Implantation d’une greffe vasculaire issue de l’ingénierie tissulaire dans l’artère carotide de souris via la technique du brassard

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour l’implantation d’un greffon vasculaire issu de l’ingénierie tissulaire dans l’artère carotide de souris à l’aide de la technique du ballonnet, fournissant un modèle animal approprié pour l’étude des mécanismes de régénération du tissu vasculaire.

Résumé

Le développement de greffes vasculaires de petit diamètre a été une entreprise mondiale, avec de nombreux groupes de recherche contribuant à ce domaine. L’expérimentation animale joue un rôle central dans l’évaluation de l’efficacité et de l’innocuité des greffes vasculaires, en particulier en l’absence d’applications cliniques. Par rapport aux modèles animaux alternatifs, le modèle d’implantation de souris offre plusieurs avantages, notamment un patrimoine génétique bien défini, une méthode mature de construction de modèles de maladies et une procédure chirurgicale simple. Sur la base de ces avantages, la présente étude a mis au point une technique simple de brassard pour l’implantation de greffons vasculaires issus de l’ingénierie tissulaire dans l’artère carotide de la souris. Cette technique a commencé par la fabrication de greffons vasculaires de petit diamètre en polycaprolactone (PCL) par filage électrostatique, suivie de l’ensemencement de macrophages sur les greffons par adsorption par perfusion. Par la suite, les greffons vasculaires cellularisés issus de l’ingénierie tissulaire ont été transplantés dans l’artère carotide de la souris à l’aide de la technique du ballonnet pour évaluer la perméabilité et la capacité de régénération. Après 30 jours d’implantation in vivo , la perméabilité vasculaire s’est avérée satisfaisante, avec des signes de régénération néo-tissulaire et la formation d’une couche endothéliale dans la lumière des greffons. Toutes les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel de statistiques et de graphiques. Cette étude a permis d’établir un modèle d’implantation de l’artère carotide chez la souris qui peut être utilisé pour explorer les sources cellulaires de la régénération vasculaire et les mécanismes d’action des substances actives. De plus, il fournit un soutien théorique pour le développement de nouvelles greffes vasculaires de petit diamètre.

Introduction

La prévalence et la mortalité des maladies cardiovasculaires augmentent à l’échelle mondiale, ce qui représente un problème de santé publique important¹. Le pontage vasculaire est une intervention efficace pour les maladies coronariennes graves et les maladies vasculaires périphériques². L’utilisation de greffes vasculaires artificielles d’un diamètre supérieur à 6 mm a été bien documentée en milieu clinique. À l’inverse, ceux dont le diamètre est inférieur à 6 mm sont sujets à la thrombose et à l’hyperplasie intimale, ce qui peut entraîner un risque considérable de resténose³. Malgré des avancées significatives dans la recherche et le développement de greffes vasculaires de petit diamètre ces dernières années, avec plusieurs produits approchant l’application clinique, de multiples défis subsistent ^4,5. Il s’agit notamment d’un taux de perméabilité à long terme relativement faible, d’une régénération vasculaire limitée et d’une compréhension insuffisante du mécanisme de régénération.

L’évaluation préclinique de nouveaux greffons vasculaires de petit diamètre repose sur l’implantation in vivo dans divers modèles animaux. Les modèles les plus couramment utilisés comprennent l’artère carotide de mouton, l’artère fémorale de chien, l’artère carotide de lapin et les modèles d’implantation d’artère abdominale^de rat 6,7,8,9. La perméabilité des greffes vasculaires peut être évaluée chez des animaux de taille moyenne à grande, tels que les moutons, les porcs et les chiens. Cependant, ces études impliquent des coûts importants en raison de l’expertise et de l’équipement requis. De plus, leur complexité technique pose un défi à la mise en œuvre. En revanche, les modèles de petits animaux tels que les lapins et les rats manquent d’espèces transgéniques bien établies avec des antécédents génétiques clairement définis, ce qui représente un obstacle important dans l’étude des mécanismes de régénération vasculaire.

Par rapport aux modèles animaux susmentionnés, le modèle murin offre une procédure chirurgicale relativement simple, une méthodologie bien établie pour générer des souris génétiquement modifiées et un patrimoine génétique clairement défini. Cependant, le petit diamètre des vaisseaux sanguins de souris rend l’anastomose de bout en bout dans la greffe vasculaire techniquement complexe, nécessitant une expertise significative et produisant un taux de réussite relativement faible. Afin de réduire la complexité de la procédure et d’améliorer le taux de réussite de l’implantation d’une greffe vasculaire, la présente étude a utilisé la technique du brassard dans un modèle d’implantation de l’artère carotide chez la souris.

