カフ法 による マウス頸動脈への組織改変血管移植片の移植

要約

ここでは、カフ技術を使用してマウス頸動脈に組織工学的血管移植片を移植するためのプロトコルが提示され、血管組織再生メカニズムを調査するための適切な動物モデルが提供されます。

要約

小径血管グラフトの開発は世界的な取り組みであり、この分野には多数の研究グループが貢献しています。動物実験は、特に臨床応用がない場合に、血管移植片の有効性と安全性を評価する上で極めて重要な役割を果たします。他の動物モデルと比較して、マウス移植モデルには、明確に定義された遺伝的背景、疾患モデル構築のための成熟した方法、簡単な外科的処置など、いくつかの利点があります。これらの利点に基づいて、本研究では、マウス頸動脈に組織改変された血管移植片を移植するための簡単なカフ技術を考案しました。この技術は、静電紡糸 による ポリカプロラクトン(PCL)小径血管移植片の作製から始まり、続いて灌流吸着による移植片へのマクロファージの播種が始まりました。その後、細胞化した組織改変血管移植片をカフ技術を用いてマウス頸動脈に移植し、開存性と再生能力を評価しました。 30日間のin vivo 移植後、血管の開存性は満足のいくものであることが判明し、新組織再生と移植片の内腔内に内皮層が形成されたという証拠が示されました。すべてのデータは、統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用して分析されました。本研究は、血管再生の細胞源や活性物質の作用機序の探索に利用できるマウス頸動脈移植モデルの確立に成功しました。さらに、新しい小径血管グラフトの開発を理論的に支持します。

概要

心血管疾患の有病率と死亡率は世界的に増加しており、公衆衛生上の重大な懸念事項となっています¹。血管バイパス移植は、重度の冠状動脈性心疾患および末梢血管疾患に対する効果的な介入です²。直径が6mmを超える人工血管グラフトの使用は、臨床現場で十分に文書化されています。逆に、直径が6mm未満の人は血栓症や内膜過形成を起こしやすく、再狭窄のリスクがかなり高くなる可能性があります³。近年、小径血管移植片の研究開発は大きく進歩しており、いくつかの製品が臨床応用に近づいていますが、複数の課題が残っています^4,5。これには、長期開存率が比較的低いこと、血管再生が限られていること、再生メカニズムの理解が不十分であることなどが含まれます。

新規小径血管移植片の前臨床評価は、さまざまな動物モデルでのin vivo移植に依存しています。最も一般的に使用されるモデルには、ヒツジ頸動脈、イヌ大腿動脈、ウサギ頸動脈、およびラット腹部動脈移植モデル6,7,8,9が含まれます。血管移植片の開存性は、羊、豚、犬などの中型から大型の動物で評価できます。ただし、これらの研究には、必要な専門知識と設備のためにかなりの費用がかかります。さらに、その技術的な複雑さは、実装に課題をもたらします。対照的に、ウサギやラットなどの小動物モデルには、明確に定義された遺伝的背景を持つ確立されたトランスジェニック種が欠けており、血管再生メカニズムの研究において大きな障害となっています。

前述の動物モデルと比較して、マウスモデルは比較的簡単な外科的処置、遺伝子操作マウスを生成するための確立された方法論、および明確に定義された遺伝的背景を提供します。しかし、マウスの血管の直径が小さいため、血管移植におけるエンドツーエンドの吻合は技術的に複雑になり、かなりの専門知識が必要で、成功率は比較的低くなります。手技の複雑さを軽減し、血管移植の成功率を向上させるために、本研究ではマウス頸動脈移植モデルにカフ技術を採用しました。

in vivo移植後、血管移植片は血管組織の再生に寄与する内因性細胞を動員できます。これらの細胞の存在は、移植片の平滑筋層の内皮化および再生を促進する。¹⁰.しかし、血管組織の再生に関与する細胞の起源と種類は不明のままであり、複数の競合する理論が調査中です¹¹。これらの中で、研究は炎症細胞と幹細胞の役割に焦点を当てています。Breuerらは、ヒト骨髄由来単球(hBMC)を血管移植片に播種し、播種された細胞が単球化学誘引性タンパク質-1(MCP-1)の放出を介して宿主細胞を移植片壁に動員し、それによって血管組織の再生を促進することを発見しました¹²。本研究では、効率的な灌流吸着細胞播種法を提案し、ポリカプロラクトン(PCL)小径血管移植片にマクロファージを播種することに成功しました。着床後、これらの細胞は持続的な生存率を示しました。

この記事では、カフ技術を使用したマウスの組織工学的血管移植片の調製方法と頸動脈移植手順について詳しく説明します。このプロセスは、静電紡糸 による 定義されたパラメータを持つPCL小径血管グラフトの作製から始まります。その後、移植に適していると判断された移植片は、機械的試験を受けます。次に、マクロファージを灌流吸着法を使用して血管移植片に播種します。最後に、マクロファージを播種した血管移植片をカフ法を用いてマウス頸動脈に移植し、 in vivo 移植の1か月後に開存性と再生特性を解析します。

