionnelles. Une fois assemblé et programmé avec un code g spécifique, le système peut bio-imprimer des SBMe purs et dilués pour obtenir des constructions monocouches et multicouches. Cette approche offre une méthode plus fiable et plus évolutive pour produire des modèles de culture cellulaire 3D, ouvrant la voie à une recherche plus efficace sur de nouveaux traitements et des tests de médicaments.

Introduction

Dans la recherche translationnelle, la création de modèles 3D in vitro qui reproduisent fidèlement l’environnement in vivo est essentielle pour faire progresser la compréhension scientifique et le développement thérapeutique¹. Un élément clé de leur construction est l’utilisation d’analogues de matrice extracellulaire (ECM), tels que les extraits solubles de membrane basale (SBMes), qui reflètent mieux les complexités des tissus naturels. Les SBM sont particulièrement précieux dans divers domaines de recherche, de l’ingénierie tissulaire aux tests de médicaments ^2,3. En particulier, ils sont devenus fondamentaux dans la recherche sur le cancer, car ils reproduisent les caractéristiques mécaniques et biochimiques du microenvironnement tumoral, permettant le développement de modèles qui reflètent mieux la croissance tumorale, les métastases et les réponses au traitement.

En effet, malgré des progrès considérables au cours des dernières décennies, de nombreuses thérapies continuent d’échouer, entraînant de fréquents échecs thérapeutiques en milieu clinique. Cet échec est souvent attribué à des mécanismes de résistance aux médicaments causés par des niveaux élevés d’hétérogénéité cellulaire ^4,5. Des modèles in vitro efficaces, capables de récapituler avec précision les complexités des tumeurs humaines, sont cruciaux pour mieux comprendre l’évolution du cancer et anticiper ce phénomène.

Les cultures cellulaires 2D traditionnelles ont été fondamentales dans la recherche sur le cancer, mais peuvent conduire à des informations trompeuses sur l’efficacité des médicaments et le comportement tumorale, car elles ne parviennent pas à capturer la structure 3D et le microenvironnement des tumeurs réelles ^6,7,8. En revanche, les modèles 3D in vitro sont apparus comme des alternatives prometteuses, offrant une représentation plus précise du microenvironnement tumoral et du comportement biologique en imitant la complexité 3D ^9,10.

Dans la recherche sur le cancer, les organoïdes sont largement utilisés comme modèles 3D pour étudier les maladies et l’efficacité des médicaments, car ils fournissent des modèles plus précis et pertinents de tissus et d’organes humains. L’utilisation de SBMe, dérivé de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm, a joué un rôle essentiel dans l’avancement de la recherche sur le cancer^11,12. Il fournit un substrat semblable à un gel dans lequel les cellules peuvent croître, proliférer et s’auto-organiser en structures organoïdes, assurant ainsi un développement et une croissance corrects^13,14.

Cependant, SBMe pose un certain nombre de défis en raison de ses caractéristiques uniques et complexes. En tant que fluide non newtonien, le SBMe présente des propriétés d’amincissement par cisaillement, ce qui signifie que sa viscosité diminue avec l’augmentation de la contrainte de cisaillement, ce qui rend sa manipulation et son application incohérentes sous des forces variables. De plus, son comportement thixotrope ajoute à la complexité, car il peut récupérer sa viscosité au fil du temps lorsque la contrainte de cisaillement est supprimée^15,16. Ces propriétés, associées à une faible résistance mécanique (avec des valeurs de module de stockage allant de 10 Pa à 5 000 Pa selon la concentration en protéines) et à un comportement thermosensible, aggravent ces défis, nécessitant un contrôle méticuleux lors de la préparation et de l’utilisation ainsi que la bio-impression pure.

Les systèmes de bio-impression pneumatiques standard ne parviennent pas à contrôler correctement la distribution de SBMe, car l’application de la pression provoque un comportement incontrôlable après son éjection de la seringue. Il est affecté par un phénomène similaire à l’effet « spurt » décrit pour les fusions polymères, dans lequel le débit augmente brusquement au-dessus d’une certaine valeur de pression critique 17,18,19. Comme indiqué dans nos travaux précédents¹⁶, la stratégie de distribution par contrôle volumétrique permet de découpler l’extrusion SBMe de la pression générée dans le distributeur, qui dépend des propriétés rhéologiques de la matrice, des conditions de travail et de la géométrie de la buse. Ces dernières années, plusieurs tentatives ont été faites sur le marché pour exploiter le même principe, avec le Matribot de Corning en tête. Il permet la manipulation et le dépôt de SBMe et d’autres bio-encres sensibles à la température grâce à des conditions de température contrôlées. Cependant, cela peut être coûteux, limitant l’accessibilité pour les petits laboratoires.

Dans notre article précédent, nous avons présenté une alternative personnalisée à faible coût, un système de bio-impression volumétrique¹⁶. Cette version était basée sur une imprimante 3D d’entrée de gamme modifiée avec une extrudeuse imprimée en 3D personnalisée. Malgré son efficacité dans la bio-impression, il présentait certaines limites dans la répétabilité de l’impression. Étant dérivé d’une imprimante 3D d’entrée de gamme, il avait quelques problèmes avec les mouvements Z et l’auto-homing. Pour répondre à ces besoins, nous avons développé une version avancée de notre système de distribution volumétrique personnalisé à faible coût et un protocole spécifique pour les structures de bio-impression à l’aide de SBMe.

Ici, nous fournissons des protocoles pour la construction et l’utilisation de ce système. Il est composé d’une extrudeuse volumétrique personnalisée, basée sur notre étude précédente¹⁶, d’un boîtier de bio-imprimante et d’un système de contrôle. La production et l’assemblage sont effectués pour chaque module. Lorsqu’il est assemblé et programmé avec un fichier gcode spécifique, conformément à la description du protocole pour la manipulation des matrices, le système est capable de bio-imprimer des constructions pures ou diluées à l’aide du SBMe avec une bonne fidélité de forme en couches simples et multiples.