Suite à une implantation in vivo , les greffes vasculaires peuvent recruter des cellules endogènes qui contribuent à la régénération du tissu vasculaire. La présence de ces cellules facilite l’endothélialisation et la régénération de la couche musculaire lisse des greffons. ¹⁰. Cependant, la source et le type de cellules impliquées dans la régénération du tissu vasculaire restent incertains, et de multiples théories concurrentes sont à l’étude¹¹. Parmi celles-ci, les recherches ont porté sur les rôles des cellules inflammatoires et des cellules souches. Breuer et al. ont ensemencé des monocytes dérivés de la moelle osseuse humaine (hBMC) sur des greffes vasculaires et ont constaté que les cellules ensemencées recrutaient des cellules hôtes dans la paroi du greffon par la libération de la protéine chimioattractante des monocytes 1 (MCP-1), favorisant ainsi la régénération du tissu vasculaire¹². Dans cette étude, une méthode efficace d’ensemencement cellulaire par adsorption de perfusion a été proposée et utilisée avec succès pour ensemencer des macrophages sur des greffons vasculaires de petit diamètre en polycaprolactone (PCL). Après l’implantation, ces cellules ont montré une viabilité soutenue.

Cet article détaille la méthodologie de préparation des greffes vasculaires issues de l’ingénierie tissulaire et la procédure d’implantation de l’artère carotide chez la souris à l’aide de la technique du brassard. Le processus commence par la fabrication de greffons vasculaires PCL de petit diamètre avec des paramètres définis par filage électrostatique. Par la suite, les greffons jugés aptes à l’implantation subissent des tests mécaniques. Les macrophages sont ensuite ensemencés sur les greffons vasculaires à l’aide de la méthode d’adsorption par perfusion. Enfin, des greffons vasculaires ensemencés de macrophages sont implantés dans l’artère carotide de la souris à l’aide de la technique du brassard, et la perméabilité et les propriétés régénératives sont analysées après un mois d’implantation in vivo .

Cette technique a le potentiel d’améliorer l’efficacité et les taux de réussite de la greffe vasculaire dans des modèles murins. De plus, le modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes sous-jacents aux sources cellulaires, aux gènes pivots et aux facteurs actifs de la régénération vasculaire, fournissant un soutien théorique et méthodologique pour la modification fonctionnelle et le développement de nouveaux greffons vasculaires de petit diamètre.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique des expériences sur les animaux de l’Institut de médecine radiologique de l’Académie chinoise des sciences médicales et étaient conformes aux Directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris C57BL/6 mâles, âgées de 6 à 8 semaines, d’un poids corporel de 25 à 30 g, ont été utilisées dans cette étude. Les détails des réactifs et des équipements utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Fabrication de greffons vasculaires de petit diamètre

REMARQUE : Fabriquez des greffons vasculaires PCL de petit diamètre en utilisant la technique d’électrofilage¹³.

1. Préparer des solutions de PCL à 10 %, 15 % et 20 % (p/v) dans de l’hexafluoroisopropanol (HFIP) à température ambiante (RT) pendant 12 h.
2. Chargez les solutions PCL dans une seringue de 10 ml et positionnez la seringue à l’aide d’une aiguille en acier inoxydable de 21 G.
3. Placez un mandrin en acier au tungstène (0,7 mm de diamètre, 20 cm de longueur) sur l’instrument de prélèvement.
4. Fabriquer neuf groupes de greffons vasculaires PCL à l’aide de la technique d’électrofilage. Connectez une alimentation haute tension à l’aiguille. Positionnez une tige en acier au tungstène d’un diamètre intérieur de 0,7 mm à une distance fixe devant l’aiguille en tant que dispositif récepteur.
   REMARQUE : La description des groupes de greffons vasculaires est fournie dans le tableau 1, et les paramètres des greffons vasculaires sont détaillés dans le tableau 2.
5. Soumettre les greffons vasculaires fabriqués à un processus d’évacuation. Placez les greffons vasculaires dans une étuve de séchage sous vide pendant 72 h pour éliminer les solvants résiduels.
6. Stérilisez les greffons en les immergeant dans de l’alcool médical pendant 30 minutes et en les exposant à la lumière UV pendant la nuit.
7. Observez la morphologie microscopique des greffons vasculaires à l’aide d’un microscope électronique à balayage (MEB). Fixez les greffons vasculaires à l’étage de l’échantillon MEB à l’aide d’un adhésif conducteur et placez-les dans le dispositif de pulvérisation d’or pour le revêtement.
   1. Observez la structure et la morphologie des fibres des greffons vasculaires à l’aide du MEB à une tension d’accélération de 15 kV. Mesurez le diamètre de la fibre et la taille des pores à partir d’images MEB (n = 5) à l’aide du logiciel ImageJ.
8. Évaluer les propriétés mécaniques (propriétés de traction et d’élasticité) des greffons vasculaires à l’aide d’une machine d’essai de traction. Clampez les extrémités supérieure et inférieure du greffon vasculaire à l’aide de pinces fixes espacées de 1 cm.
   1. Étirer le greffon vasculaire à une vitesse de 10 mm/min jusqu’à rupture. Récupérez la courbe contrainte-déformation de la machine d’essai de traction.
   2. Calculez les paramètres mécaniques, y compris la charge maximale (2-15 N), la contrainte à la rupture (5-30 MPa), la déformation à la rupture (200 %-1500 %) et le module d’élasticité (1-20 MPa)¹⁴.
9. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de logiciels statistiques et graphiques. Exprimez les données sous forme de moyenne ± d’écart-type. Analysez et comparez les différences univariées entre plusieurs groupes à l’aide du test post hoc de Tukey dans l’ANOVA à un facteur. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