この技術は、マウスモデルにおける血管移植の有効性と成功率を高める可能性を秘めています。さらに、このモデルを使用して、血管再生における細胞源、重要な遺伝子、および活性因子の根底にあるメカニズムを調べることができ、新しい小径血管移植片の機能修飾と開発に理論的および方法論的なサポートを提供します。

プロトコル

すべての動物実験は、中国医学院放射線医学研究所の動物実験倫理委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに準拠していました。この研究では、体重25〜30 gの6〜8週齢の雄C57BL / 6マウスを使用しました。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 小径血管グラフトの作製

注:エレクトロスピニング技術を使用して小径PCL血管移植片を作製^します13。

1. ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)中のPCL溶液を10%、15%、および20%(w / v)で室温(RT)で12時間調製します。
2. PCL溶液を10 mLシリンジにロードし、21 Gのステンレス製ニードルでシリンジを位置決めします。
3. タングステン鋼製のマンドレル(直径0.7 mm、長さ20 cm)を収集装置に置きます。
4. エレクトロスピニング技術を使用して、PCL血管移植片の9つのグループを作製します。高容量を接続しますtage電源を針に。内径0.7mmのタングステン鋼棒を針の前の一定の距離で受信装置として配置します。
   注:血管移植片群の説明は 表1に記載されており、血管移植片のパラメータは 表2に詳述されています。
5. 作製した血管移植片を避難プロセスにかけます。血管移植片を真空乾燥オーブンに72時間置き、残留溶媒を除去します。
6. 移植片を医療用アルコールに30分間浸し、一晩紫外線にさらして滅菌します。
7. 走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、血管移植片の顕微鏡的形態を観察します。血管移植片を導電性接着剤でSEM試料ステージに取り付け、金スパッタリング装置に入れてコーティングします。
   1. SEMを用いて、15kVの加速電圧で血管移植片の構造と繊維形態を観察します。ImageJソフトウェアを使用して、SEM画像(n = 5)から繊維径と細孔径を測定します。
8. 引張試験機を使用して、血管グラフトの機械的特性(引張特性と弾性特性)を評価します。血管移植片の上端と下端を、1cm間隔で固定されたクランプでクランプします。
   1. 血管移植片を破裂するまで10 mm / minの速度で伸ばします。.引張試験機から応力-ひずみ曲線を収集します。
   2. 最大荷重(2-15 N)、破断時応力(5-30 MPa)、破断時ひずみ(200%-1500%)、弾性率(1-20 MPa)¹⁴などの機械的パラメータを計算します。
9. 統計ソフトウェアとグラフ作成ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。データを平均±標準偏差として表します。一元配置分散分析(ANOVA)でテューキーのポストホック検定を使用して、複数のグループ間の単変量差を解析および比較します。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。

2. 血管移植片へのマクロファージの播種

注:すべての溶液と材料が無菌であることを確認してください。すべての操作は細胞培養室内で行います。

1. RAW264.7(マウス単球マクロファージ)を付着条件下でフラスコで培養します(図1A)。1%ペニシリン-ストレプトマイシンと10%ウシ胎児血清を添加した完全なダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)を使用して細胞培養培地を調製します。フラスコを5%の二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーターに入れます。
2. 細胞スクレーパーを使用してマクロファージを収集します。1mLピペットで培地を捨て、PBSで細胞を洗浄します。
   1. 2 mLの新鮮な培地を培養フラスコに加え、セルスクレーパーで表面をやさしくこすります。採取した細胞をチューブに移し、1,000 x g で室温で5分間遠心分離します。5細胞×10^6細胞を 100 μLの完全培地に再懸濁します。
3. DMEMを充填した15 mLチューブにPCL血管グラフト(長さ1 cm)を入れ、4,000 x g で5分間遠心分離します。グラフトがチューブの底に沈むまでこのプロセスを数回繰り返し、DMEMによる材料の完全浸透を確保します。
4. 濾紙を敷き詰めた10cmのシャーレを用意します。湿らせたPCL血管グラフトを濾紙に置き、転がして余分な媒体を取り除きます。
5. 10 μLのピペットを使用して10 μLの細胞懸濁液を採取し、血管移植片の一端に注入します。血管グラフトを濾紙上で回転させて、懸濁液の均一な分布を促進します。各端を5回注入し、合計10回の注入を行います(図1B、C)。
6. マクロファージをロードした血管移植片を、1 mLの完全培地を含む24ウェルプレートに入れ、細胞培養インキュベーターで2時間インキュベートしてから移植します。
7. グラフト壁内の細胞の分布を決定します。マクロファージをロードした血管移植片を光干渉断層撮影法(OCT)化合物に埋め込み、凍結切片化を行います。細胞核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール(DAPI)で染色し、蛍光顕微鏡で観察します。