Protocole

1. 3D impression et assemblage de bio-imprimante volumétrique

1. Préparez et imprimez en 3D les composants de la bio-imprimante.
   1. Téléchargez le fichier *. Fichiers de conception STL du Fichier supplémentaire 1.
   2. Charger*. STL dans le logiciel de tranchage propriétaire pour définir l’orientation des pièces sur la plaque d’impression et toutes les options requises pour l’imprimante 3D. Imprimez les pièces à l’aide d’acide polylactique (PLA) avec des options de qualité moyenne (taille de buse de 0,4 mm, diamètre de filament de 1,75 mm, température de l’extrudeuse de 220 °C, température de la plaque de lit d’impression de 50 °C, hauteur de couche de 0,2 mm, vitesse d’impression de 300 mm/s).
      REMARQUE : Les options de qualité moyenne peuvent différer selon l’imprimante utilisée pour imprimer les pièces.
   3. Détachez les pièces imprimées du lit de l’imprimante 3D. Retirez les structures de support imprimées, le cas échéant, et polissez les surfaces si nécessaire.
2. Assemblez l’extrudeuse (Figure 1).
   1. Insérez deux roulements à billes linéaires (LM4UU) dans les trous verticaux du bloc poussoir. Insérez également un écrou de vis-mère T8 dans le trou central arrière et fixez-le avec quatre vis (M3x10).
   2. Fixez un accouplement d’arbre rigide au moteur pas à pas, puis fixez-le au boîtier du moteur de l’extrudeuse à l’aide de quatre vis (M3x6).
      REMARQUE : Orientez le moteur pas à pas en fonction de la rainure dans le boîtier du moteur de l’extrudeuse pour permettre un positionnement correct de la prise pour les câbles.
   3. Fixez le moteur pas à pas, assemblé à l’étape 1.2.2, à une vis mère T8 (150 mm) à l’aide de l’accouplement à arbre rigide préalablement inséré. Assurez-vous que chaque bloc est correctement fixé avec les vis de réglage.
   4. Fixez un palier à bride auto-alignant (diamètre intérieur de 8 mm) au bas de la base de l’extrudeuse à l’aide de deux vis (M4x8).
   5. Insérez deux roulements à billes (4 x 9 x 4 mm) dans les trous spécifiques situés sur le dessus de la base de l’extrudeuse et les deux autres dans les trous de la partie inférieure.
   6. Insérez la pièce assemblée (étape 1.2.1) dans la base de l’extrudeuse à travers la cavité située dans la partie supérieure de la structure. Connectez les quatre roulements à billes (étape 1.2.5) avec deux tiges de 4 mm, une de chaque côté. Laissez passer les tiges à travers les deux roulements à billes linéaires de la pièce assemblée à l’étape 1.2.1.
      REMARQUE : Il est également possible d’insérer d’abord les barres sur les deux roulements à billes supérieurs, puis de les placer dans la base de l’extrudeuse jusqu’à ce qu’elles atteignent le roulement à billes inférieur et que tout soit sécurisé dans les fentes définies.
   7. Insérez la pièce assemblée à l’étape 1.2.3 dans le trou central de la base de l’extrudeuse. Tournez la vis-mère pour passer l’écrou de la vis-mère et atteindre le palier de bride à alignement automatique. Utilisez les vis de réglage du composant pour verrouiller la vis mère et deux vis (M3x8) pour fixer le boîtier du moteur de l’extrudeuse sur le dessus de la base de l’extrudeuse.
   8. Utilisez deux autres vis (M3x40) et des écrous M3 pour fixer le dispositif de retenue de la bride du corps de la seringue à la partie inférieure de la base de l’extrudeuse, pour verrouiller la bride du corps de la seringue (insérer le sens de haut en bas). Utilisez deux autres vis (M3x30) et des écrous M3 pour fixer le dispositif de retenue du piston de la seringue aux trous supérieurs du bloc poussoir (insérer le sens de bas en haut) afin de verrouiller la bride du piston.
   9. Insérez deux vis (M4x80) dans deux ressorts et laissez-les passer à travers les trous présents dans la partie inférieure de la base de l’extrudeuse et le bloc de seringue. Vissez les écrous en laissant l’espace pour la seringue afin d’éviter que le bloc de seringue ne glisse.
      REMARQUE : Les vis doivent aller de l’arrière vers l’avant.
3. Assemblez l’axe X (Figure 2).
   1. Insérez quatre roulements à billes linéaires (LM8UU x 24 mm) dans le X_Left_Block et X_Right_Block pièces dans les trous supérieur et inférieur, deux pour chacun. Fixez également deux blocs de ceinture sur les blocs X droit et X gauche avec des vis (M2x10) en laissant de l’espace pour la ceinture.
   2. Insérez deux roulements à billes (5 x 16 x 5 mm) dans les trous centraux de X_Right_Block, un de chaque côté. Placez une poulie (alésage de 5 mm) dans la cavité intérieure de X_Right_Block et reliez les deux roulements à billes avec une tige de 5 mm (longueur 35 mm), en la laissant passer à travers la poulie.
      REMARQUE : Utilisez une tige plus longue pour l’assemblage afin d’avoir une meilleure manipulation. Après avoir positionné les pièces en place, coupez la tige de la longueur souhaitée.
   3. Fixez un interrupteur de fin de course au X_motor_housing à l’aide de deux vis (M3x8). Insérez le moteur NEMA 17 dans le carter du moteur et utilisez quatre vis (M3x8) pour fixer le couvercle du X_block_1 au carter du moteur et au moteur.
   4. Fixez une poulie (alésage 5 mm) au moteur et verrouillez-la avec des vis de réglage, puis vissez ensemble la pièce assemblée à l’étape 1.3.3 pour X_block_1 avec quatre vis (M5x8). Fixez également un interrupteur de fin de course au bas de X_Left_Block avec deux vis (M3x8).
      REMARQUE : Le diamètre extérieur des poulies des étapes 1.3.2 et 1.3.4 doit être le même.
   5. Placez deux roulements à billes linéaires (LM8UU x 45 mm) dans les trous en haut et en bas du X_slider.
   6. Connectez les pièces assemblées aux étapes 1.3.2 et 1.3.4 à l’aide de deux tiges de 8 mm (longueur 200 mm) et laissez-les passer à travers la pièce assemblée à l’étape 1.3.5.
      REMARQUE : Coupez les tiges de la longueur souhaitée avant de les assembler.
   7. Verrouillez une extrémité de la courroie à la X_slider_belt_connection à l’aide du bloc de courroie et de deux vis (M2x8). Faites passer la courroie autour de la poulie dans la pièce assemblée 1.3.4, puis autour de la poulie dans la pièce assemblée 1.3.2 et fixez l’autre extrémité de la courroie à la connexion X_slider_belt à l’aide du deuxième bloc de courroie et de deux autres vis (M2x8). Assurez-vous que la ceinture est correctement serrée pour obtenir le bon mouvement.
      REMARQUE : Au cours de cette étape, le X_slider doit être déplacé vers une extrémité de la structure de l’axe X pour éviter les interférences.
   8. Vissez le X_slider_belt_connection au X_slider à l’aide d’une vis (M6x20).
