Fare Karotis Arterine Manşet Tekniği ile Doku Mühendisliği Yapılmış Vasküler Greft İmplantasyonu

Özet

Burada, doku mühendisliği yapılmış bir vasküler greftin manşet tekniği kullanılarak fare karotis arterine implantasyonu için bir protokol sunulmakta ve vasküler doku rejenerasyon mekanizmalarının araştırılması için uygun bir hayvan modeli sağlanmaktadır.

Özet

Küçük çaplı vasküler greftlerin geliştirilmesi, bu alana katkıda bulunan çok sayıda araştırma grubu ile küresel bir çaba olmuştur. Hayvan deneyleri, özellikle klinik uygulamaların yokluğunda, vasküler greftlerin etkinliğini ve güvenliğini değerlendirmede çok önemli bir rol oynar. Alternatif hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, fare implantasyon modeli, iyi tanımlanmış bir genetik arka plan, hastalık modeli yapımı için olgun bir yöntem ve basit bir cerrahi prosedür dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar. Bu avantajlara dayanarak, bu çalışma, fare karotis arterine doku mühendisliği yapılmış vasküler greftlerin implantasyonu için basit bir manşet tekniği geliştirmiştir. Bu teknik, elektrostatik eğirme yoluyla polikaprolakton (PCL) küçük çaplı vasküler greftlerin üretilmesi ile başladı, ardından perfüzyon adsorpsiyonu yoluyla greftler üzerine makrofajların tohumlanması ile devam etti. Daha sonra, hücreselleştirilmiş doku mühendisliği yapılmış vasküler greftler, açıklığı ve rejeneratif kabiliyeti değerlendirmek için manşet tekniği kullanılarak fare karotis arterine nakledildi. 30 günlük in vivo implantasyondan sonra, neo-doku rejenerasyonu ve greftlerin lümeni içinde bir endotel tabakasının oluşumu ile vasküler açıklığın tatmin edici olduğu bulundu. Tüm veriler istatistik ve grafik programları kullanılarak analiz edilmiştir. Bu çalışma, vasküler rejenerasyonun hücresel kaynaklarını ve aktif maddelerin etki mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilecek bir fare karotis arter implantasyon modelini başarıyla oluşturmuştur. Ayrıca, yeni küçük çaplı vasküler greftlerin geliştirilmesi için teorik destek sağlar.

Giriş

Kardiyovasküler hastalıkların prevalansı ve mortalitesi küresel olarak artmakta ve önemli bir halk sağlığı sorununu temsil etmektedir¹. Vasküler baypas greftleme, şiddetli koroner kalp hastalığı ve periferik vasküler hastalık için etkili bir müdahaledir². Çapları 6 mm'yi aşan yapay vasküler greftlerin kullanımı klinik ortamlarda iyi belgelenmiştir. Tersine, çapı 6 mm'nin altında olanlar tromboz ve intimal hiperplaziye eğilimlidir ve bu da önemli bir restenoz riskine yol açabilir³. Son yıllarda küçük çaplı vasküler greftlerin araştırılması ve geliştirilmesindeki önemli ilerlemelere rağmen, birçok ürünün klinik uygulamaya yaklaşmasıyla birlikte, birçok zorluk devam etmektedir ^4,5. Bunlar, nispeten düşük bir uzun vadeli açıklık oranı, sınırlı vasküler rejenerasyon ve rejenerasyon mekanizmasının yetersiz anlaşılmasını içerir.

