通过 Cuff 技术将组织工程血管移植物植入小鼠颈动脉

摘要

在这里，提出了一种使用袖带技术将组织工程血管移植物植入小鼠颈动脉的方案，为研究血管组织再生机制提供了合适的动物模型。

摘要

小直径血管移植物的开发是一项全球性的努力，许多研究小组为该领域做出了贡献。动物实验在评估血管移植物的有效性和安全性方面起着关键作用，尤其是在没有临床应用的情况下。与其他动物模型相比，小鼠植入模型具有多项优势，包括明确的遗传背景、成熟的疾病模型构建方法和简单的外科手术。基于这些优势，本研究设计了一种简单的袖带技术，用于在小鼠颈动脉中植入组织工程血管移植物。该技术首先 通过静电纺 丝制造聚己内酯 （PCL） 小直径血管移植物，然后通过灌注吸附将巨噬细胞接种到移植物上。随后，使用袖带技术将细胞化的组织工程血管移植物移植到小鼠颈动脉中，以评估通畅性和再生能力。 体内 植入 30 天后，发现血管通畅性令人满意，有证据表明新组织再生和在移植物腔内形成内皮层。所有数据均使用统计和绘图软件进行分析。本研究成功建立了小鼠颈动脉植入模型，可用于探索血管再生的细胞来源和活性物质的作用机制。此外，它为新型小直径血管移植物的开发提供了理论支持。

引言

心血管疾病的患病率和死亡率在全球范围内不断上升，这是一个重大的公共卫生问题¹。血管旁路移植术是治疗严重冠心病和外周血管疾病的有效干预措施²。在临床环境中使用直径超过 6 mm 的人工血管移植物已得到充分证明。相反，直径小于 6 毫米的人容易发生血栓形成和内膜增生，这可能导致相当大的再狭窄风险³。尽管近年来小直径血管移植物的研发取得了重大进展，并且有几种产品接近临床应用，但仍然存在多种挑战 ^4,5。这些因素包括相对较低的长期通畅率、有限的血管再生以及对再生机制的了解不足。

新型小直径血管移植物的临床前评估依赖于各种动物模型中的体内植入。最常用的模型包括羊颈动脉、狗股动脉、兔颈动脉和大鼠腹动脉植入模型 6,7,8,9。血管移植物的通畅性可以在中型到大型动物（如羊、猪和狗）中进行评估。然而，由于所需的专业知识和设备，这些研究涉及大量成本。此外，它们的技术复杂性对实施构成了挑战。相比之下，兔子和大鼠等小动物模型缺乏具有明确遗传背景的成熟转基因物种，这在研究血管再生机制方面构成了重大障碍。

与上述动物模型相比，小鼠模型提供了一种相对简单的外科手术、一种生成基因工程小鼠的成熟方法以及明确定义的遗传背景。然而，小鼠血管的小直径使得血管移植中的端到端吻合在技术上很复杂，需要大量的专业知识并且成功率相对较低。为了降低手术的复杂性并提高血管移植物植入的成功率，本研究在小鼠颈动脉植入模型中采用了袖带技术。

体内植入后，血管移植物可以募集有助于血管组织再生的内源性细胞。这些细胞的存在促进了移植物平滑肌层的内皮化和再生。¹⁰. 然而，参与血管组织再生的细胞的来源和类型仍不清楚，多种相互竞争的理论正在研究中¹¹。其中，研究主要集中在炎症和干细胞的作用上。Breuer 等人将人骨髓来源的单核细胞 （hBMC） 接种到血管移植物上，发现接种的细胞通过释放单核细胞趋化蛋白-1 （MCP-1） 将宿主细胞募集到移植物壁中，从而促进血管组织再生¹²。在这项研究中，提出了一种高效的灌注吸附细胞接种方法，并成功用于将巨噬细胞接种到聚己内酯 （PCL） 小直径血管移植物上。植入后，这些细胞表现出持续的活力。

本文详细介绍了使用袖带技术制备组织工程血管移植物和小鼠颈动脉植入手术的方法。该过程从 通过 静电纺丝制造具有定义参数的 PCL 小直径血管移植物开始。随后，被认为适合植入的移植物进行机械测试。然后使用灌注吸附方法将巨噬细胞接种到血管移植物上。最后，使用袖带技术将巨噬细胞种子的血管移植物植入小鼠颈动脉，并在 体内 植入一个月后分析通畅性和再生特性。

该技术有可能提高小鼠模型中血管移植的疗效和成功率。此外，该模型可用于研究细胞来源、关键基因和活性因子在血管再生中的机制，为新型小直径血管移植物的功能修饰和开发提供理论和方法支持。

研究方案

所有动物程序均经中国医学科学院放射医学研究所动物实验伦理委员会批准，并符合《实验动物护理和使用指南》。本研究使用雄性 C57BL/6 小鼠，6-8 周龄，体重 25-30 g。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 小直径血管移植物的制造

注：使用静电纺丝技术制造小直径 PCL 血管移植物¹³.