   9. Connectez l’extrudeur à la X_slider et fixez-le à l’aide de quatre vis (M5x10).
4. Assemblez l’axe Y (Figure 3).
   1. Placez le support de fixation sur la partie arrière de la bio-imprimante à l’aide de quatre vis (M3x10) et de quatre écrous.
      REMARQUE : La position du support de fixation peut être adaptée pour obtenir la bonne tension de la courroie et permettre l’insertion du moteur pas à pas.
   2. Insérez le moteur pas à pas dans le support de fixation et vissez-le à l’aide de quatre vis (M3x8). Ensuite, placez une poulie (alésage 5 mm) sur le vilebrequin et fixez-la avec des vis de réglage.
      REMARQUE : La poulie peut être fixée au vilebrequin avant de mettre le moteur dans le support de fixation pour éviter certaines interférences entre les composants.
   3. Localisez deux poulies (8 mm de diamètre intérieur) sur la tige avant de 8 mm et verrouillez-les sur les deux tiges (à 2,5 cm de l’extrémité). Répétez cette opération pour la tige arrière et ajoutez une autre poulie, à 5 cm de l’extrémité droite.
   4. Fixez 12 paliers à bride auto-alignants (8 mm de diamètre) aux parties supérieures intérieures de la bio-imprimante.
   5. Connectez les deux pièces de la bio-imprimante à l’avant et les deux pièces de la bio-imprimante à l’arrière (direction gauche/droite) à l’aide des tiges assemblées à l’étape 1.4.3 et verrouillez-les sur les roulements à bride à alignement automatique (8 mm de diamètre). Fixez les deux pièces assemblées à toutes les jonctions avec des vis (M3x8).
      REMARQUE : Lors du positionnement de la tige arrière, placez une courroie fermée qui relie la poulie sur le moteur pas à pas avec la poulie intérieure sur la tige.
      REMARQUE : Fixez le moteur pas à pas en serrant les écrous pour assurer l’absence de mouvement du moteur et une tension correcte de la courroie.
   6. Connectez les deux pièces assemblées à l’étape 1.4.5 à l’aide de quatre tiges de 8 mm. Laissez passer les tiges à travers les roulements à billes linéaires présents dans la pièce assemblée 1.3 et verrouillez-les sur les roulements à bride auto-alignants (8 mm de diamètre). Fixez les deux pièces assemblées à toutes les jonctions avec des vis (M3x8).
   7. Fixez une extrémité de courroie ouverte sur la partie supérieure du X_block_1 à l’aide du bloc de courroie et répétez cette opération pour le X_block_2. Faites passer la courroie autour des poulies arrière sur la gauche, puis autour de la poulie avant, et fixez à nouveau l’autre extrémité de la courroie au X_block_1 avec un autre bloc de courroie. Répétez cette opération pour la deuxième bande.
      REMARQUE : Les courroies doivent être correctement serrées pour obtenir le mouvement correct et de la même longueur pour éviter la flexion ou l’interférence dans les mouvements en Y.
5. Assemblez l’axe Z (Figure 4).
   1. Vissez ensemble les pièces inférieures du boîtier de la bio-imprimante (M4x8).
   2. Fixez un palier à bride auto-alignant (8 mm de diamètre) au sol du bas de la pièce assemblée à l’étape 1.5.2.
   3. Fixez deux roulements à billes linéaires à brides (LMH8UU) aux trous extérieurs présents dans le Z_slider et un écrou de vis-mère dans le trou central avec des vis (M3x8).
   4. Fixez un interrupteur de fin de course sur le côté Z_plane gauche à l’aide de deux vis (M3x8).
   5. Fixez le moteur pas à pas à un accouplement à arbre rigide. Fixez un moteur pas à pas à la Z_block à l’aide de quatre vis (M3x20) et d’une tige filetée à l’accouplement à arbre rigide. Assurez-vous que chaque bloc est correctement fixé avec les vis de réglage.
   6. Connectez la pièce assemblée à l’étape 1.5.5 à la base de la bio-imprimante à l’aide de deux tiges de 8 mm. Laissez-les passer à travers la pièce assemblée à l’étape 1.5.3.
   7. Fixez le Z_block au panneau arrière à l’aide de deux vis (M5x8).
   8. Connectez Z_plane à Z_slider à l’aide de quatre vis (M3x25). Insérez-les dans les trous de Z_plane de haut en bas, passez le ressort entre Z_plane et Z_slider et fixez-les avec des écrous. Ajustez la tension du ressort pour niveler le rabot.
   9. Fixez quatre pieds réglables sous la structure de la bio-imprimante dans la cavité spécifique. Mettez la bio-imprimante à niveau en ajustant les pieds.
   10. Connectez la pièce assemblée à la pièce assemblée à l’étape 1.4.6 à l’aide de huit vis (M4x12).
   11. Fixez deux charnières à l’avant de la structure aux endroits spécifiques et un aimant sur la partie droite à l’endroit correspondant avec des vis (M2x8). Vissez l’ensemble de la structure sur des plaques de plexiglas transparentes de 2 mm pour fermer les ouvertures.
       REMARQUE : Vissez le panneau avant en plexiglas aux charnières et mettez une autre vis en correspondance avec l’aimant pour obtenir une porte avant.
6. Affichez l’ensemble (Figure 5A).
   1. Laissez passer les fils, connectés à l’écran, par le trou inférieur et fixez l’écran au boîtier de l’écran à l’aide de quatre vis (M3x3).
      REMARQUE : Ce passage doit être effectué sans le couvercle du bouton LCD. Il peut être situé sur le bouton préinstallé après la fixation au boîtier de l’écran.
   2. Fermez le boîtier avec le couvercle à l’aide de quatre vis (M2x6).
   3. Insérez la carte SD dans l’emplacement gauche.
   4. Laissez passer les fils à travers le trou situé sur le dessus de la structure. Vissez la pièce assemblée en haut de la bio-imprimante à l’aide de deux vis (M3x8).
      REMARQUE : Tous les fils (moteurs, interrupteurs de fin de course et écran) passeront près du mur et sortiront du trou inférieur gauche. Ils sont fixés à l’aide de serre-câbles pour éviter les interférences avec les pièces mécaniques.
7. Assemblage électronique (Figure 5B)
   1. Fixez la douille à la partie extérieure du boîtier électronique à l’aide de deux vis (M3x10).
   2. Fixez la carte mère à la partie intérieure du boîtier électronique à l’aide de quatre vis (M3x10).
   3. Fixez la partie inférieure de l’alimentation à la partie intérieure du boîtier électronique à l’aide de quatre vis (M3x8).
   4. Passez les fils dans le trou circulaire du couvercle et connectez-les à la carte mère. Fermez le boîtier électronique avec son couvercle à l’aide de quatre vis (M3x10).
      REMARQUE : Il est possible de connecter le boîtier électronique à la structure de la bio-imprimante ou de le laisser sur le bureau en cas de petits espaces de travail.
      La figure 6 montre toutes les connexions de câbles électroniques. Ils peuvent être légèrement différents en fonction de la carte mère de l’imprimante 3D utilisée.