2. Ensemencement de macrophages sur des greffes vasculaires

REMARQUE : Assurez-vous que toutes les solutions et tous les matériaux sont stériles. Effectuer toutes les opérations dans la salle de culture cellulaire.

1. Culture RAW264.7 (macrophage monocytaire de souris) dans des flacons dans des conditions d’adhérence (Figure 1A). Préparez le milieu de culture cellulaire en utilisant le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complet complété par 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum fœtal bovin. Placez les flacons dans un incubateur à 37 °C contenant 5 % de dioxyde de carbone.
2. Prélever les macrophages à l’aide d’un grattoir cellulaire. Jeter le milieu à l’aide d’une pipette de 1 mL et laver les cellules avec du PBS.
   1. Ajouter 2 mL de milieu frais dans la fiole de culture et gratter doucement la surface à l’aide d’un grattoir cellulaire. Transférez les cellules collectées dans un tube et centrifugez à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Mettre en suspension 5 × 10⁶ cellules dans 100 μL de milieu complet.
3. Placez un greffon vasculaire PCL (1 cm de longueur) dans un tube de 15 mL rempli de DMEM et centrifugez-le à 4 000 x g pendant 5 min. Répétez ce processus plusieurs fois jusqu’à ce que le greffon coule au fond du tube, assurant une infiltration complète du matériau avec DMEM.
4. Préparez une boîte de Pétri de 10 cm recouverte d’une couche de papier filtre. Placez le greffon vasculaire PCL humidifié sur le papier filtre et roulez-le pour éliminer l’excès de milieu.
5. Prélever 10 μL de suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de 10 μL et l’injecter à une extrémité du greffon vasculaire. Faites pivoter le greffon vasculaire sur le papier filtre pour faciliter une distribution uniforme de la suspension. Injectez chaque extrémité cinq fois pour un total de dix injections (Figure 1B,C).
6. Placez le greffon vasculaire chargé de macrophages dans une plaque de 24 puits contenant 1 mL de milieu complet et incubez pendant 2 h dans un incubateur de culture cellulaire avant l’implantation.
7. Déterminer la répartition des cellules à l’intérieur de la paroi du greffon. Intégrez le greffon vasculaire chargé de macrophages dans un composé de tomographie par cohérence optique (OCT) pour la cryosection. Colorer les noyaux cellulaires avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et observer au microscope à fluorescence.

3. Modèle d’implantation de l’artère carotide de souris

REMARQUE : Maintenez une zone chirurgicale stérile pour les procédures animales. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux et les produits jetables avant l’opération.

