Имплантация тканеинженерного сосудистого трансплантата в сонную артерию мыши с помощью манжетной техники

Резюме

В данной работе представлен протокол имплантации тканеинженерного сосудистого трансплантата в сонную артерию мыши с использованием метода манжеты, что обеспечивает подходящую животную модель для исследования механизмов регенерации сосудистой ткани.

Аннотация

Разработка сосудистых трансплантатов малого диаметра является глобальным начинанием, в которое вносят свой вклад многочисленные исследовательские группы. Эксперименты на животных играют ключевую роль в оценке эффективности и безопасности сосудистых трансплантатов, особенно в отсутствие их клинического применения. По сравнению с альтернативными животными моделями, модель имплантации мышей имеет ряд преимуществ, в том числе четко определенный генетический фон, зрелый метод построения модели заболевания и простую хирургическую процедуру. Основываясь на этих преимуществах, в настоящем исследовании была разработана простая техника манжеты для имплантации тканеинженерных сосудистых трансплантатов в сонную артерию мыши. Этот метод начался с изготовления сосудистых трансплантатов малого диаметра из поликапролактона (PCL) с помощью электростатического спиннинга с последующим посевом макрофагов на трансплантаты с помощью перфузионной адсорбции. Впоследствии клеточные тканеинженерные сосудистые трансплантаты были трансплантированы в сонную артерию мыши с использованием метода манжеты для оценки проходимости и регенеративной способности. После 30 дней имплантации in vivo проходимость сосудов была признана удовлетворительной, с признаками регенерации неотканей и образования эндотелиального слоя в просвете трансплантатов. Все данные были проанализированы с помощью статистического и графического программного обеспечения. В этом исследовании была успешно создана модель имплантации сонной артерии у мыши, которая может быть использована для изучения клеточных источников регенерации сосудов и механизмов действия активных веществ. Кроме того, он обеспечивает теоретическую поддержку для разработки новых сосудистых трансплантатов малого диаметра.

Введение

Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний и смертность от них растут во всем мире, что представляет собой серьезную проблему общественного здравоохранения¹. Сосудистое шунтирование является эффективным вмешательством при тяжелой ишемической болезни сердца и заболеваниях периферических сосудов². Использование искусственных сосудистых трансплантатов диаметром более 6 мм было хорошо задокументировано в клинических условиях. И наоборот, те, у кого диаметр менее 6 мм, склонны к тромбозу и гиперплазии интимы, что может привести к значительному риску рестеноза³. Несмотря на значительный прогресс в исследованиях и разработках сосудистых трансплантатов малого диаметра в последние годы, когда несколько продуктов приближаются к клиническому применению^{, остаются многочисленные проблемы.} К ним относятся относительно низкая долгосрочная проходимость, ограниченная регенерация сосудов и недостаточное понимание механизма регенерации.

Доклиническая оценка новых сосудистых трансплантатов малого диаметра основана на имплантации in vivo на различных животных моделях. Наиболее часто используемые модели включают модели имплантации сонной артерии овец, бедренной артерии собаки, сонной артерии кролика и модели имплантации брюшной артерии^крысы 6,7,8,9. Проходимость сосудистых трансплантатов может быть оценена у средних и крупных животных, таких как овцы, свиньи и собаки. Однако эти исследования сопряжены со значительными затратами из-за необходимых знаний и оборудования. Кроме того, их техническая сложность создает проблемы для реализации. Напротив, в моделях мелких животных, таких как кролики и крысы, отсутствуют хорошо изученные трансгенные виды с четко определенным генетическим фоном, что представляет собой значительное препятствие в изучении механизмов регенерации сосудов.

По сравнению с вышеупомянутыми животными моделями, мышиная модель предлагает относительно простую хирургическую процедуру, хорошо зарекомендовавшую себя методологию создания генетически модифицированных мышей и четко определенный генетический фон. Тем не менее, малый диаметр кровеносных сосудов мыши делает сквозной анастомоз при сосудистой пластике технически сложным, требующим значительного опыта и дающим относительно низкий процент успеха. Чтобы снизить сложность процедуры и повысить вероятность успешной имплантации сосудистого трансплантата, в настоящем исследовании использовалась техника манжеты на модели имплантации сонной артерии мыши.