2. Paramétrage du logiciel et processus de génération de gcode

1. Préparation des paramètres du logiciel de découpage
   1. Ouvrez le logiciel de découpage.
      REMARQUE : Les instructions peuvent différer selon le logiciel utilisé ou la version.
   2. Connectez-vous à la plateforme.
   3. Allez dans les options Paramètres . Sélectionnez l’imprimante, puis Ajouter une imprimante non connectée. Sélectionnez Imprimante FFF personnalisée et, dans la zone Nom de l’imprimante, tapez le nom de l’imprimante. Cliquez sur Ajouter.
      REMARQUE : S’il s’agit de la première installation logicielle, le panneau Ajouter une imprimante s’ouvrira automatiquement après la connexion.
   4. Dans la fenêtre Paramètres de la machine, modifiez les paramètres par défaut x, y, z en 176, 120, 45 mm.
   5. Désélectionnez l’option Lit chauffant si elle n’est pas déjà désélectionnée.
   6. Insérez dans les panneaux G-code de début et Fin du g-code les lignes de texte indiquées dans les fichiers intitulés 'JoVE_Starting_G-code.txt' et 'JoVE_Ending_G-code.txt' dans le fichier supplémentaire 2.
      1. Modifiez la valeur 150 de la ligne 'M92 E150' dans le fichier de g-code de départ en fonction du débit à appliquer. Estimez la valeur correcte à l’aide de la formule suivante :
         
         Où Q est le débit souhaité [μL/min].
         REMARQUE : Cette formule a été obtenue expérimentalement avec le système décrit. Il peut en être autrement s’il y a des modifications au niveau des composants mécaniques ou électriques. Une alternative possible pourrait être de fixer la valeur en fonction du système utilisé et de créer un code MATLAB personnalisé pour générer le fichier gcode souhaité.
   7. Changez la valeur du diamètre du matériau compatible dans le panneau de l’extrudeuse 1 sur 1,75 , puis fermez.
   8. Allez sur Marketplace, sélectionnez le plugin Z Offset Setting et installez-le. À la fin du processus, redémarrez le logiciel pour finaliser. Une fois qu’il s’ouvre à nouveau, sélectionnez Paramètres | Imprimante | Gérer les imprimantes dans la barre d’outils. Dans la fenêtre Préférences , cliquez sur Paramètres et activez toutes les options en sélectionnant Cocher toutes les options et fermez-la.
   9. Configurez la configuration en cliquant sur Paramètres d’impression (troisième bouton) dans le menu de l’étape , qui contient le panneau de configuration . Entrez le pourcentage de remplissage dans le profil d’impression actuel dans le panneau de configuration . Sélectionnez le bouton Personnalisé pour modifier les paramètres d’impression actuels et le profil Fine dans le menu déroulant. Réglez la vitesse d’impression sur 10 mm/s.
2. Préparation gcode
   1. Téléchargez le fichier *. Dossier de conception STL, intitulé « JoVE_Square », tiré du Dossier supplémentaire 2 de cet article.
   2. Charger. STL dans le logiciel de découpage.
   3. Localisez la pièce sur la surface plane et déplacez-la aux coordonnées 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Créez deux copies en cliquant sur le . STL dans la liste des objets et en sélectionnant l’option multiplier la sélection. Déplacez-les aux coordonnées suivantes : 16, 42,5, 0 mm et -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      REMARQUE : Il n’est pas possible de définir automatiquement l’ordre d’impression à moins d’être modifié manuellement directement dans le fichier gcode final. Les coordonnées sont définies pour une plaque à 6 multipuits.
   4. Allez dans les paramètres d’impression dans le menu de l’étape . Dans la section Murs , mettez 0 comme Nombre de lignes de mur. Mettez 0 comme valeur d’épaisseur Haut/Bas dans la section Haut/Bas . Dans le panneau Remplissage , insérez les valeurs suivantes : Motif de remplissage : Grille, Distance de la ligne de remplissage : 5 mm, Directions de la ligne de remplissage : [0].
      REMARQUE : Il est possible de réduire la vitesse de déplacement dans la section Vitesse d’impression pour améliorer la précision de l’axe X.
   5. Désactivez la rétraction dans la section Voyage et le refroidissement de l’impression dans la section Refroidissement .
   6. Dans la section Adhérence de la plaque de fabrication , sélectionnez Aucun comme type d’adhérence de la plaque de fabrication, tandis que dans la section Modes spéciaux , sélectionnez l’option Un à la fois comme Séquence d’impression.
   7. Cliquez sur le bouton Slice pour générer le g-code.
   8. Ouvrez le fichier g-code avec l’application Bloc-notes et supprimez les lignes « M104 S200 », « M105 » et « M109 S200 » à la ligne 12 après la phrase « ; Généré avec Cura_SteamEngine 4.9.0".
   9. Ajouter « G1 Z25 » avant la ligne suivante « ; MAILLE : JoVE_Square_rev. STL(6)" et scindions le suivant en deux : (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 et (2) G1 Z0.3.
      REMARQUE : Les coordonnées X et Y ne sont que des exemples.
   10. Modifiez la valeur Z à Z25 dans chaque ligne présente après " ; TIME_ELAPSED" commentent chaque instruction de chaque couche.
       REMARQUE : Pour l’impression d’une seule pièce, l’étape 2.3.10 n’est pas nécessaire.