Yeni küçük çaplı vasküler greftlerin klinik öncesi değerlendirmesi, çeşitli hayvan modellerinde in vivo implantasyona dayanır. En sık kullanılan modeller arasında koyun karotis arteri, köpek femoral arteri, tavşan karotis arteri ve sıçan abdominal arter implantasyon modelleri^{bulunur 6,7,8,9}. Vasküler greftlerin açıklığı koyun, domuz ve köpek gibi orta ila büyük boy hayvanlarda değerlendirilebilir. Ancak bu çalışmalar, gereken uzmanlık ve ekipman nedeniyle önemli maliyetler içermektedir. Ek olarak, teknik karmaşıklıkları uygulama için bir zorluk teşkil etmektedir. Buna karşılık, tavşanlar ve sıçanlar gibi küçük hayvan modelleri, açıkça tanımlanmış genetik geçmişlere sahip iyi kurulmuş transgenik türlerden yoksundur ve bu da vasküler rejenerasyon mekanizmalarının incelenmesinde önemli bir engel teşkil eder.

Yukarıda bahsedilen hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, fare modeli nispeten basit bir cerrahi prosedür, genetik olarak tasarlanmış fareler üretmek için iyi kurulmuş bir metodoloji ve açıkça tanımlanmış bir genetik arka plan sunar. Bununla birlikte, fare kan damarlarının küçük çapı, vasküler greftlemede uçtan uca anastomozu teknik olarak karmaşık hale getirir, önemli uzmanlık gerektirir ve nispeten düşük bir başarı oranı sağlar. Prosedürün karmaşıklığını azaltmak ve vasküler greft implantasyonunun başarı oranını artırmak için, bu çalışmada bir fare karotis arter implantasyon modelinde manşet tekniği kullanılmıştır.

İn vivo implantasyonu takiben, vasküler greftler, vasküler doku yenilenmesine katkıda bulunan endojen hücreleri işe alabilir. Bu hücrelerin varlığı, greftlerin düz kas tabakasının endotelizasyonunu ve rejenerasyonunu kolaylaştırır. ¹⁰. Bununla birlikte, vasküler doku rejenerasyonunda yer alan hücrelerin kaynağı ve türü belirsizliğini korumaktadır ve çok sayıda rakip teori araştırılmaktadır¹¹. Bunlar arasında araştırmalar, enflamatuar ve kök hücrelerin rollerine odaklanmıştır. Breuer ve ark. insan kemik iliğinden türetilmiş monositleri (hBMC'ler) vasküler greftler üzerine tohumladı ve tohumlanan hücrelerin, monosit kemoatraktan protein-1'in (MCP-1) salınması yoluyla konakçı hücreleri greft duvarına aldığını ve böylece vasküler doku rejenerasyonunu desteklediğini buldu¹². Bu çalışmada, makrofajları polikaprolakton (PCL) küçük çaplı vasküler greftler üzerine tohumlamak için etkili bir perfüzyon adsorpsiyon hücre tohumlama yöntemi önerilmiş ve başarıyla kullanılmıştır. İmplantasyonu takiben, bu hücreler sürekli canlılık sergiledi.

Bu makale, doku mühendisliği yapılmış vasküler greftlerin hazırlanması için metodolojiyi ve manşet tekniği kullanılarak farelerde karotis arter implantasyon prosedürünü detaylandırmaktadır. Proses, elektrostatik eğirme yoluyla tanımlanmış parametrelere sahip PCL küçük çaplı vasküler greftlerin üretilmesiyle başlar. Daha sonra implantasyon için uygun görülen greftler mekanik testlere tabi tutulur. Makrofajlar daha sonra perfüzyon adsorpsiyon yöntemi kullanılarak vasküler greftler üzerine ekilir. Son olarak, makrofaj tohumlu vasküler greftler, manşet tekniği kullanılarak fare karotis arterine implante edilir ve bir aylık in vivo implantasyondan sonra açıklık ve rejeneratif özellikler analiz edilir.

Bu teknik, fare modellerinde vasküler greftlemenin etkinliğini ve başarı oranlarını artırma potansiyeline sahiptir. Ayrıca model, yeni küçük çaplı vasküler greftlerin fonksiyonel modifikasyonu ve geliştirilmesi için teorik ve metodolojik destek sağlayarak, vasküler rejenerasyonda hücre kaynaklarının, pivotal genlerin ve aktif faktörlerin altında yatan mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Çin Tıp Bilimleri Akademisi Radyasyon Tıbbı Enstitüsü Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun hale getirildi. Bu çalışmada vücut ağırlığı 25-30 g olan 6-8 haftalık erkek C57BL/6 fareler kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Küçük çaplı vasküler greftlerin imalatı

NOT: Elektrospinning tekniğini kullanarak küçük çaplı PCL vasküler greftler^{üretin 13}.

