השתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת שרוול

Summary

כאן, מוצג פרוטוקול להשתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת השרוול, המספק מודל בעל חיים מתאים לחקירת מנגנוני התחדשות רקמות כלי הדם.

Abstract

פיתוח שתלי כלי דם בקוטר קטן היה מאמץ עולמי, עם קבוצות מחקר רבות התורמות לתחום זה. ניסויים בבעלי חיים ממלאים תפקיד מרכזי בהערכת היעילות והבטיחות של שתלים בכלי דם, במיוחד בהיעדר יישומים קליניים. בהשוואה למודלים חלופיים של בעלי חיים, מודל השתלת העכברים מציע מספר יתרונות, כולל רקע גנטי מוגדר היטב, שיטה בוגרת לבניית מודל מחלה והליך כירורגי פשוט. בהתבסס על יתרונות אלה, המחקר הנוכחי המציא טכניקת שרוול פשוטה להשתלת שתלי כלי דם מהונדסים רקמות בעורק הצוואר של העכבר. טכניקה זו החלה בייצור שתלי כלי דם בקוטר קטן של פוליקפרולקטון (PCL) באמצעות ספינינג אלקטרוסטטי, ולאחר מכן זריעה של מקרופאגים על השתלים באמצעות ספיחת זלוף. לאחר מכן, שתלי כלי הדם המהונדסים ברקמות תאיות הושתלו בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת השרוול כדי להעריך את הסבלנות ויכולת ההתחדשות. לאחר 30 יום של השתלה in vivo , הסבלנות של כלי הדם נמצאה משביעת רצון, עם עדות להתחדשות רקמות ניאו והיווצרות שכבת אנדותל בתוך לומן השתלים. כל הנתונים נותחו באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות. מחקר זה ביסס בהצלחה מודל השתלת עורק הצוואר של עכבר שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המקורות התאיים של התחדשות כלי הדם ואת מנגנוני הפעולה של חומרים פעילים. יתר על כן, הוא מספק תמיכה תיאורטית לפיתוח שתלי כלי דם חדשים בקוטר קטן.

Introduction

השכיחות והתמותה של מחלות לב וכלי דם עולות ברחבי העולם, ומייצגות דאגה משמעותית לבריאות הציבור¹. השתלת מעקף כלי דם היא התערבות יעילה למחלת לב כלילית חמורה ומחלת כלי דם היקפיים². השימוש בשתלי כלי דם מלאכותיים בקוטר העולה על 6 מ"מ תועד היטב במסגרות קליניות. לעומת זאת, בעלי קוטר מתחת ל -6 מ"מ נוטים לפקקת והיפרפלזיה אינטימית, מה שעלול להוביל לסיכון ניכר לרסטנוזיס³. למרות התקדמות משמעותית במחקר ופיתוח של שתלי כלי דם בקוטר קטן בשנים האחרונות, עם מספר מוצרים המתקרבים ליישום קליני, נותרו אתגרים מרובים ^4,5. אלה כוללים שיעור סבלנות נמוך יחסית לטווח ארוך, התחדשות כלי דם מוגבלת והבנה לא מספקת של מנגנון ההתחדשות.

הערכה פרה-קלינית של שתלי כלי דם חדשים בקוטר קטן מסתמכת על השתלה in vivo במודלים שונים של בעלי חיים. המודלים הנפוצים ביותר כוללים את עורק הצוואר של הכבשים, עורק הירך של הכלב, עורק הצוואר של הארנב ודגמי השתלת עורק הבטן של חולדות 6,7,8,9. ניתן להעריך את הסבלנות של שתלי כלי דם בבעלי חיים בינוניים עד גדולים, כגון כבשים, חזירים וכלבים. עם זאת, מחקרים אלה כרוכים בעלויות משמעותיות בשל המומחיות והציוד הנדרשים. בנוסף, המורכבות הטכנית שלהם מציבה אתגר ליישום. לעומת זאת, במודלים של בעלי חיים קטנים כמו ארנבות וחולדות חסרים מינים טרנסגניים מבוססים היטב עם רקע גנטי מוגדר בבירור, מה שמהווה מכשול משמעותי בחקר מנגנוני התחדשות כלי הדם.