После имплантации in vivo сосудистые трансплантаты могут привлекать эндогенные клетки, которые способствуют регенерации сосудистой ткани. Наличие этих клеток способствует эндотелизации и регенерации гладкомышечного слоя трансплантатов. ¹⁰. Тем не менее, источник и тип клеток, участвующих в регенерации сосудистой ткани, остаются неясными, и в настоящее время исследуется множество конкурирующих теорий11. Среди них исследования были сосредоточены на роли воспалительных и стволовых клеток. Breuer et al. посеяли моноциты, полученные из костного мозга человека (hBMCs), в сосудистые трансплантаты и обнаружили, что засеянные клетки рекрутируют клетки-хозяева в стенку трансплантата за счет высвобождения моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1), тем самым способствуя регенерации сосудистой ткани¹². В этом исследовании был предложен эффективный метод перфузионно-адсорбционного посева клеток, который был успешно использован для посева макрофагов на сосудистые трансплантаты малого диаметра из поликапролактона (PCL). После имплантации эти клетки продемонстрировали устойчивую жизнеспособность.

В данной статье подробно описана методика получения тканеинженерных сосудистых трансплантатов и процедуры имплантации сонной артерии у мышей с использованием манжетной техники. Процесс начинается с изготовления сосудистых трансплантатов малого диаметра PCL с заданными параметрами с помощью электростатического спиннинга. Впоследствии графты, признанные пригодными для имплантации, проходят механические испытания. Затем макрофаги засеиваются в сосудистые трансплантаты методом перфузионной адсорбции. Наконец, сосудистые трансплантаты, засеянные макрофагами, имплантируются в сонную артерию мыши с использованием метода манжеты, а проходимость и регенеративные свойства анализируются через один месяц имплантации in vivo .

Этот метод имеет потенциал для повышения эффективности и успешности сосудистой пластики на мышиных моделях. Кроме того, модель может быть использована для исследования механизмов, лежащих в основе клеточных источников, стержневых генов и активных факторов в регенерации сосудов, обеспечивая теоретическую и методологическую поддержку для функциональной модификации и разработки новых сосудистых трансплантатов малого диаметра.

протокол

Все процедуры на животных были одобрены Этическим комитетом по экспериментам на животных Института радиационной медицины Китайской академии медицинских наук и соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных. В данном исследовании использовались самцы мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель с массой тела 25-30 г. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изготовление сосудистых трансплантатов малого диаметра

ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовление сосудистых трансплантатов PCL малого диаметра с использованием метода электроспиннинга¹³.

1. Готовьте растворы PCL в концентрации 10%, 15% и 20% (по массе) в гексафторизопропаноле (HFIP) при комнатной температуре (RT) в течение 12 часов.
2. Загрузите растворы PCL в шприц объемом 10 мл и установите шприц с помощью иглы из нержавеющей стали 21 G.
3. Поместите оправку из вольфрамовой стали (0,7 мм в диаметре, 20 см в длину) на инструмент для сбора.
4. Изготовьте девять групп сосудистых трансплантатов PCL с помощью техники электроспиннинга. Подключите к игле высоковольтный источник питания. Расположите стержень из вольфрамовой стали с внутренним диаметром 0,7 мм на фиксированном расстоянии перед иглой в качестве приемного устройства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описание групп сосудистых трансплантатов представлено в таблице 1, а параметры сосудистых трансплантатов подробно описаны в таблице 2.
5. Подвергнуть изготовленные сосудистые трансплантаты процессу эвакуации. Поместите сосудистые трансплантаты в вакуумную сушилку на 72 ч для удаления остатков растворителей.
6. Стерилизуйте графты, погрузив их в медицинский спирт на 30 минут и подвергнув воздействию ультрафиолетового излучения на ночь.
7. Наблюдайте за микроскопической морфологией сосудистых трансплантатов с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). Прикрепите сосудистые трансплантаты к предметному столу СЭМ с помощью проводящего клея и поместите их в устройство для напыления золота для нанесения покрытия.
   1. Наблюдайте за структурой и морфологией волокон сосудистых трансплантатов с помощью СЭМ при ускоряющем напряжении 15 кВ. Измерьте диаметр волокна и размер пор по изображениям SEM (n = 5) с помощью программного обеспечения ImageJ.
8. Оцените механические свойства (растяжимость и эластичность) сосудистых трансплантатов с помощью машины для испытаний на растяжение. Зажмите верхний и нижний концы сосудистого трансплантата неподвижными зажимами, расположенными на расстоянии 1 см друг от друга.
   1. Растягивайте сосудистый трансплантат со скоростью 10 мм/мин до разрыва. Соберите кривую зависимости напряжения от деформации с машины для испытаний на растяжение.
   2. Рассчитайте механические параметры, включая максимальную нагрузку (2-15 Н), напряжение при разрыве (5-30 МПа), деформацию при разрыве (200%-1500%) и модуль упругости (1-20 МПа)¹⁴.
9. Выполняйте статистический анализ с помощью статистического и графического программного обеспечения. Выражайте данные как среднее значение ± стандартное отклонение. Анализируйте и сравнивайте одномерные различия между несколькими группами с помощью апостериорного теста Тьюки в однофакторной ANOVA. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