1. 12 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) heksafloroizopropanol (HFIP) içinde %10, %15 ve %20 (a/h) PCL çözeltileri hazırlayın.
2. PCL solüsyonlarını 10 mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı 21 G paslanmaz çelik iğne ile konumlandırın.
3. Toplama aletinin üzerine tungsten çelik bir mandrel (0,7 mm çapında, 20 cm uzunluğunda) yerleştirin.
4. Elektrospinning tekniğini kullanarak dokuz grup PCL vasküler greft üretin. İğneye yüksek voltajlı bir güç kaynağı bağlayın. İç çapı 0,7 mm olan bir tungsten çelik çubuğu, iğnenin önüne sabit bir mesafede alıcı cihaz olarak yerleştirin.
   NOT: Vasküler greft gruplarının tanımı Tablo 1'de verilmiştir ve vasküler greftlerin parametreleri Tablo 2'de detaylandırılmıştır.
5. Üretilen vasküler greftleri bir tahliye işlemine tabi tutun. Kalan çözücüleri çıkarmak için vasküler greftleri 72 saat vakumlu kurutma fırınına koyun.
6. Greftleri 30 dakika boyunca tıbbi alkole batırarak ve gece boyunca UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin.
7. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak vasküler greftlerin mikroskobik morfolojisini gözlemleyin. Vasküler greftleri iletken yapıştırıcı ile SEM numune aşamasına tutturun ve kaplama için altın püskürtme cihazına yerleştirin.
   1. 15 kV'luk hızlandırıcı bir voltajda SEM kullanarak vasküler greftlerin yapısını ve lif morfolojisini gözlemleyin. ImageJ yazılımını kullanarak SEM görüntülerinden (n = 5) lif çapını ve gözenek boyutunu ölçün.
8. Bir çekme test makinesi kullanarak vasküler greftlerin mekanik özelliklerini (çekme ve elastik özellikler) değerlendirin. Vasküler greftin üst ve alt uçlarını 1 cm aralıklı sabit kelepçelerle kelepçeleyin.
   1. Vasküler grefti yırtılana kadar 10 mm / dak hızında gerin. Çekme test makinesinden gerilim-gerinim eğrisini toplayın.
   2. Maksimum yük (2-15 N), kopma gerilimi (5-30 MPa), kopma gerilimi (%200-%1500) ve elastik modül (1-20 MPa) dahil olmak üzere mekanik parametreleri ^{hesaplayın14}.
9. İstatistik ve grafik yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın. Verileri ortalama ± standart sapma olarak ifade edin. Tek yönlü ANOVA'da Tukey'in post hoc testini kullanarak birden fazla grup arasındaki tek değişkenli farkları analiz edin ve karşılaştırın. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

2. Makrofajların vasküler greftler üzerine ekilmesi

NOT: Tüm solüsyonların ve malzemelerin steril olduğundan emin olun. Tüm işlemleri hücre kültürü odası içinde gerçekleştirin.