בהשוואה למודלים של בעלי חיים שהוזכרו לעיל, מודל העכבר מציע הליך כירורגי פשוט יחסית, מתודולוגיה מבוססת היטב ליצירת עכברים מהונדסים גנטית ורקע גנטי מוגדר בבירור. עם זאת, הקוטר הקטן של כלי הדם של העכברים הופך את האנסטומוזה מקצה לקצה בהשתלת כלי דם למורכבת מבחינה טכנית, הדורשת מומחיות משמעותית ומניבה אחוזי הצלחה נמוכים יחסית. כדי להפחית את מורכבות ההליך ולשפר את אחוזי ההצלחה של השתלת שתל כלי דם, המחקר הנוכחי השתמש בטכניקת השרוול במודל השתלת עורק הצוואר של עכבר.

לאחר השתלת in vivo , שתלים וסקולריים יכולים לגייס תאים אנדוגניים התורמים להתחדשות רקמות כלי הדם. נוכחותם של תאים אלה מקלה על אנדותליזציה והתחדשות של שכבת השריר החלק של השתלים. ¹⁰. עם זאת, מקור וסוג התאים המעורבים בהתחדשות רקמות כלי הדם נותרו לא ברורים, ותיאוריות מתחרות מרובות נחקרות¹¹. בין אלה, המחקר התמקד בתפקידים של תאי דלקת ותאי גזע. ברויאר ועמיתיו זרעו מונוציטים שמקורם במח עצם אנושי (hBMCs) על שתלים וסקולריים ומצאו כי התאים הזרעים גייסו תאי מארח לדופן השתל באמצעות שחרור חלבון כימואטרקנטי מונוציטי-1 (MCP-1), ובכך קידמו את התחדשות רקמת כלי הדם¹². במחקר זה, הוצעה שיטת זריעת תאים יעילה לספיחת זלוף ושימשה בהצלחה לזריעה של מקרופאגים על גבי שתלי כלי דם בקוטר קטן של פוליקפרולקטון (PCL). לאחר ההשתלה, תאים אלה הפגינו כדאיות מתמשכת.

מאמר זה מפרט את המתודולוגיה להכנת שתלי כלי דם מהונדסי רקמות ואת הליך השתלת עורק הצוואר בעכברים בטכניקת השרוול. התהליך מתחיל בייצור שתלי כלי דם בקוטר קטן PCL עם פרמטרים מוגדרים באמצעות ספינינג אלקטרוסטטי. לאחר מכן, שתלים הנחשבים מתאימים להשתלה עוברים בדיקות מכניות. לאחר מכן נזרעים מקרופאגים על שתלי כלי הדם בשיטת ספיחת הזלוף. לבסוף, שתלי כלי דם זרעי מקרופאגים מושתלים בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת השרוול, ותכונות הסבלנות וההתחדשות מנותחות לאחר חודש של השתלת in vivo .

לטכניקה זו יש פוטנציאל לשפר את היעילות ושיעורי ההצלחה של השתלת כלי דם במודלים של עכברים. יתר על כן, ניתן להשתמש במודל כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס מקורות תאים, גנים מרכזיים וגורמים פעילים בהתחדשות כלי הדם, ולספק תמיכה תיאורטית ומתודולוגית לשינוי תפקודי ופיתוח של שתלי כלי דם חדשים בקוטר קטן.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים של המכון לרפואת קרינה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה, ועמדו בהנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6, בני 6-8 שבועות, עם משקל גוף של 25-30 גרם. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור שתלים וסקולריים בקוטר קטן

הערה: לייצר שתלי כלי דם PCL בקוטר קטן בטכניקת אלקטרו-ספינינג¹³.