2. Посев макрофагов на сосудистые трансплантаты

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все растворы и материалы стерильны. Проводите все операции в помещении для культивирования клеток.

1. Культура RAW264.7 (моноцитарный макрофаг мыши) в колбах в адгезивных условиях (рис. 1А). Приготовьте питательную среду для клеточных культур с использованием полной модифицированной среды Дульбекко (DMEM) с добавлением 1% пенициллин-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки. Поместите колбы в инкубатор с температурой 37 °C, содержащий 5% углекислого газа.
2. Соберите макрофаги с помощью скребка для клеток. Выбросьте среду с помощью пипетки объемом 1 мл и промойте клетки PBS.
   1. Добавьте в колбу с культурой 2 мл свежей среды и аккуратно соскребите поверхность скребком для клеток. Переложите собранные клетки в пробирку и центрифугируйте при давлении 1 000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте 5 × 10⁶ клеток в 100 мкл готовой среды.
3. Поместите сосудистый трансплантат PCL (1 см в длину) в пробирку объемом 15 мл, заполненную DMEM, и центрифугируйте при давлении 4000 x g в течение 5 минут. Повторите этот процесс несколько раз до тех пор, пока трансплантат не опустится на дно трубки, обеспечивая полную инфильтрацию материала DMEM.
4. Подготовьте чашку Петри длиной 10 см, выстланную слоем фильтровальной бумаги. Поместите увлажненный сосудистый трансплантат PCL на фильтровальную бумагу и скатайте его, чтобы удалить лишнюю среду.
5. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии с помощью пипетки объемом 10 мкл и введите ее в один конец сосудистого трансплантата. Поверните сосудистый трансплантат над фильтровальной бумагой, чтобы обеспечить равномерное распределение суспензии. Введите каждый конец пять раз, всего десять инъекций (Рисунок 1B, C).
6. Поместите сосудистый трансплантат, нагруженный макрофагами, в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл полной среды, и инкубируйте в течение 2 ч в инкубаторе для клеточных культур перед имплантацией.
7. Определить распределение клеток в стенке трансплантата. Встраивание сосудистого трансплантата, нагруженного макрофагами, в соединение оптической когерентной томографии (ОКТ) для криосекции. Окрашивают ядра клеток 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и наблюдают под флуоресцентным микроскопом.

3. Модель имплантации сонной артерии мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильную операционную зону для процедур на животных. Стерилизуйте все хирургические инструменты и одноразовые материалы перед операцией.