3. マウス頸動脈移植モデル

注:動物の処置のために無菌の手術エリアを維持してください。手術前に、すべての手術器具と使い捨て器具を滅菌してください。

1. 健康な雄のC57BL/6マウスを3匹選択し、それぞれの体重は25〜30gです。手術の前日にマウスを絶食します。各動物に1つの血管移植片を移植し、合計3つの移植片を移植します。
2. ナイロンチューブからカフを作成し(図2A)、 図2Bの血管カフ技術の概略図を示します。
3. ペントバルビタールナトリウムを 50 mg/kg の濃度で腹腔内注射することによりマウスに麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。筋肉の弛緩と呼吸を確保することにより、効果的な麻酔を確認します。麻酔中の乾燥を防ぐために、ワセリン眼科用軟膏を目に塗ります。.
4. マウスを手術台の仰臥位に置き、首の毛を取り除きます。ヨードフォアで手術部位を滅菌します。無菌環境を維持するために、非外科的領域を滅菌ガーゼで覆います(図3A)。
5. 眼科用ハサミを使用して、下顎骨から胸骨まで正中線切開(長さ1.5〜2 cm)を行います。左唾液腺を浮上させ、左中乳突筋を切除して手術視野を広げます。マイクロピンセットを使用して左総頸動脈を露出させます(図3B)。
6. マイクロ鉗子を使用して左頸動脈を分離します(図3C)。
7. 頸動脈を中央部の2か所に9-0縫合糸を使用して結紮します。マイクロハサミを使用して、2つの結紮糸の間の動脈を切断します。カフを両端の動脈に通し、動脈クリップを使用して動脈とカフを一緒に固定します(図3D)。
8. 動脈を外側に向け、カフ本体を覆い、マイクロ鉗子付きの9-0縫合糸を使用してカフに固定します(図3E)。
9. 頸動脈の両端の間に血管移植片を移植するには、移植片の端を動脈カフの上にスライドさせ、9-0縫合糸で固定します(図3F)。
   注:カフ、頸動脈、および血管移植片の寸法データを表3に示します。移植片とカフの直径はマウスの頸動脈の直径と密接に一致するが、吻合部の内腔の直径と移植片の直径との間には不一致が存在する。吻合部内腔径は、カフ内径(0.5mm)から頸動脈壁の厚さ(0.1mm)の2倍を差し引いて計算し、内腔径は0.3mmとなります。血管移植片の内径は0.7mmで、約2.3倍(0.7mm/0.3mm=2.3)のミスマッチが生じます。
10. 両端の動脈クリップを取り外し、生理食塩水で移植部位を洗浄します。遠位動脈の脈動を観察することにより、血管移植片の開存性を評価します(図3G)。
11. 左唾液腺の位置を変更し、6-0縫合糸を使用して手術部位を閉じます(図3H)。

4. 手続き後のケアと分析

1. マウスを37°Cのインキュベーターに移し、意識を取り戻すまでバイタルサインを継続的に監視します。
2. 術後の痛みを和らげるために5 mg / kgカルビノールを注射します。
3. 回復期間中はマウスを監視し、完全に回復するまでグループハウジングに戻さないでください。
4. 移植後1ヶ月でマウスに麻酔をかけ、組織学的解析のために血管移植片サンプルを採取する⁹。
5. CO₂ 窒息による安楽死と、それに続く倫理ガイドラインに従って子宮頸部脱臼を行います。

結果

異なるパラメータを持つ小径の血管移植片を、エレクトロスピニングにより成功裏に調製しました。SEM画像では、繊維が均一に分布し、グラフト壁内に不規則な配置を示し、細孔構造が存在することが明らかになりました(図4)。PCLの濃度が増加すると、繊維径と細孔径の両方が増加しました。各血管移植群の具体的な値を表2...

ディスカッション

マウス頸動脈に組織工学的血管移植片を移植するためのカフ技術の使用は、心血管研究における大きな進歩を表しています¹⁵。この技術の重要なステップには、細胞播種と移植片移植が含まれます。この研究では、灌流吸着アプローチを採用してマクロファージの播種密度を高め、不均一な細胞播種と細胞生存率の低下に関連する問題に対処しまし?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin-streptomycin	Solarbio	P1400
10% fetal bovine serum	Gibco	A5256701
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	SouthernBiotech	0100-20
Alcohol	Tianjin Chemical Reaggent Company	1083
Anti-Mouse CD31 primary antibody	BD Bioscience	553370
Arterial clips	RWD Life Science	R31005-06
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11966025
Electrostatic spinning machine	Yunfan Technology	DP30
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 555)	Invitrogen	A-21434
Hematoxylin and eosin (H&E)	Solarbio	G1120
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	McClean	H811026
Iodophor	LIRCON	V273068
Microscissors	World Precision Instruments	14124
Microtweezers	World Precision Instruments	500338
Normal goat serum	Boster	AR0009
Normal saline	Cisen Pharmaceutical company	H20113369
Nylon tube for cuff	Portex
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakara	4583
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Solarbio	P1003
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn = 80,000)	Sigma	704067
RAW264.7 macrophages	Biyuntian Biotechnology
Scanning electron microscope (SEM)	Zeiss	PHENOM-XL-G2
Surgical sutures 6-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	220919
Surgical sutures 9-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	221006
Syringe	Changqiang Medical Devices	0197
Tensile testing machine	Instron	WDW-5D