1. הכן תמיסות PCL ב-10%, 15% ו-20% (w/v) ב-hexafluoroisopropanol (HFIP) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 12 שעות.
2. טען את תמיסות ה-PCL למזרק של 10 מ"ל ומקם את המזרק עם מחט נירוסטה 21 גרם.
3. הניחו ציר מפלדת טונגסטן (קוטר 0.7 מ"מ, אורך 20 ס"מ) על מכשיר האיסוף.
4. לייצר תשע קבוצות של שתלי כלי דם PCL בטכניקת אלקטרו-ספינינג. חבר ספק כוח בעל מתח גבוה למחט. מקם מוט פלדת טונגסטן בקוטר פנימי של 0.7 מ"מ במרחק קבוע מול המחט כמכשיר קבלה.
   הערה: התיאור של קבוצות השתלות כלי הדם מופיע בטבלה 1, והפרמטרים של שתלי כלי הדם מפורטים בטבלה 2.
5. הכפף את שתלי כלי הדם המפוברקים לתהליך פינוי. הכניסו את השתלים לכלי הדם לתנור לייבוש ואקום למשך 72 שעות כדי להסיר שאריות ממסים.
6. עקר את השתלים על ידי טבילתם באלכוהול רפואי למשך 30 דקות וחשיפתם לאור UV למשך הלילה.
7. התבוננו במורפולוגיה המיקרוסקופית של שתלי כלי הדם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). חבר את שתלי כלי הדם לשלב דגימת ה-SEM עם דבק מוליך והנח אותם במכשיר התזת הזהב לציפוי.
   1. התבונן במבנה ובמורפולוגיה של הסיבים של שתלי כלי הדם באמצעות SEM במתח מאיץ של 15 קילו וולט. מדוד את קוטר הסיבים וגודל הנקבוביות מתמונות SEM (n = 5) באמצעות תוכנת ImageJ.
8. להעריך את התכונות המכניות (תכונות מתיחה ואלסטיות) של השתלים בכלי הדם באמצעות מכונת בדיקת מתיחה. מהדקים את הקצוות העליונים והתחתונים של שתל כלי הדם בעזרת מהדקים קבועים המרוחקים 1 ס"מ זה מזה.
   1. מותחים את שתל כלי הדם בקצב של 10 מ"מ לדקה עד לקרע. אסוף את עקומת המתח-מתח ממכונת בדיקת המתיחה.
   2. חשב פרמטרים מכניים, כולל עומס מרבי (2-15 N), מתח בהפסקה (5-30 MPa), מתח בשבירה (200%-1500%) ומודול אלסטי (1-20 MPa)¹⁴.
9. לבצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות. בטא נתונים כממוצע ± סטיית תקן. לנתח ולהשוות הבדלים חד משתנים בין מספר קבוצות באמצעות מבחן הפוסט הוק של טוקי ב-ANOVA חד-כיווני. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

2. זריעת מקרופאגים על גבי שתלים וסקולריים

הערה: ודא שכל הפתרונות והחומרים סטריליים. בצע את כל הפעולות בחדר תרבית התאים.