3. Test de gonflement/dégradation

1. Étapes préparatoires
   1. Prenez une seringue en verre stérile de 1 mL (terminal TLL) et une buse conique stérile de 25 G. Assemblez-les et mettez la seringue assemblée au réfrigérateur.
   2. Mettez les pointes de pipette et le flacon de matrice SBMe au réfrigérateur pendant la nuit la veille de l’expérience.
   3. Imprimez trois grilles PLA (Φ = 20 mm) avec des pores circulaires de 1 mm x 1 mm et un pilier vertical latéral pour les saisir.
2. Constructions d’impression
   1. Sortez la seringue assemblée et le flacon de matrice SBMe du réfrigérateur. Aspirez 500 μL de la matrice SBMe et mettez-la dans l’incubateur pendant 15 min pour permettre la gélification.
   2. Sortez la seringue de l’incubateur et placez-la dans la tête d’impression de la bio-imprimante. Assurez-vous que le piston de la seringue est correctement en contact avec le bloc poussoir.
   3. Fixez le piston de fixation de la seringue et la bride du corps de la seringue avec les dispositifs de retenue du piston de la seringue et le corps de la seringue avec la pince de seringue.
   4. Calibrez le système à l’aide du paramètre Auto-home dans le menu de la bio-imprimante pour détecter automatiquement l’origine des axes.
   5. Déplacez l’extrudeur à l’aide de la commande Déplacer les axes jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille touche la grille PLA pour définir manuellement Z0.
   6. Lancez l’impression en sélectionnant le fichier g-code à imprimer dans le menu de la bio-imprimante.
   7. Mettez la plaque multipuits dans l’incubateur pendant 2 min pour permettre au SBMe de se stabiliser après l’extrusion.
   8. Prenez la plaque multipuits et mettez 2 ml de milieu de culture cellulaire dans les trois puits contenant les grilles bio-imprimées. Placez la plaque multipuits dans l’incubateur.
   9. À chaque point temporel (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 et 14 jours), prenez chaque grille de la plaque et séchez-la avec du papier propre pour enlever l’excès de support et de poids sur une balance. Remettez la grille dans la plaque puis dans l’incubateur pour continuer l’expérience. Estimez le taux de gonflement et le taux de dégradation à l’aide des formules suivantes :
      
      Où W_t est le poids des constructions à chaque point temporel et W_t0 le poids des constructions séchées.
      
      Où W_i est le poids à la fin de l’essai de gonflement.

4. Bio-impression des constructions SBMe

1. Étapes préparatoires
   1. Prenez une seringue en verre stérile de 1 mL (borne TLL) et une buse conique stérile de 25 G et assemblez-les sous l’enceinte de sécurité biologique. Mettez-les dans une boîte stérile au réfrigérateur.
   2. Mettez les pointes de pipette et le flacon de matrice SBMe au réfrigérateur pendant la nuit (4 °C sur glace) la veille de l’expérience.
   3. Ajouter 20 μL de bleu trypan dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
   4. Réglez la centrifugeuse à 345 × g, 4 °C et laissez-la refroidir (~3-4 h).
   5. Prenez 5 ml d’eau dans un tube de centrifugation de 15 ml comme balance pour la centrifugeuse.
   6. Solution tampon de phosphate chaude (PBS) et milieu dans un bain-marie.
      REMARQUE : Le milieu de culture cellulaire est composé d’un milieu d’aigle modifié Dulbecco complet (DMEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de la pénicilline-streptomycine et de la L-glutamine.
   7. Placez la bio-imprimante sous l’enceinte de sécurité biologique. Stériliser à la lumière UV pendant 20 min.
      REMARQUE : Pour assurer le bon fonctionnement de la bio-imprimante, exécutez la fonction Auto-home et vérifiez les mouvements corrects de chaque axe et le fonctionnement des interrupteurs de fin de course.
2. Préparation de la bioencre
   1. Prenez le flacon dans l’incubateur contenant des cellules cancéreuses de la prostate murines commerciales et placez-le sous l’enceinte de biosécurité.
   2. Retirer le milieu de culture cellulaire de la fiole.
      REMARQUE : Les volumes indiqués dans ce protocole s’appliquent aux flacons de culture cellulaire T25.
   3. Lavez une fois les cellules avec 2 ml de PBS, puis aspirez-les.
   4. Ajouter 500 μL de trypsine et mettre le ballon dans l’incubateur pendant 5 min pour permettre le détachement cellulaire de la plaque.
   5. Vérifiez que les cellules ne sont pas trypsinisées et, si nécessaire, tapotez doucement le fond du ballon.
   6. Ajouter 4,5 ml de produit moyen dans la fiole. Lavez soigneusement la plaque pour vous assurer que toutes les cellules détachées flottent dans le milieu de culture cellulaire.
   7. Aspirez le milieu et ajoutez-le dans un tube à centrifuger de 15 ml.
   8. Prenez une aliquote de 20 μL et mélangez-la avec l’aliquote de bleu de trypan. Ensuite, mettez 10 μL de ce mélange dans la chambre de comptage des cellules pour compter les cellules vivantes à l’aide de la formule suivante :
      