1. Sélectionnez trois souris mâles C57BL/6 en bonne santé, pesant chacune de 25 à 30 g. Faites jeûner les souris la veille de l’opération. Implanter une greffe vasculaire chez chaque animal, pour un total de trois greffons.
2. Construire des brassards à partir d’un tube en nylon (figure 2A) et présenter le schéma de la technique du brassard vasculaire à la figure 2B.
3. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à une concentration de 50 mg/kg (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Confirmez l’efficacité de l’anesthésie en assurant la relaxation musculaire et même la respiration. Appliquez une pommade ophtalmique à base de vaseline sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.
4. Placez la souris en position couchée sur la table d’opération et retirez les poils du cou. Stérilisez la zone chirurgicale avec de l’iodophore. Couvrez la zone non chirurgicale avec de la gaze stérile pour maintenir un environnement stérile (figure 3A).
5. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, faites une incision médiane (de 1,5 à 2 cm de longueur) de la mandibule au sternum. Élevez les glandes salivaires gauches et excisez le muscle cléido-mastoïdien gauche pour augmenter le champ de vision chirurgical. Exposez l’artère carotide commune gauche à l’aide d’une micropince à épiler (figure 3B).
6. Isolez l’artère carotide gauche à l’aide d’une micropince (Figure 3C).
7. Lister l’artère carotide à deux endroits dans la partie médiane à l’aide d’une suture 9-0. Transectez l’artère entre les deux ligatures à l’aide de microciseaux. Passez le brassard dans les artères à chaque extrémité et fixez l’artère et le brassard ensemble à l’aide de clips artériels (figure 3D).
8. Tournez l’artère vers l’extérieur pour couvrir le corps du brassard et fixez-la au brassard à l’aide d’une suture 9-0 avec une micropince (Figure 3E).
9. Implantez un greffon vasculaire entre les deux extrémités de l’artère carotide en glissant les extrémités du greffon sur le brassard de l’artère et en les fixant avec des sutures 9-0 (Figure 3F).
   REMARQUE : Les données dimensionnelles du ballonnet, de l’artère carotide et de la greffe vasculaire sont présentées dans le tableau 3. Bien que les diamètres du greffon et du ballonnet correspondent étroitement à ceux des artères carotides de souris, il existe un décalage entre le diamètre de la lumière anastomotique et le diamètre du greffon. Le diamètre de la lumière anastomotique est calculé en soustrayant deux fois l’épaisseur de la paroi de l’artère carotide (0,1 mm) du diamètre intérieur du brassard (0,5 mm), ce qui donne un diamètre de lumière de 0,3 mm. Le greffon vasculaire a un diamètre intérieur de 0,7 mm, ce qui entraîne une discordance d’environ 2,3 fois (0,7 mm / 0,3 mm = 2,3).
10. Retirez les clips artériels aux deux extrémités et irriguez le site d’implantation avec une solution saline. Évaluer la perméabilité du greffon vasculaire en observant la pulsation artérielle distale (Figure 3G).
11. Repositionnez la glande salivaire gauche et fermez le site chirurgical à l’aide de sutures 6-0 (Figure 3H).

4. Soins et analyse post-opératoires

1. Transférez la souris dans un incubateur à 37 °C et surveillez en permanence ses signes vitaux jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience.
2. Injecter 5 mg/kg de carbinol pour soulager la douleur postopératoire.
3. Surveillez la souris pendant la période de récupération et ne la renvoyez pas dans un logement de groupe tant qu’elle n’est pas complètement rétablie.
4. Anesthésier les souris un mois après l’implantation et prélever les échantillons de greffon vasculaire pour une analyse histologique⁹.
5. Effectuer l’euthanasie par asphyxie au CO₂ suivie d’une luxation cervicale selon les directives éthiques.

Résultats

Des greffons vasculaires de petit diamètre avec différents paramètres ont été préparés avec succès par électrofilage. Les images MEB ont révélé que les fibres étaient uniformément réparties et présentaient une disposition irrégulière à l’intérieur de la paroi du greffon, avec la présence de structures poreuses (Figure 4). Au fur et à mesure que la concentration de PCL augmentait, le diamètre de la fibre et la taille des pore...

Discussion

L’utilisation de la technique du brassard pour l’implantation de greffes vasculaires issues de l’ingénierie tissulaire dans l’artère carotide de la souris représente une avancée significative dans la recherche cardiovasculaire¹⁵. Les étapes critiques de cette technique comprennent l’ensemencement cellulaire et l’implantation de greffons. Cette étude a utilisé une approche d’adsorption par perfusion pour améliorer la densité d’ensemencement...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin-streptomycin	Solarbio	P1400
10% fetal bovine serum	Gibco	A5256701
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	SouthernBiotech	0100-20
Alcohol	Tianjin Chemical Reaggent Company	1083
Anti-Mouse CD31 primary antibody	BD Bioscience	553370
Arterial clips	RWD Life Science	R31005-06
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11966025
Electrostatic spinning machine	Yunfan Technology	DP30
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 555)	Invitrogen	A-21434
Hematoxylin and eosin (H&E)	Solarbio	G1120
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	McClean	H811026
Iodophor	LIRCON	V273068
Microscissors	World Precision Instruments	14124
Microtweezers	World Precision Instruments	500338
Normal goat serum	Boster	AR0009
Normal saline	Cisen Pharmaceutical company	H20113369
Nylon tube for cuff	Portex
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakara	4583
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Solarbio	P1003
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn = 80,000)	Sigma	704067
RAW264.7 macrophages	Biyuntian Biotechnology
Scanning electron microscope (SEM)	Zeiss	PHENOM-XL-G2
Surgical sutures 6-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	220919
Surgical sutures 9-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	221006
Syringe	Changqiang Medical Devices	0197
Tensile testing machine	Instron	WDW-5D