1. Yapışık koşullar altında şişelerde kültür RAW264.7 (fare monosit makrofajı) (Şekil 1A). % 1 penisilin-streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamını (DMEM) kullanarak hücre kültürü ortamını hazırlayın. Şişeleri %5 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
2. Bir hücre kazıyıcı kullanarak makrofajları toplayın. Ortamı 1 mL'lik bir pipet kullanarak atın ve hücreleri PBS ile yıkayın.
   1. Kültür şişesine 2 mL taze ortam ekleyin ve yüzeyi bir hücre sıyırıcı ile nazikçe kazıyın. Toplanan hücreleri bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. 100 μL tam ortamda 5 ×^{10 6} hücreyi yeniden süspanse edin.
3. DMEM ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe bir PCL vasküler greft (1 cm uzunluğunda) yerleştirin ve 5 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin. Greft tüpün dibine batana kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın ve malzemenin DMEM ile tamamen sızmasını sağlayın.
4. Bir kat filtre kağıdı ile kaplanmış 10 cm'lik bir Petri kabı hazırlayın. Nemlendirilmiş PCL vasküler grefti filtre kağıdına yerleştirin ve fazla ortamı çıkarmak için yuvarlayın.
5. 10 μL'lik bir pipet kullanarak 10 μL hücre süspansiyonu alın ve vasküler greftin bir ucuna enjekte edin. Süspansiyonun eşit dağılımını kolaylaştırmak için vasküler grefti filtre kağıdı üzerinde döndürün. Toplam on enjeksiyon için her bir ucu beş kez enjekte edin (Şekil 1B, C).
6. Makrofaj yüklü vasküler grefti 1 mL tam ortam içeren 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve implantasyondan önce bir hücre kültürü inkübatöründe 2 saat inkübe edin.
7. Greft duvarı içindeki hücrelerin dağılımını belirleyin. Makrofaj yüklü vasküler grefti kriyoseksiyon için optik koherens tomografi (OCT) bileşiğine yerleştirin. Hücre çekirdeklerini 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyayın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin.

3. Fare karotis arter implantasyon modeli

NOT: Hayvan prosedürleri için steril bir cerrahi alan sağlayın. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri ve tek kullanımlık malzemeleri sterilize edin.

1. Her biri 25-30 g ağırlığında üç sağlıklı erkek C57BL/6 fare seçin. Ameliyattan bir gün önce fareleri oruç tutun. Toplam üç greft için her hayvana bir vasküler greft implante edin.
2. Naylon bir tüpten manşetler oluşturun (Şekil 2A) ve vasküler manşet tekniğinin şematik diyagramını Şekil 2B'de sunun.
3. 50 mg / kg'lık bir konsantrasyonda intraperitoneal sodyum pentobarbital enjeksiyonu ile fareleri uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Kas gevşemesini ve hatta nefes almayı sağlayarak etkili anesteziyi onaylayın. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için gözlere vazelin oftalmik merhem sürün.
4. Fareyi ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda getirin ve boyun kıllarını alın. Cerrahi bölgeyi iyodofor ile sterilize edin. Steril bir ortam sağlamak için cerrahi olmayan alanı steril gazlı bezle örtün (Şekil 3A).
5. Mandibuladan sternuma orta hat insizyonu (1.5-2 cm uzunluğunda) yapmak için oftalmik makas kullanın. Cerrahi görüş alanını artırmak için sol tükürük bezlerini yükseltin ve sol kleidomastoid kası çıkarın. Mikro cımbız kullanarak sol ana karotis arteri açığa çıkarın (Şekil 3B).
6. Sol karotis arteri mikroforseps kullanarak izole edin (Şekil 3C).
7. Karotis arteri 9-0 sütür kullanarak orta kısımda iki yerde bağlayın. Mikromakas kullanarak arteri iki bağ arasında geçirin. Kafı her iki uçtaki arterlerden geçirin ve arteri ve manşeti arteriyel klipsler kullanarak birbirine sabitleyin (Şekil 3D).
8. Manşet gövdesini örtmek için arteri dışa doğru çevirin ve mikroforseps ile 9-0 sütür kullanarak manşete sabitleyin (Şekil 3E).
9. Karotis arterin iki ucu arasına, greft uçlarını arter manşetinin üzerine kaydırarak ve 9-0 dikişle sabitleyerek bir vasküler greft implante edin (Şekil 3F).
   NOT: Manşet, karotis arter ve vasküler greftin boyutsal verileri Tablo 3'te sunulmuştur. Greft ve manşetin çapları fare karotis arterlerininkilerle yakından eşleşse de, anastomoz lümen çapı ile greft çapı arasında bir uyumsuzluk vardır. Anastomoz lümen çapı, manşetin iç çapından (0,5 mm) karotis arter duvarının kalınlığının (0,1 mm) iki katı çıkarılarak hesaplanır ve bu da 0,3 mm'lik bir lümen çapı ile sonuçlanır. Vasküler greftin iç çapı 0,7 mm'dir ve yaklaşık 2,3 kat uyumsuzluğa yol açar (0,7 mm / 0,3 mm = 2,3).
10. Her iki uçtaki arteriyel klipsleri çıkarın ve implantasyon bölgesini tuzlu su ile yıkayın. Distal arteriyel nabzı gözlemleyerek vasküler greftin açıklığını değerlendirin (Şekil 3G).
11. Sol tükürük bezini yeniden konumlandırın ve cerrahi bölgeyi 6-0 sütür kullanarak kapatın (Şekil 3H).