      où f est le facteur de dilution de la suspension de bleu de trypan (rapport 1:1) ; V est le volume de suspension cellulaire [mL].
   9. Centrifuger la suspension cellulaire restante pendant 5 minutes (345 × g, 4 °C).
   10. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans la matrice SBMe froide à la densité cellulaire souhaitée (10,⁶ cellules/mL)
   11. Aspirer 800 μL de la suspension matricielle contenant des cellules avec la seringue froide.
   12. Retirez les bulles d’air qui pourraient être piégées dans la seringue et mettez-la dans une boîte stérile. Ensuite, placez-le dans l’incubateur pendant 15 min pour permettre la gélification.
3. Procédé de bio-impression
   1. Prenez la seringue de l’incubateur et placez-la dans la tête d’impression de la bio-imprimante. Assurez-vous que le piston de la seringue est correctement en contact avec le bloc poussoir.
      REMARQUE : Le modèle et le volume doivent être les mêmes que ceux de la seringue utilisée pour l’expérience.
   2. Fixez le piston de fixation de la seringue et la bride du corps de la seringue avec les dispositifs de retenue du piston de la seringue et le corps de la seringue avec la pince de seringue.
   3. Utilisez des écrous M4 dans la partie inférieure de l’extrudeuse pour ajuster la pression du ressort et verrouiller la seringue en place.
      REMARQUE : Les étapes 4.3.1 à 4.3.4 sont illustrées à la figure 7.
   4. Calibrez le système à l’aide du paramètre Auto-home dans le menu de la bio-imprimante pour détecter automatiquement l’origine des axes.
      REMARQUE : Ce passage assure toujours les bons réglages initiaux, indépendamment du type de support que nous utilisons pour l’impression.
   5. Placez une plaque à 6 puits multiples sur le plan d’impression.
   6. Déplacez l’extrudeur à l’aide de la commande Déplacer les axes jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille touche le fond du puits pour définir manuellement Z0.
   7. Sélectionnez le fichier gcode dans l’option de menu du menu de la bio-imprimante et lancez l’impression. Une grille carrée à six couches (2,6 cm de côté) sera imprimée dans chaque puits.
   8. Après le processus de bio-impression, utilisez un microscope inversé pour vous assurer que le processus d’impression a réussi et placez la plaque multipuits dans l’incubateur pendant 2 minutes pour permettre au SBMe de se stabiliser après l’extrusion.
   9. Mettez 2 ml de milieu de culture cellulaire dans chaque puits.
      REMARQUE : Le volume doit couvrir entièrement les constructions.

Résultats

Dans cet article, nous présentons un protocole pour les constructions de bio-impression en SBMe à l’aide d’une bio-imprimante volumétrique peu coûteuse et personnalisée. Nous fournissons une description détaillée et une impression 3D*. STL pour construire le système et nous démontrons son utilisation potentielle dans la recherche sur le cancer en imprimant des structures monocouches et multicouches. Chaque composant imprimé en 3D a été correctement nettoyé de la structur...