1. תרבית RAW264.7 (מקרופאג מונוציטים של עכבר) בצלוחיות בתנאים דביקים (איור 1A). הכן את מדיום תרבית התאים באמצעות מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי. מניחים את הצלוחיות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% פחמן דו חמצני.
2. אוספים מקרופאגים באמצעות מגרד תאים. השליכו את המדיום בעזרת פיפטה של 1 מ"ל ושטפו את התאים עם PBS.
   1. מוסיפים 2 מ"ל מדיום טרי לבקבוק התרבות ומגרדים בעדינות את פני השטח בעזרת מגרד תאים. העבירו את התאים שנאספו לצינור ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש 5 × 10⁶ תאים ב -100 מיקרוליטר של מדיום שלם.
3. הנח שתל כלי דם PCL (באורך 1 ס"מ) בצינור של 15 מ"ל מלא ב-DMEM וצנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 5 דקות. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד שהשתל שוקע לתחתית הצינור, מה שמבטיח חדירה מלאה של החומר באמצעות DMEM.
4. מכינים צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ מרופדת בשכבת נייר פילטר. הנח את שתל כלי הדם PCL הרטוב על נייר הסינון וגלגל אותו כדי להסיר עודפי מדיום.
5. קח 10 מיקרוליטר מתרחיף התא באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר והזריק אותו לקצה אחד של שתל כלי הדם. סובב את שתל כלי הדם מעל נייר הסינון כדי להקל על פיזור אחיד של המתלה. יש להזריק כל קצה חמש פעמים ובסך הכל עשר זריקות (איור 1B,C).
6. הנח את שתל כלי הדם העמוס במקרופאגים בצלחת של 24 בארות המכילה 1 מ"ל של מדיום שלם ודגר למשך שעתיים בחממת תרבית תאים לפני ההשתלה.
7. קבע את התפלגות התאים בתוך דופן השתל. הטמע את שתל כלי הדם הטעון במקרופאגים בתרכובת טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) להקפאה. צביעת גרעיני תאים עם 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) והתבוננות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

3. מודל השתלת עורק הצוואר של עכבר

הערה: שמור על אזור כירורגי סטרילי להליכים בבעלי חיים. יש לעקר את כל המכשירים והכלים החד-פעמיים לפני הניתוח.

1. בחר שלושה עכברי C57BL/6 זכרים בריאים, כל אחד במשקל 25-30 גרם. צמו את העכברים יום לפני הניתוח. השתלת שתל כלי דם אחד בכל בעל חיים, בסך הכל שלושה שתלים.
2. בנו אזיקים מצינור ניילון (איור 2A) והציגו את התרשים הסכמטי של טכניקת שרוול כלי הדם באיור 2B.
3. להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל בריכוז של 50 מ"ג/ק"ג (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). אשר הרדמה יעילה על ידי הקפדה על הרפיית שרירים ואפילו נשימה. מרחו משחת עיניים וזלין על העיניים כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה.
4. מקם את העכבר במצב שכיבה על שולחן הניתוחים והסר את שיער הצוואר. עקר את אזור הניתוח ביודופור. כסו את האזור הלא ניתוחי בגזה סטרילית כדי לשמור על סביבה סטרילית (איור 3A).
5. השתמש במספריים עיניים כדי לבצע חתך בקו האמצע (אורך 1.5-2 ס"מ) מהלסת התחתונה לעצם החזה. הרם את בלוטות הרוק השמאליות וכרת את שריר הקלידומסטואיד השמאלי כדי להגדיל את שדה הראייה הכירורגי. חשפו את עורק הצוואר המשותף השמאלי באמצעות מיקרו פינצטה (איור 3B).
6. בודדו את עורק הצוואר השמאלי באמצעות מיקרו-מלקחיים (איור 3C).
7. קשרו את עורק הצוואר בשני מיקומים בחלק האמצעי באמצעות תפר 9-0. חצו את העורק בין שתי הקשרים באמצעות מספריים. העבירו את השרוול דרך העורקים בכל קצה ואבטחו את העורק ואת השרוול יחד באמצעות קליפסים עורקיים (איור 3D).
8. סובב את העורק כלפי חוץ כדי לכסות את גוף השרוול ולהדק אותו לשרוול באמצעות תפר 9-0 עם מיקרו-מלקחיים (איור 3E).
9. השתל שתל כלי דם בין שני הקצוות של עורק הצוואר על ידי החלקת קצות השתל מעל שרוול העורק ואבטחתם עם תפרים 9-0 (איור 3F).
   הערה: הנתונים הממדיים של השרוול, עורק הצוואר ושתל כלי הדם מוצגים בטבלה 3. למרות שקוטר השתל והשרוול תואמים מאוד לאלה של עורקי הצוואר של העכבר, קיימת אי התאמה בין קוטר הלומן האנסטומוטי לקוטר השתל. קוטר הלומן האנטומוטי מחושב על ידי הפחתת פי שניים מעובי דופן עורק הצוואר (0.1 מ"מ) מהקוטר הפנימי של השרוול (0.5 מ"מ), וכתוצאה מכך קוטר לומן של 0.3 מ"מ. לשתל כלי הדם קוטר פנימי של 0.7 מ"מ, מה שמוביל לאי התאמה של כ -2.3 פעמים (0.7 מ"מ / 0.3 מ"מ = 2.3).
10. הסר את תפסי העורקים בשני הקצוות והשקה את מקום ההשתלה במי מלח. העריכו את הסבלנות של שתל כלי הדם על ידי התבוננות בפעימה העורקית הדיסטלית (איור 3G).
11. מקם מחדש את בלוטת הרוק השמאלית וסגור את אתר הניתוח באמצעות 6-0 תפרים (איור 3H).