4. İşlem sonrası bakım ve analiz

1. Fareyi 37 °C'lik bir kuvöze aktarın ve bilinci yerine gelene kadar yaşamsal belirtilerini sürekli olarak izleyin.
2. Ameliyat sonrası ağrıyı gidermek için 5 mg / kg karbinol enjekte edin.
3. Kurtarma süresi boyunca fareyi izleyin ve tamamen iyileşene kadar grup muhafazasına geri koymayın.
4. İmplantasyondan bir ay sonra fareleri uyuşturun ve histolojik analiz için vasküler greft örneklerini toplayın⁹.
5. CO₂ boğulması yoluyla ötenazi gerçekleştirin ve ardından etik yönergeleri izleyerek servikal çıkık yapın.

Sonuçlar

Farklı parametrelere sahip küçük çaplı vasküler greftler elektrospinning ile başarılı bir şekilde hazırlandı. SEM görüntüleri, liflerin homojen bir şekilde dağıldığını ve gözenek yapılarının varlığı ile greft duvarı içinde düzensiz bir düzenleme sergilediğini ortaya koydu (Şekil 4). PCL konsantrasyonu arttıkça, hem lif çapı hem de gözenek boyutu arttı. Her vasküler greft grubu için spesifik değerler

Tartışmalar

Fare karotis arterine doku mühendisliği yapılmış vasküler greftlerin implante edilmesi için manşet tekniğinin kullanılması, kardiyovasküler araştırmalarda önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir¹⁵. Bu tekniğin kritik adımları arasında hücre tohumlama ve greft implantasyonu yer alır. Bu çalışma, üniform olmayan hücre tohumlaması ve düşük hücre canlılığı ile ilgili sorunları ele almak için makrofaj tohumlama yoğunluğunu artırm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin-streptomycin	Solarbio	P1400
10% fetal bovine serum	Gibco	A5256701
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	SouthernBiotech	0100-20
Alcohol	Tianjin Chemical Reaggent Company	1083
Anti-Mouse CD31 primary antibody	BD Bioscience	553370
Arterial clips	RWD Life Science	R31005-06
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11966025
Electrostatic spinning machine	Yunfan Technology	DP30
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 555)	Invitrogen	A-21434
Hematoxylin and eosin (H&E)	Solarbio	G1120
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	McClean	H811026
Iodophor	LIRCON	V273068
Microscissors	World Precision Instruments	14124
Microtweezers	World Precision Instruments	500338
Normal goat serum	Boster	AR0009
Normal saline	Cisen Pharmaceutical company	H20113369
Nylon tube for cuff	Portex
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakara	4583
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Solarbio	P1003
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn = 80,000)	Sigma	704067
RAW264.7 macrophages	Biyuntian Biotechnology
Scanning electron microscope (SEM)	Zeiss	PHENOM-XL-G2
Surgical sutures 6-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	220919
Surgical sutures 9-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	221006
Syringe	Changqiang Medical Devices	0197
Tensile testing machine	Instron	WDW-5D