1. Выберите трех здоровых самцов мышей C57BL/6, каждый весом 25-30 г. Голодайте мышей за день до операции. Имплантируйте по одному сосудистому трансплантату каждому животному, всего три трансплантата.
2. Сконструируйте манжеты из нейлоновой трубки (Рисунок 2A) и представьте принципиальную схему техники сосудистой манжеты на Рисунке 2B.
3. Обезболивание мышей путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия в концентрации 50 мг/кг (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Подтвердите эффективную анестезию, обеспечив расслабление мышц и ровное дыхание. Нанесите на глаза вазелиновую офтальмологическую мазь для предотвращения сухости во время анестезии.
4. Расположите мышь в лежачем положении на операционном столе и удалите волосы на шее. Простерилизуйте операционную область йодофором. Накройте неоперационную область стерильной марлей для поддержания стерильной среды (рисунок 3A).
5. С помощью офтальмологических ножниц сделайте разрез по средней линии (1,5-2 см в длину) от нижней челюсти до грудины. Поднимите левую слюнную железу и иссеките левую клейдомастоидную мышцу, чтобы увеличить операционное поле зрения. Обнажите левую общую сонную артерию с помощью микропинцета (рисунок 3B).
6. Изолируйте левую сонную артерию с помощью микрощипцов (рисунок 3C).
7. Перевязать сонную артерию в двух местах в средней части с помощью шва 9-0. Пересеките артерию между двумя лигатурами с помощью микроножниц. Проденьте манжету через артерии на каждом конце и закрепите артерию и манжету вместе с помощью артериальных зажимов (рисунок 3D).
8. Поверните артерию наружу, чтобы покрыть тело манжеты, и закрепите ее на манжете с помощью шва 9-0 с микрощипцами (рисунок 3E).
9. Имплантируйте сосудистый трансплантат между двумя концами сонной артерии, сдвинув концы трансплантата через манжету артерии и закрепив их швами 9-0 (рис. 3F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размерные данные манжеты, сонной артерии и сосудистого трансплантата представлены в таблице 3. Несмотря на то, что диаметры трансплантата и манжеты близко совпадают с диаметрами сонных артерий мыши, существует несоответствие между диаметром просвета анастомоза и диаметром трансплантата. Диаметр просвета анастомоза рассчитывается путем вычитания удвоенной толщины стенки сонной артерии (0,1 мм) из внутреннего диаметра манжеты (0,5 мм), в результате чего диаметр просвета составляет 0,3 мм. Сосудистый трансплантат имеет внутренний диаметр 0,7 мм, что приводит к несовпадению примерно в 2,3 раза (0,7 мм / 0,3 мм = 2,3).
10. Снимите артериальные зажимы с обоих концов и орошите место имплантации физиологическим раствором. Оцените проходимость сосудистого трансплантата, наблюдая за пульсацией дистальных артерий (рис. 3G).
11. Переместите левую слюнную железу и закройте место операции с помощью швов 6-0 (Рисунок 3H).

4. Послепроцедурный уход и анализ

1. Перенесите мышь в инкубатор с температурой 37 °C и непрерывно контролируйте ее жизненные показатели, пока она не придет в сознание.
2. Введите 5 мг/кг карбинола для облегчения послеоперационной боли.
3. Следите за мышью в период восстановления и не возвращайте ее в групповое жилье до полного восстановления.
4. Обезболить мышей через месяц после имплантации и собрать образцы сосудистого трансплантата для гистологического анализа⁹.
5. Провести эвтаназию с помощью удушения CO₂ с последующим вывихом шейки матки в соответствии с этическими рекомендациями.

Результаты

Сосудистые трансплантаты малого диаметра с различными параметрами были успешно получены с помощью электроспиннинга. Снимки СЭМ показали, что волокна были равномерно распределены и демонстрировали неравномерное расположение в стенке трансплантата с наличием ?...

Обсуждение

Использование метода манжеты для имплантации тканеинженерных сосудистых трансплантатов в сонную артерию мыши представляет собой значительный прогресс^{в исследованиях} сердечно-сосудистой системы. Важнейшими этапами этой методики являются посев клето?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin-streptomycin	Solarbio	P1400
10% fetal bovine serum	Gibco	A5256701
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	SouthernBiotech	0100-20
Alcohol	Tianjin Chemical Reaggent Company	1083
Anti-Mouse CD31 primary antibody	BD Bioscience	553370
Arterial clips	RWD Life Science	R31005-06
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11966025
Electrostatic spinning machine	Yunfan Technology	DP30
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 555)	Invitrogen	A-21434
Hematoxylin and eosin (H&E)	Solarbio	G1120
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	McClean	H811026
Iodophor	LIRCON	V273068
Microscissors	World Precision Instruments	14124
Microtweezers	World Precision Instruments	500338
Normal goat serum	Boster	AR0009
Normal saline	Cisen Pharmaceutical company	H20113369
Nylon tube for cuff	Portex
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakara	4583
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Solarbio	P1003
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn = 80,000)	Sigma	704067
RAW264.7 macrophages	Biyuntian Biotechnology
Scanning electron microscope (SEM)	Zeiss	PHENOM-XL-G2
Surgical sutures 6-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	220919
Surgical sutures 9-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	221006
Syringe	Changqiang Medical Devices	0197
Tensile testing machine	Instron	WDW-5D