4. טיפול וניתוח לאחר ההליך

1. העבירו את העכבר לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ועקבו באופן רציף אחר הסימנים החיוניים שלו עד שיחזור להכרה.
2. יש להזריק 5 מ"ג/ק"ג קרבינול לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.
3. עקוב אחר העכבר במהלך תקופת ההתאוששות ואל תחזיר אותו לדיור קבוצתי עד שהוא התאושש לחלוטין.
4. להרדים את העכברים חודש לאחר ההשתלה ולקצור את דגימות השתל של כלי הדם לניתוח היסטולוגי⁹.
5. בצע המתת חסד באמצעות חנק CO₂ ואחריו פריקת צוואר הרחם בהתאם להנחיות אתיות.

תוצאות

שתלים וסקולריים בקוטר קטן עם פרמטרים שונים הוכנו בהצלחה באמצעות אלקטרו-ספינינג. תמונות SEM חשפו כי הסיבים היו מפוזרים באופן אחיד והציגו סידור לא סדיר בתוך דופן השתל, עם נוכחות של מבני נקבוביות (איור 4). ככל שריכוז ה-PCL גדל, גם קוטר הסיבים וגם גודל הנקבוב?...

Discussion

השימוש בטכניקת השרוול להשתלת שתלי כלי דם מהונדסים רקמות בעורק הצוואר של העכבר מייצג התקדמות משמעותית במחקר הלב וכלי הדם¹⁵. השלבים הקריטיים של טכניקה זו כוללים זריעת תאים והשתלת שתלים. מחקר זה השתמש בגישת ספיחת זלוף כדי לשפר את צפיפות הזריעה של מקרופאגים כדי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin-streptomycin	Solarbio	P1400
10% fetal bovine serum	Gibco	A5256701
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	SouthernBiotech	0100-20
Alcohol	Tianjin Chemical Reaggent Company	1083
Anti-Mouse CD31 primary antibody	BD Bioscience	553370
Arterial clips	RWD Life Science	R31005-06
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11966025
Electrostatic spinning machine	Yunfan Technology	DP30
Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 555)	Invitrogen	A-21434
Hematoxylin and eosin (H&E)	Solarbio	G1120
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	McClean	H811026
Iodophor	LIRCON	V273068
Microscissors	World Precision Instruments	14124
Microtweezers	World Precision Instruments	500338
Normal goat serum	Boster	AR0009
Normal saline	Cisen Pharmaceutical company	H20113369
Nylon tube for cuff	Portex
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakara	4583
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Solarbio	P1003
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn = 80,000)	Sigma	704067
RAW264.7 macrophages	Biyuntian Biotechnology
Scanning electron microscope (SEM)	Zeiss	PHENOM-XL-G2
Surgical sutures 6-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	220919
Surgical sutures 9-0	Ningbo Chenghe microapparatus factory	221006
Syringe	Changqiang Medical Devices	0197
Tensile testing machine	Instron	WDW-5D