1. 在室温 （RT） 下用六氟异丙醇 （HFIP） 制备 10%、15% 和 20% （w/v） 的 PCL 溶液 12 小时。
2. 将 PCL 溶液装入 10 mL 注射器中，并用 21 G 不锈钢针头定位注射器。
3. 将钨钢心轴（直径 0.7 毫米，长度 20 厘米）放在收集仪器上。
4. 使用静电纺丝技术制造九组 PCL 血管移植物。将高压电源连接到针上。将一根内径为 0.7 mm 的钨钢棒以固定距离放置在针前作为接收装置。
   注意： 表 1 中提供了血管移植物组的描述， 表 2 中详细介绍了血管移植物的参数。
5. 对制造的血管移植物进行清宫过程。将血管移植物放入真空干燥箱中 72 小时以去除残留溶剂。
6. 通过将移植物浸入医用酒精中 30 分钟并将其暴露在紫外线下过夜来对移植物进行消毒。
7. 使用扫描电子显微镜 （SEM） 观察血管移植物的微观形态。用导电粘合剂将血管移植物连接到 SEM 样品台上，并将它们放入金溅射装置中进行镀膜。
   1. 使用 SEM 在 15 kV 的加速电压下观察血管移植物的结构和纤维形态。使用 ImageJ 软件从 SEM 图像 （n = 5） 中测量纤维直径和孔径。
8. 使用拉伸试验机评估血管移植物的机械性能（拉伸和弹性性能）。用间隔 1 cm 的固定夹夹住血管移植物的上端和下端。
   1. 以 10 mm/min 的速度拉伸血管移植物直至破裂。从拉伸试验机收集应力-应变曲线。
   2. 计算机械参数，包括最大载荷 （2-15 N）、断裂应力 （5-30 MPa）、断裂应变 （200%-1500%） 和弹性模量 （1-20 MPa）¹⁴。
9. 使用统计和绘图软件进行统计分析。将数据表示为平均值±标准差。在单因素方差分析中使用 Tukey 事后检验分析和比较多个组之间的单变量差异。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

2. 将巨噬细胞接种到血管移植物上

注意：确保所有溶液和材料都是无菌的。在细胞培养室内进行所有作。

1. 在贴壁条件下在培养瓶中培养 RAW264.7（小鼠单核细胞巨噬细胞）（图 1A）。使用补充有 1% 青霉素-链霉素和 10% 胎牛血清的完全 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 制备细胞培养基。将培养瓶置于含有 5% 二氧化碳的 37 °C 培养箱中。
2. 使用细胞刮刀收集巨噬细胞。使用 1 mL 移液器丢弃培养基，并用 PBS 洗涤细胞。
   1. 向培养瓶中加入 2 mL 新鲜培养基，然后用细胞刮刀轻轻刮擦表面。将收集的细胞转移到试管中，并在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟。将 5 × 10⁶ 个细胞重悬于 100 μL 完全培养基中。
3. 将 PCL 血管移植物（1 cm 长）放入装有 DMEM 的 15 mL 管中，并以 4,000 x g 离心 5 分钟。重复此过程数次，直到移植物沉到管底部，确保 DMEM 完全浸润材料。
4. 准备一个 10 厘米的培养皿，内衬一层滤纸。将湿润的 PCL 血管移植物放在滤纸上并滚动以去除多余的培养基。
5. 使用 10 μL 移液器取 10 μL 细胞悬液，并将其注射到血管移植物的一端。在滤纸上旋转血管移植物，以促进悬浮液的均匀分布。每端注射 5 次，总共注射 10 次（图 1B、C）。
6. 将载有巨噬细胞的血管移植物置于含有 1 mL 完全培养基的 24 孔板中，并在植入前在细胞培养箱中孵育 2 小时。
7. 确定移植物壁内细胞的分布。将载有巨噬细胞的血管移植物嵌入光学相干断层扫描 （OCT） 化合物中进行冷冻切片。用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 对细胞核进行染色，并在荧光显微镜下观察。