Discussion

Dans la recherche translationnelle, les SBM sont particulièrement précieux dans divers domaines de recherche, de l’ingénierie tissulaire aux tests de médicaments ^2,3. En particulier, ils sont devenus fondamentaux dans la recherche sur le cancer, car ils reproduisent les caractéristiques mécaniques et biochimiques du microenvironnement tumoral, permettant le développement de modèles qui reflètent mieux la croissance tum...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-multiwell plate	Sigma-Aldrich	CLS351143
3D FDM printer	Flashforge	Adventurer 5M Pro
3D printer Motherboard	GEETECH	GT2560 REV A+
6-multiwell plate	Sigma-Aldrich	M8687
AC socket	HiLetgo	https://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket -Holder-Switch/dp/B0814PT3YG/ref=sr_1_1?__ mk_it_IT=%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=2TRIBP34VJ61A &dib=eyJ2IjoiMSJ9.zW6_VmeiudR I4yMpjJqJm7OdeoctTKW2mrEzml BAyJVa1hkM4PiJT3pLY0mXdxm1 AZQxa2_f5J4q4d5v3vUeqLkjJ6BM kWHAoeEfbEQJNuZaQ3NjmUlqWy _1AfQpnRp4VqJ2m3bkWsChztCa Ok-ZdQJlobGxJaMKg7WbV352 Hyo.0tEw2GYoPQJ4SdNYXO1XM Jrl2yXMvRey55Hj7GhISkk&dib_ tag=se&keywords=AC+socket+HiLetgo&nsdOpt OutParam=true&qid=1734702097&sprefix=ac+ socket+hiletgo%2Caps%2C173&sr=8-1	15 A 250 V
Adjustable feet	EXIN DEHCEN	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CPLTSNQB/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Height 27-40 mm
Ball bearing 4 mm	QUARKZMAN	684ZZ	Dimensions 4 x 9 x 4 mm
Ball bearing 5 mm	XiKe	625-2RS	Dimensions 5 x 16 x 5 mm
Belt closed	Turmberg3D	https://www.amazon.it/gp/product/ B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Width 6 mm
Belt open	Fajoeda	https://www.amazon.it/gp/product/ B09QCTVPTH/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Width 6 mm
Bioprinting nozzle	Fisher Scientific	17780789	Corning Standard Conical Bioprinting Nozzles
Bürker Cell Counting chamber	GLASWARENFABRIK KARL HECHT	40443001
Centrifuge	Eppendorf	5702 R
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	CLS431470	15 mL
Centrifuge tube	Sigma-Aldrich	EP0030120086	1.5 mL
Display	Sigma-Aldrich	BR718905
DMEM	Gibco Thermofisher	11965092
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Flanged linear ball bearing	Sourcing map	https://www.amazon.it/gp/product/ B07S6LZHM7/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	LMF8UU
Glass syringe	Fisher Scientific	11520062	Hamilton GasTight 1 mL (TLL terminal)
Hinges	YASQZ	https://www.amazon.it/gp/product/ B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Incubator	Fisher Scientific	15481374	Eppendorf Galaxy 48 R CO2 Incubator, 48 L, Stainless Steel
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti2-U
Jumper wires	Iverntech	https://www.amazon.it/Iverntech-XH2 -54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/ B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_ mcx_views_0_image?pd_rd_w=cb2r J&content-id=amzn1.sym.57a351cf- ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209%3 Aamzn1.symc.ca948091-a64d-450e- 86d7-c161ca33337b&pf_rd_p=57a3 51cf-ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209 &pf_rd_r=YHY9RFYZJK7PYAY2RXX D&pd_rd_wg=7WkXB&pd_rd_r=8239 66cb-4977-48ce-b095-0dcedf8c372f& pd_rd_i=B07Q12B6K5&th=1
LCD unit	Paradisetronic.com	https://www.amazon.it/Display-controller -conduttori-adattatore-stampante/dp/B01 DUR4064/ref=sr_1_9?__mk_it_IT=%C3 %85M%C3%85%C5%BD%C3%95%C3 %91&crid=1OAHVIIRA16X3&dib=eyJ2Ij oiMSJ9.07V2Jf7RzJjTUlIuFobUJFjUzG4 8633KkdcMXSEfnWLRX41d5vAF7xPBJ maniVxDoXecfihZzzOXlP3v-e29cUjoGLf GDyv5DoDVwp7ndohNTYvYzoi3gWkF- Hsd2YbT7tjb1Dra1afqSn26CbFdEvJ84y qyX7Gi3-7DHh8yMwdd6_7quiuW_mjsm w1nu0YQG68GZ0XM7unOsvyddQ__R_ 3dndxb3mOjgGjklEgu_KEbZJPOZDIdSo oU3nrrKHj56hCfk9ACwYpB80QGCbTPK 0p-fE0g9h02WPmtHV38UU3m5AdZsTQ HqvnVlJg703qGT-8ze8fQItw2rtbgl_J86H RMReJOhVLQBkqNwxh57CQ.yNbeFmZ ZBEUhadz2dQa8NxpZD9g4P6ighRU_97 yxgnw&dib_tag=se&keywords=display% 2B3D%2Bprinter%2Bprusa%2Bi3&nsdO ptOutParam=true&qid=1734714093&s= industrial&sprefix=display%2B3d%2B printer%2Bprusa%2Bi3%2Cindustrial% 2C143&sr=1-9&th=1	Old Prusa i3 LCD unit. Link to commercially available alternative
Leadscrew M8	RS PRO	280-408
Leadscrew nut M8	Comioke	https://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4? ref=ppx_yo2ov_dt_b_fed_asin_title&th=1	Nut for M8 screws
Leadscrew nut T8	Aipaide	https://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Nut for T8 screws
Leadscrew T8	VBESTLIFE	https://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Length 15 mm
L-Glutammine	Sigma-Aldrich	G7513
Limit switch	CESFONJER	https://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Linear ball bearing (LM4UU)	A ABSOPRO	https://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref =ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 4 x 8 x 12 mm
Linear ball bearing (LM8LUU)	Fdit	https://www.amazon.it/LM8LUU-Linear -Motion-cuscinetti-stampante/dp/B07N 58W3GZ/ref=sr_1_1_sspa?__mk_it_IT =%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3% 95%C3%91&crid=33VNCCCSIFJRP& dib=eyJ2IjoiMSJ9._JJ2doXI33C2JagX 8x6E2Bz2ILo10852tBi1erWqGn363ku zbcvknbMtsK6wm5jdR1P5XwC6Ovui at3kGIJPpYFOG_FiIBYT8xLkkbiphhR 4ncR6R9tPPyeN--_3RxFgKMh5tMO_ jesAcu7Anp87Qb91ruM85CKqduV-y6 HQJtAvVSXmfG4yE4N7d4_dDVKsR7 UkEmDIznJE0HIhvvI2R6vX2tMN5yMc _ZrUbUB0gPF6SgXHVJmKRizCRqL7J 64WRD-XnMSpVHY_LUVJ7gn9kJQ35 _zQw8vLD-_kRyvxwvE.4IVMdKzF1Ax mQHQhWEi6LH12UI4CmMgi288_g3zG CPY&dib_tag=se&keywords=LM8LUU+ Fdit&nsdOptOutParam=true&qid=17347 04494&s=industrial&sprefix=lm8luu+fdit+ %2Cindustrial%2C136&sr=1-1-spons&sp _csd=d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 45 mm
Linear ball bearing (LM8UU)	ARCELI	https://www.amazon.it/gp/product/ B07BV3YBP2/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Dimensions 8 x 15 x 24 mm
Magnets	OCEUMAOA	https://www.amazon.it/gp/product/ B0CB6C2RF4/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	8 x 3 mm
Matrigel	Gibco Thermofisher	LOT 0202003	SBMe