3. 小鼠颈动脉植入模型

注意：为动物手术保持无菌手术区域。手术前对所有手术器械和一次性用品进行消毒。

1. 选择三只健康的雄性 C57BL/6 小鼠，每只重 25-30 克。手术前一天让小鼠禁食。在每只动物中植入一个血管移植物，总共三个移植物。
2. 用尼龙管构建袖囊（图 2A），并在 图 2B 中展示血管袖带技术的示意图。
3. 通过腹膜内注射浓度为 50 mg/kg 的戊巴比妥钠麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）。通过确保肌肉放松和均匀呼吸来确认有效的麻醉。将凡士林眼药膏涂抹在眼睛上，以防止麻醉时干燥。
4. 将鼠标仰卧在手术台上，去除颈部毛发。用碘伏对手术区域进行消毒。用无菌纱布覆盖非手术区域，以保持无菌环境（图 3A）。
5. 使用眼科剪刀从下颌骨到胸骨做一个中线切口（1.5-2 厘米长）。抬高左侧唾液腺并切除左侧乳突肌，以增加手术视野。使用微型镊子暴露左颈总动脉（图 3B）。
6. 使用微镊子分离左颈动脉（图 3C）。
7. 使用 9-0 缝合线在中部的两个位置结扎颈动脉。使用微型剪刀横切两根结扎线之间的动脉。将袖带穿过两端的动脉，并使用动脉夹将动脉和袖带固定在一起（图 3D）。
8. 将动脉向外转动以覆盖袖带体，并使用带有显微镊子的 9-0 缝合线将其固定到袖带上（图 3E）。
9. 通过将移植物末端滑过动脉袖带并用 9-0 缝合线固定它们，在颈动脉的两端之间植入血管移植物（图 3F）。
   注意：袖带、颈动脉和血管移植物的尺寸数据见表 3。尽管移植物和袖带的直径与小鼠颈动脉的直径紧密匹配，但吻合口管腔直径和移植物直径之间存在不匹配。吻合口管腔直径的计算方法是从袖带内径 （0.1 mm） 减去颈动脉壁厚度的两倍 （0.5 mm），得到 0.3 mm 的管腔直径。血管移植物的内径为 0.7 毫米，导致大约 2.3 倍的错配 （0.7 毫米 / 0.3 毫米 = 2.3）。
10. 取下两端的动脉夹，用生理盐水冲洗植入部位。通过观察远端动脉搏动来评估血管移植物的通畅性（图 3G）。
11. 重新定位左侧唾液腺并使用 6-0 缝合线关闭手术部位（图 3H）。

4. 术后护理和分析

1. 将小鼠转移到 37 °C 培养箱中，并持续监测其生命体征，直到它恢复意识。
2. 注射 5 mg/kg 甲醇以缓解术后疼痛。
3. 在恢复期间监控老鼠，在完全恢复之前不要将其送回集体住房。
4. 植入小鼠后一个月麻醉并收获血管移植物样本用于组织学分析⁹。
5. 按照道德准则 通过 CO₂ 窒息进行安乐死，然后进行颈椎脱位。

结果

通过静电纺丝成功制备了具有不同参数的小直径血管移植物。SEM 图像显示纤维分布均匀，并在移植物壁内表现出不规则排列，存在孔结构（图 4）。随着 PCL 浓度的增加，纤维直径和孔径均增加。表 2 中列出了每个血管移植物组的具体值。机械测试结果表明，所有血管移植物均符合所需的机械标准。最大载荷和断裂应变随着 PCL 浓...

讨论

使用袖带技术在小鼠颈动脉中植入组织工程血管移植物代表了心血管研究的重大进步¹⁵。该技术的关键步骤包括细胞接种和移植物植入。本研究采用灌注吸附方法提高巨噬细胞接种密度，以解决与细胞接种不均匀和细胞活力低相关的问题。这种方法允许巨噬细胞浸润血管移植物壁并均匀分布。

关于血管植入，与端对端吻合

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin-streptomycin	Solarbio	P1400
10% fetal bovine serum	Gibco	A5256701
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	SouthernBiotech	0100-20
Alcohol	Tianjin Chemical Reaggent Company	1083
Anti-Mouse CD31 primary antibody	BD Bioscience	553370
Arterial clips	RWD Life Science	R31005-06
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11966025
Electrostatic spinning machine	Yunfan Technology	DP30
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 555)	Invitrogen	A-21434
Hematoxylin and eosin (H&E)	Solarbio	G1120
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	McClean	H811026
Iodophor	LIRCON	V273068
Microscissors	World Precision Instruments	14124
Microtweezers	World Precision Instruments	500338
Normal goat serum	Boster	AR0009
Normal saline	Cisen Pharmaceutical company	H20113369
Nylon tube for cuff	Portex
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakara	4583
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Solarbio	P1003
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn = 80,000)	Sigma	704067
RAW264.7 macrophages	Biyuntian Biotechnology
Scanning electron microscope (SEM)	Zeiss	PHENOM-XL-G2
Surgical sutures 6-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	220919
Surgical sutures 9-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	221006
Syringe	Changqiang Medical Devices	0197
Tensile testing machine	Instron	WDW-5D