Motor driver	Longruner	https://www.amazon.it/gp/product/ B071P41ZBW/ref=ppx_yo_dt_b_search _asin_title?ie=UTF8&psc=1	Driver A4988
PBS	MicroGem, VWR	TL1006-500ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco Thermofisher	15070063
Pipette tips	Sigma-Aldrich	Z740058	BRAND filter tips, racked, TipBox (volume 50-1000 μL)
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti- plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0CF Q4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.bf7 Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_NuF ZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZgdzI 356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfklAYrb rXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPcLF2f2E EcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0sLPnM0ts wdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpVNMA4Kwh 0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9LLj1uMID2E Gi_ScmYqY5LahbYOmKVVPPiPIgCVdLjaM8 yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ 88x9GkX7EWuOwYO0dEUYSzHCdGONWo eZLfSJOR3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3A H53BtIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO 6upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq8 MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_ E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexiglass+ 2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-14	2 mm thickness, transparent sheet, 21 x 32.5 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.b f7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_N uFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHBtZ gdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG-kfk lAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJPc LF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA0s LPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh4fpV NMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYftXvvz9 LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYOmKVVPP iPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge2xa6OAHx mMeaQUqGkoQ88x9GkX7EWuOwYO0dE UYSzHCdGONWoeZLfSJOR3C6-knjzKrO Q0ziouJfo-ktbak7v3AH53BtIOiXbT57cKqh- uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6upc61MoydZujux nfLG7hwytqHQG2.ApKq8MVs8Xihn_zcA3 9nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_E&dib_tag=se &keywords=lastra+plexiglass+2+mm&nsd OptOutParam=true&qid=1734702823&sr=8-15	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 20 cm
Plexiglass sheets	MVQPER	https://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti -plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9. bf7Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_ NuFZLz9A7uJKGa_RNeni6NiO4YQfAjVHB tZgdzI356XVc3BIuKVpV8Pfg0rImqNXgxG- kfklAYrbrXv4tV6RL1ShFwgLzfQh8R0sEoFJ PcLF2f2EEcGMlvEwOuCv6qRnS1MQ-VaA 0sLPnM0tswdL4sLVxsonWcfSrHAUrgWh 4fpVNMA4Kwh0UaeQhfexFY0dNWhPYft Xvvz9LLj1uMID2EGi_ScmYqY5LahbYO mKVVPPiPIgCVdLjaM8yqNp2ZJGV9Fge 2xa6OAHxmMeaQUqGkoQ88x9GkX7E WuOwYO0dEUYSzHCdGONWoeZLfSJO R3C6-knjzKrOQ0ziouJfo-ktbak7v3AH53B tIOiXbT57cKqh-uc9wI_j_lHN-8okAe2yO6 upc61MoydZujuxnfLG7hwytqHQG2.ApKq 8MVs8Xihn_zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJ N_E&dib_tag=se&keywords=lastra+plexigl ass+2+mm&nsdOptOutParam=true&qid=1 734702823&sr=8-16	2 transparent sheets, 2 mm thickness, 20 x 30 cm
Polylactic acid (PLA) filament	Flashforge	Black 100102
Power supply	SQUADO	https://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore -stabilizzato-dissipatore-efficienza /dp/B0DMTG6SJD/ref=sr_1_6?dib =eyJ2IjoiMSJ9.1vVze6Zt6fhKCvFb eAOSiRe57N6a1mlBnkLdHiEym4 ugHzueF6_FdOodb3sftCXb5raTg eerMMUbL5KcaI_SDa_2j7s2XohI B01QMJDyq0xQ5Gp3KLIZozDHV fGBdSrvwgyOl-BXSDy_ocZlj2TL5 e21p3K6qpvSaT5yo8WA5tngS93 Eqe8s8D6mjpnnPFrb9RpQpj299Y nNRYgr_YF3NCt3mH0r0FocKcCa LNpKtfGLCbnz_yB-360tp5SAi7A7 cgBf5I4NzQ5iQTTXAG727x0Hml mG-eaFBSJv6M1LPooZiT2aT7dx o_7tzyU6MQ9vAEozXkLTaTTMX RA_svPp96sxp93NRLReI64xpFd S3Zh1y_JPQijbMAIuvuYflhh6JlPB W6-fpW6QXl9v5wNEs_YwjzP9Sf RKxRmchzZhgsK-34XJeaEmjbRq H3piM0Zx.MfPYUNvCEhDBqLDh C-iqBEu-vjIVgsrQmOjeLuGo9YQ& dib_tag=se&keywords=power+sup ply+AC+INPUT%3A+110-220V%2 C+DC+OUTPUT%3A+12V+15A&n sdOptOutParam=true&qid=173471 4722&sr=8-6	Old Prusa i3 power supply (AC INPUT: 110-220 V, DC OUTPUT: 12 V 15 A). Link to commercially available alternative
Pulley 5 mm	VooGenzek	https://www.amazon.it/gp/product/ B0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Bore 5 mm, Width belt space 6 mm
Pulley 8 mm	Yxtaii	https://www.amazon.it/gp/product/ B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&th=1	Bore 8 mm, Width belt space 6 mm
Ribbon cables	QUARKZMAN	https://www.amazon.it/sspa/click?ie =UTF8&spc=MTo0NDgyNTkwNzU wNjM5NzM5OjE3MzQ3MTQ1OTE6 c3BfbXRmOjMwMDEyMjk4NTMzN TYzMjo6MDo6&url=%2FQUARKZM AN-connettore-Lunghezza-Comput er-confezione%2Fdp%2FB0CQRM DQNG%2Fref%3Dsr_1_15_sspa% 3F__mk_it_IT%3D%25C3%2585M %25C3%2585%25C5%25BD%25 C3%2595%25C3%2591%26crid%3 D3BZ8Q05YA50TX%26dib%3Dey J2IjoiMSJ9.zoYnL2ViiarlDS_7165D ldxu-TTbVbWUVAP3pCybFB-bjGl wSgrpnkMhhsJj3NRo8Mvht8ev5H vGQ-UUpPom12OcOcwyRVXLAR UvMyTm8mpAdZSaOritwHRgwu2 JuW9UoS4jlCbA-gzP2FEAAH47K fFOWN6FEhc5r0YGBcSIsA6_QV6 _LA1k_ifj3c2BFm2Fj8YjW-auz7Yiy ULfZusvGX28S1K5kJdTa_YOwJY YC0Y__s-CCchHKiZgDhFjtFogUz0 Tonob4HQZiO_hkrnm3ixpNj9rgE- hvVq1FK1uD9M.kkP89x1SJ0SLxZ sv3YomYEfmkhpvP4WQf2TtC76K YAE%26dib_tag%3Dse%26keywords %3DCavo%2Bflessibile%2Ba%2Bna stro%2Bpiatto%2Bper%2Bstampant e%2B3D%2Ba%2B10%2Bpin%26n sdOptOutParam%3Dtrue%26qid% 3D1734714591%26s%3Dindustrial %26sprefix%3Dcavo%2Bflessibile %2Ba%2Bnastro%2Bpiatto%2Bper %2Bstampante%2B3d%2Ba%2B10 %2Bpin%252Cindustrial%252C170 %26sr%3D1-15-spons%26sp_csd% 3Dd2lkZ2V0TmFtZT1zcF9tdGY%26psc%3D1	ribbon cable 2651 28AWG 10 pins
Rigid shaft coupling	Gwolf	https://www.amazon.it/gp/product/ B088R8CW5Z/ref=ppx_yo_dt_b_ search_asin_title?ie=UTF8&psc=1	Coupling from 5 to 8 mm
Rods 4 mm	RS-components	682-810	Diameter 4 mm
Rods 5 mm	Sourcingmap	a14010200ux0214	Diameter 5 mm
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